Криоконсервация пигментных эпителиальных клеток сетчатки, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, на оптимальном этапе

Резюме

В этом исследовании представлен подробный протокол для эффективного криоконсервирования пигментных эпителиальных клеток сетчатки человека, полученных из стволовых клеток сетчатки.

Аннотация

Клетки пигментного эпителия сетчатки (РПЭ), полученные из эмбриональных стволовых клеток человека (чэск), являются превосходными источниками клеток для клеточной заместительной терапии у лиц с дегенеративными заболеваниями сетчатки; Тем не менее, исследования по стабильному и безопасному хранению этих терапевтических клеток немногочисленны. Наиболее часто встречающимися проблемами являются сильно изменчивая жизнеспособность клеток и функциональное восстановление клеток РПЭ после криоконсервации. В настоящем протоколе мы стремились достичь наилучшей скорости восстановления клеток после размораживания путем выбора оптимальной фазы клеток для замораживания на основе исходных экспериментальных условий. Клетки замораживали в экспоненциальной фазе, определяемой с помощью анализа мечения 5-этинил-2'-дезоксиуридина, что улучшало жизнеспособность клеток и скорость восстановления после размораживания. Стабильные и функциональные клетки были получены вскоре после размораживания, независимо от длительного процесса дифференцировки. Описанные здесь методы позволяют просто, эффективно и недорого сохранять и размораживать клетки RPE, полученные из hESC. Хотя этот протокол фокусируется на клетках RPE, эта стратегия замораживания может быть применена ко многим другим типам дифференцированных клеток.

Введение

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой пигментированный монослой клеток, необходимый для поддержания правильной функции сетчатки¹. Дисфункция и смерть от РПЭ тесно связаны со многими дегенеративными заболеваниями сетчатки, включая возрастную макулярную дегенерацию, пигментный ретинит и болезнь Штаргардта ^2,3. Заместительная терапия РПЭ является одной из наиболее перспективных схем лечения этих заболеваний 4,5,6,7. Стабильное поступление донорских клеток RPE имеет жизненно важное значение для клеточной терапии. Клетки RPE, полученные из человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC), являются идеальным источником клеток для клеточной терапии, поскольку они имитируют функцию первичных клеток RPE и могут производить теоретически неограниченное количество⁸. Однако процесс дифференцировки является трудоемким, а срок годности полученных клеток RPE относительно короток из-за последующего эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). Таким образом, криоконсервация клеток RPE, полученных из hESC, является необходимым этапом, необходимым для долгосрочного хранения и распространения по требованию⁹.

Повреждение клеток, вызванное криоконсервацией, может непреднамеренно поставить под угрозу терапевтическую эффективность^10,11. Поэтому недавние исследования по криоконсервации показали, что при разработке клеточной терапии следует определять оптимальные условия криогенного^{хранения.} Успешная криоконсервация гарантирует эффективное восстановление клеток, высокую жизнеспособность и восстановление их функций после цикла замораживания-размораживания. Тем не менее, предыдущие исследования по криоконсервации адгезивных монослоев клеток млекопитающих сообщали о сильно вариабельной (35%-95%) выживаемости после размораживания 13,14,15. Многие факторы существенно влияют на результаты криоконсервации, особенно на стадии замораживания ^16,17. Недавние исследования показали, что клетки RPE, замороженные в разные моменты времени, демонстрировали различное восстановление после размораживания¹⁷. Насколько нам известно, исследования по определению оптимального временного окна замораживания для клеток RPE, полученных из стволовых клеток, отсутствуют. В различных исследованиях клетки замораживались на разных стадиях: некоторые клетки замораживались вскоре после пассации или до слияния или пигментации ^8,15,18, в то время как другие были заморожены в другие временные точки ^9,19,20,21. Кроме того, нет четких доказательств того, влияет ли фаза или стадия клеток RPE, используемых для криоконсервации, на функцию RPE после размораживания. В нашем предыдущем исследовании мы впервые продемонстрировали, что экспоненциальная фаза роста клеток (P2D5) является наилучшей стадией для криоконсервации клеток RPE, полученных из hESC, с точки зрения жизнеспособности клеток и восстановления клеточных свойств^{и функций.}

Разработанный здесь метод направлен на криоконсервирование РПЭ, полученного из hESC, на оптимальной стадии для достижения наилучшего сохранения с точки зрения жизнеспособности и функции клеток после размораживания. Используя анализ мечения 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) для определения экспоненциальной фазы синтеза ДНК до криоконсервации, размороженные клетки RPE продемонстрировали жизнеспособность и скорость прикрепления >80%, экспрессию генов, специфичных для RPE, морфологию поляризованных клеток, секрецию фактора, полученного из пигментного эпителия, соответствующую трансэпителиальную резистентность и фагоцитарную способность ^8,17,22. Несмотря на то, что этот протокол ориентирован на клетки, полученные из hESC-RPE, и не все терапевтические клетки одинаково криоконсервированы, стратегия замораживания в экспоненциальной фазе может быть применена ко многим другим терапевтическим клеткам.

протокол

1. Диссоциация клеток

1. Поддерживайте клетки РПЭ, как описано ранее^17,22.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все клетки выращиваются при температуре 37 °C в атмосфере с содержанием_CO2 5% в течение всего срока действия протоколов.
2. Приготовьте необходимое количество PBS и питательной среды на водяной бане при температуре 37°С и поместите реагент для диссоциации клеток при комнатной температуре.
3. Сбросить питательный раствор и дважды промыть пластины 1 мл предварительно подогретого PBS на лунку.
4. Добавьте 1 мл реагента для диссоциации клеток в 6-луночные планшеты и дисконтируйте клетки при 37 °C в течение 15 минут. После инкубации понаблюдайте под микроскопом за клетками, которые сжимаются и блестят по краям, чтобы подтвердить прекращение пищеварения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциация на основе трипсина не рекомендуется, так как она дает низкую жизнеспособность клеток.
5. Осторожно проводите пипеткой вверх и вниз 10 раз с помощью пипетки объемом 1 мл, чтобы диссоциировать клетки, и разбавьте клеточную суспензию предварительно подогретой питательной средой (без Y-27632) в соотношении 1:10. Затем центрифугируйте ячейки при комнатной температуре в течение 3 минут при 250 × г.
6. Быстро вылейте надосадочную жидкость после центрифугирования, аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в 2 мл питательной среды, и повторно суспендируйте клетки 10-15 раз с помощью пипетки.
7. Отфильтруйте клеточную суспензию с помощью клеточного фильтра 40 мкм, чтобы получить одноклеточную суспензию, и рассчитайте количество клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензия с одной клеткой необходима для точного подсчета клеток и равномерной плотности посева клеток после размораживания.

2. Определение оптимальной клеточной стадии для криоконсервации

Примечание: Поскольку состояние клеток варьируется в зависимости от методов дифференцировки и клеточных линий, экспоненциальная фаза клеток RPE, культивируемых в разных лабораториях, должна быть определена перед замораживанием.

1. Разморозьте один флакон раствора базальной мембраны на льду при температуре 4 °C в течение ночи. Разведите матрицу в 12 мл холодного DMEM/F-12 и хорошо перемешайте. Добавьте по одному покровному стеклу на лунку и покройте каждую лунку 24-луночного планшета 0,25 мл разбавленного раствора. Перед использованием планшет инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C и отсасывают раствор покрытия непосредственно перед нанесением покрытия на клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по объему аликвоты зависят от конкретной партии в зависимости от концентрации белка и находятся в листе спецификации продукта.
2. Высевают одиночные клетки RPE с шага 1.7 на базальную мембрану, покрытую матрицей, покровными стеклами с плотностью 10⁵/^см2 в 1 мл питательной среды. Обновляйте питательную среду каждые 2-3 дня.
3. В указанные моменты времени (1, 3, 5, 7 и 11 дней после пассажа) инкубируйте клетки RPE с 10 мкМ EdU в среде в течение 24 ч. Фиксируйте, проникайте и окрашивайте клетки с помощью реакционного коктейля, как описано в руководстве, чтобы обнаружить инкорпорированный EdU.
4. Захватите изображения из пяти случайных полей под флуоресцентным микроскопом и рассчитайте процент EdU-положительных клеток. Постройте соответствующие кривые пропорционально-временного отношения EdU, чтобы построить кривую роста. Затем определите окно замораживания или экспоненциальную фазу для каждой клеточной линии в соответствии с кривой роста.
   Примечание: Восстановленная гексагональная морфология клеток указывает на то, что клетки выходят из экспоненциальной фазы.

3. Криоконсервация

1. Следуя шагам с 1.1 по 1.7, за исключением того, что время разложения уменьшается до 5 минут, центрифугируйте клеточную суспензию при комнатной температуре в течение 3 минут при 250 × г.
2. После центрифугирования надосадочную жидкость быстро вылить и аккуратно ресуспендировать клеточную гранулу в криоконсервирующей среде до плотности 2 × 10⁶ клеток/мл и переложить 1 мл клеточной суспензии в криогенные флаконы объемом 1,2 мл.
3. Немедленно поместите криогенные флаконы в контейнер для заморозки, заморозьте при температуре −80 °C на ночь, чтобы достичь скорости охлаждения −1 °C/мин, а затем переложите флаконы в жидкий азот для длительного хранения.

4. Размораживание

1. Нагрейте питательную среду на водяной бане при температуре 37 °C и предварительно заполните 10 мл предварительно подогретой питательной среды в пробирку объемом 15 мл.
2. Быстро размораживайте криогенные флаконы, взятые непосредственно из хранилища жидкого азота, с помощью автоматизированной системы размораживания.
3. Капните 0,5-1 мл предварительно подогретой питательной среды в криогенный флакон, чтобы убедиться, что замороженные клетки постепенно адаптируются к новой среде. Затем переведите 1,5-2 мл клеточной суспензии на 10 мл питательной среды в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клетки при 250 × г в течение 3 минут при комнатной температуре.
4. Выбросьте надосадочную жидкость путем быстрой заливки после центрифугирования, повторно суспендируйте гранулу в 2 мл предварительно подогретой питательной среды и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра для определения показателей восстановления и выживаемости с использованием стандартного исключения трипанового синего (0,4% трипанового синего красителя).
5. Культивирование клеток на поверхностях, покрытых базальной мембраной, при плотности 10⁵ жизнеспособных клеток/^см2 в культуральной среде с добавлением Y-27632 (конечная концентрация: 10 мкМ). Снимите Y-27632 через 24 часа.
6. Чтобы определить скорость прикрепления, снова диссоциируйте клетки и подсчитайте количество клеток через 24 ч после размораживания.

5. Валидация оптимальной фазы замораживания

1. Чтобы проверить оптимальную фазу замораживания, определенную на шаге 2.4, разморозьте клетки РПЭ, замороженные в разные моменты времени и культивирующие в течение 28 дней. Забор клеток для количественной ПЦР и иммуноокрашивающего анализа для оценки экспрессии маркеров РПЭ, как описано ранее¹⁷.

Результаты

Здесь клетки РПЭ, полученные из hESC, в P1D35 были пассированы и засеяны с плотностью 10⁵/^см2. В течение недели после посева характерная гексагональная морфология и пигментация были утрачены во время фазы задержки (примерно 2 дня). Клетки РПЭ постепенно переняли гексагональную морф...

Обсуждение

В настоящем исследовании описан успешный протокол замораживания-размораживания для клеток RPE, полученных из hESC, для исследовательских и клинических нужд. В отличие от иммортализированной клеточной линии РПЭ, ARPE-19, клетки РПЭ с соответствующими характеристиками эпителиального фенотип...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049