Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
* Эти авторы внесли равный вклад
В этом исследовании представлен подробный протокол для эффективного криоконсервирования пигментных эпителиальных клеток сетчатки человека, полученных из стволовых клеток сетчатки.
Клетки пигментного эпителия сетчатки (РПЭ), полученные из эмбриональных стволовых клеток человека (чэск), являются превосходными источниками клеток для клеточной заместительной терапии у лиц с дегенеративными заболеваниями сетчатки; Тем не менее, исследования по стабильному и безопасному хранению этих терапевтических клеток немногочисленны. Наиболее часто встречающимися проблемами являются сильно изменчивая жизнеспособность клеток и функциональное восстановление клеток РПЭ после криоконсервации. В настоящем протоколе мы стремились достичь наилучшей скорости восстановления клеток после размораживания путем выбора оптимальной фазы клеток для замораживания на основе исходных экспериментальных условий. Клетки замораживали в экспоненциальной фазе, определяемой с помощью анализа мечения 5-этинил-2'-дезоксиуридина, что улучшало жизнеспособность клеток и скорость восстановления после размораживания. Стабильные и функциональные клетки были получены вскоре после размораживания, независимо от длительного процесса дифференцировки. Описанные здесь методы позволяют просто, эффективно и недорого сохранять и размораживать клетки RPE, полученные из hESC. Хотя этот протокол фокусируется на клетках RPE, эта стратегия замораживания может быть применена ко многим другим типам дифференцированных клеток.
Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой пигментированный монослой клеток, необходимый для поддержания правильной функции сетчатки1. Дисфункция и смерть от РПЭ тесно связаны со многими дегенеративными заболеваниями сетчатки, включая возрастную макулярную дегенерацию, пигментный ретинит и болезнь Штаргардта 2,3. Заместительная терапия РПЭ является одной из наиболее перспективных схем лечения этих заболеваний 4,5,6,7. Стабильное поступление донорски....
1. Диссоциация клеток
Здесь клетки РПЭ, полученные из hESC, в P1D35 были пассированы и засеяны с плотностью 105/см2. В течение недели после посева характерная гексагональная морфология и пигментация были утрачены во время фазы задержки (примерно 2 дня). Клетки РПЭ постепенно переняли гексагональную морф.......
В настоящем исследовании описан успешный протокол замораживания-размораживания для клеток RPE, полученных из hESC, для исследовательских и клинических нужд. В отличие от иммортализированной клеточной линии РПЭ, ARPE-19, клетки РПЭ с соответствующими характеристиками эпителиального фенотип.......
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Эта работа была профинансирована Национальным фондом естественных наук Китая (81970816) Мэй Цзян; Национальный фонд естественных наук Китая (82201223) Синьюэ Чжу; и План действий по инновациям в области науки и техники Шанхайской комиссии по науке и технике (2014090067000) Хайюнь Лю.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
40 μm Cell strainer | Corning | 431750 | |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
Cryo freezing container | Nalgene | 5100-0001 | |
CryoStor CS10 | Biolife Solutions | 07930 | cryopreservation medium #1 |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Genxin | Selcell | YB050050 | cryopreservation medium #2 |
Human embryonic stem cells | provided by Wicell, USA | H9 cell line | |
Matrigel, hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | basement membrane matrix |
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System | BioLife Solutions | AST-601 | |
Trypan Blue solution 0.4% | Sigma | T8154 | |
TryPLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | cell dissociation reagent |
XVIVO-10 medium | Lonza | BEBP04-743Q | RPE culture medium |
Y-27632 | Selleck | S1049 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены