Криоконсервация пигментных эпителиальных клеток сетчатки, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, на оптимальном этапе

Резюме

В этом исследовании представлен подробный протокол для эффективного криоконсервирования пигментных эпителиальных клеток сетчатки человека, полученных из стволовых клеток сетчатки.

Аннотация

Клетки пигментного эпителия сетчатки (РПЭ), полученные из эмбриональных стволовых клеток человека (чэск), являются превосходными источниками клеток для клеточной заместительной терапии у лиц с дегенеративными заболеваниями сетчатки; Тем не менее, исследования по стабильному и безопасному хранению этих терапевтических клеток немногочисленны. Наиболее часто встречающимися проблемами являются сильно изменчивая жизнеспособность клеток и функциональное восстановление клеток РПЭ после криоконсервации. В настоящем протоколе мы стремились достичь наилучшей скорости восстановления клеток после размораживания путем выбора оптимальной фазы клеток для замораживания на основе исходных экспериментальных условий. Клетки замораживали в экспоненциальной фазе, определяемой с помощью анализа мечения 5-этинил-2'-дезоксиуридина, что улучшало жизнеспособность клеток и скорость восстановления после размораживания. Стабильные и функциональные клетки были получены вскоре после размораживания, независимо от длительного процесса дифференцировки. Описанные здесь методы позволяют просто, эффективно и недорого сохранять и размораживать клетки RPE, полученные из hESC. Хотя этот протокол фокусируется на клетках RPE, эта стратегия замораживания может быть применена ко многим другим типам дифференцированных клеток.

Введение

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой пигментированный монослой клеток, необходимый для поддержания правильной функции сетчатки¹. Дисфункция и смерть от РПЭ тесно связаны со многими дегенеративными заболеваниями сетчатки, включая возрастную макулярную дегенерацию, пигментный ретинит и болезнь Штаргардта ^2,3. Заместительная терапия РПЭ является одной из наиболее перспективных схем лечения этих заболеваний 4,5,6,7. Стабильное поступление донорски....

протокол

1. Диссоциация клеток

1. Поддерживайте клетки РПЭ, как описано ранее^17,22.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все клетки выращиваются при температуре 37 °C в атмосфере с содержанием_CO2 5% в течение всего срока действия протоколов.
2. Приготовьте необходимое количество PBS и питательной среды на водяной бане при температуре 37°С и поместите реагент для диссоциации клеток при комнатной температуре.
3. Сбросить питательный раствор и дважды промыть пластины 1 мл предварительно подогретого PBS на лунку.
4. Добавьте 1 мл реагента для диссоциации клеток в 6-луночные планшеты и диск....

Результаты

Здесь клетки РПЭ, полученные из hESC, в P1D35 были пассированы и засеяны с плотностью 10⁵/^см2. В течение недели после посева характерная гексагональная морфология и пигментация были утрачены во время фазы задержки (примерно 2 дня). Клетки РПЭ постепенно переняли гексагональную морф.......

Обсуждение

В настоящем исследовании описан успешный протокол замораживания-размораживания для клеток RPE, полученных из hESC, для исследовательских и клинических нужд. В отличие от иммортализированной клеточной линии РПЭ, ARPE-19, клетки РПЭ с соответствующими характеристиками эпителиального фенотип.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049