Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale

Riepilogo

Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'efficiente crioconservazione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali umane.

Abstract

Le cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) derivate da cellule staminali embrionali umane (hESC) sono fonti cellulari superiori per la terapia di sostituzione cellulare in individui con malattie degenerative della retina; Tuttavia, gli studi sulla conservazione stabile e sicura di queste cellule terapeutiche sono scarsi. La vitalità cellulare altamente variabile e il recupero funzionale delle cellule RPE dopo la crioconservazione sono i problemi più comunemente riscontrati. Nel presente protocollo, abbiamo mirato a ottenere il miglior tasso di recupero cellulare dopo lo scongelamento selezionando la fase cellulare ottimale per il congelamento in base alle condizioni sperimentali originali. Le cellule sono state congelate nella fase esponenziale determinata utilizzando il saggio di marcatura della 5-etinil-2'-deossiuridina, che ha migliorato la vitalità cellulare e il tasso di recupero dopo lo scongelamento. Cellule stabili e funzionali sono state ottenute poco dopo lo scongelamento, indipendentemente da un lungo processo di differenziazione. I metodi qui descritti consentono la conservazione e lo scongelamento semplici, efficienti ed economici delle cellule RPE derivate da hESC. Sebbene questo protocollo si concentri sulle cellule RPE, questa strategia di congelamento può essere applicata a molti altri tipi di cellule differenziate.

Introduzione

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato pigmentato di cellule necessario per mantenere la corretta funzione della retina¹. La disfunzione e la morte dell'EPR sono strettamente associate a molte malattie degenerative della retina, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa e la malattia di Stargardt ^2,3. La terapia sostitutiva dell'EPR è uno dei regimi terapeutici più promettenti per queste malattie 4,5,6,7. Una fornit....

Protocollo

1. Dissociazione cellulare

1. Mantenere le cellule RPE come descritto in precedenza^17,22.
   NOTA: Tutte le cellule vengono coltivate a 37 °C in un'atmosfera di CO₂ al 5% per tutta la durata dei protocolli.
2. Preparare la quantità necessaria di PBS e terreno di coltura in un bagno d'acqua a 37 ° C e porre il reagente di dissociazione cellulare a temperatura ambiente.
3. Scartare la soluzione di coltura e lavare le piastre due volte con 1 mL di PBS preriscaldato per pozzetto.
4. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare alle piastre a 6 pozze....

Discussione

Nel presente studio, viene descritto un protocollo di congelamento-scongelamento di successo per le cellule RPE derivate da hESC per la ricerca e le esigenze cliniche. A differenza della linea cellulare di RPE immortalizzata, ARPE-19, le cellule RPE con fenotipo epiteliale e funzione caratteristici adeguati, come le cellule RPE derivate da cellule staminali, sono più sensibili alla crioconservazione. Meno del 32% delle cellule è rimasto a 24 ore dopo lo scongelamento se non adeguatamente conservato^17<.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049