Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании представлен подробный протокол для эффективного криоконсервирования пигментных эпителиальных клеток сетчатки человека, полученных из стволовых клеток сетчатки.

Аннотация

Клетки пигментного эпителия сетчатки (РПЭ), полученные из эмбриональных стволовых клеток человека (чэск), являются превосходными источниками клеток для клеточной заместительной терапии у лиц с дегенеративными заболеваниями сетчатки; Тем не менее, исследования по стабильному и безопасному хранению этих терапевтических клеток немногочисленны. Наиболее часто встречающимися проблемами являются сильно изменчивая жизнеспособность клеток и функциональное восстановление клеток РПЭ после криоконсервации. В настоящем протоколе мы стремились достичь наилучшей скорости восстановления клеток после размораживания путем выбора оптимальной фазы клеток для замораживания на основе исходных экспериментальных условий. Клетки замораживали в экспоненциальной фазе, определяемой с помощью анализа мечения 5-этинил-2'-дезоксиуридина, что улучшало жизнеспособность клеток и скорость восстановления после размораживания. Стабильные и функциональные клетки были получены вскоре после размораживания, независимо от длительного процесса дифференцировки. Описанные здесь методы позволяют просто, эффективно и недорого сохранять и размораживать клетки RPE, полученные из hESC. Хотя этот протокол фокусируется на клетках RPE, эта стратегия замораживания может быть применена ко многим другим типам дифференцированных клеток.

Введение

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой пигментированный монослой клеток, необходимый для поддержания правильной функции сетчатки1. Дисфункция и смерть от РПЭ тесно связаны со многими дегенеративными заболеваниями сетчатки, включая возрастную макулярную дегенерацию, пигментный ретинит и болезнь Штаргардта 2,3. Заместительная терапия РПЭ является одной из наиболее перспективных схем лечения этих заболеваний 4,5,6,7. Стабильное поступление донорски....

протокол

1. Диссоциация клеток

  1. Поддерживайте клетки РПЭ, как описано ранее17,22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все клетки выращиваются при температуре 37 °C в атмосфере с содержаниемCO2 5% в течение всего срока действия протоколов.
  2. Приготовьте необходимое количество PBS и питательной среды на водяной бане при температуре 37°С и поместите реагент для диссоциации клеток при комнатной температуре.
  3. Сбросить питательный раствор и дважды промыть пластины 1 мл предварительно подогретого PBS на лунку.
  4. Добавьте 1 мл реагента для диссоциации клеток в 6-луночные планшеты и диск....

Результаты

Здесь клетки РПЭ, полученные из hESC, в P1D35 были пассированы и засеяны с плотностью 105/см2. В течение недели после посева характерная гексагональная морфология и пигментация были утрачены во время фазы задержки (примерно 2 дня). Клетки РПЭ постепенно переняли гексагональную морф.......

Обсуждение

В настоящем исследовании описан успешный протокол замораживания-размораживания для клеток RPE, полученных из hESC, для исследовательских и клинических нужд. В отличие от иммортализированной клеточной линии РПЭ, ARPE-19, клетки РПЭ с соответствующими характеристиками эпителиального фенотип.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Национальным фондом естественных наук Китая (81970816) Мэй Цзян; Национальный фонд естественных наук Китая (82201223) Синьюэ Чжу; и План действий по инновациям в области науки и техники Шанхайской комиссии по науке и технике (2014090067000) Хайюнь Лю.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
40 μm Cell strainerCorning431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 DyeThermo Fisher ScientificC10337
Cryo freezing containerNalgene5100-0001
CryoStor CS10Biolife Solutions07930cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190144
GenxinSelcellYB050050cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cellsprovided by Wicell, USAH9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified MatrixCorning354277basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing SystemBioLife SolutionsAST-601
Trypan Blue solution 0.4%SigmaT8154
TryPLE SelectThermo Fisher Scientific12563029cell dissociation reagent
XVIVO-10 mediumLonzaBEBP04-743QRPE culture medium
Y-27632SelleckS1049

Ссылки

  1. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  2. Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt ....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

5 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены