Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale

Riepilogo

Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'efficiente crioconservazione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali umane.

Abstract

Le cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) derivate da cellule staminali embrionali umane (hESC) sono fonti cellulari superiori per la terapia di sostituzione cellulare in individui con malattie degenerative della retina; Tuttavia, gli studi sulla conservazione stabile e sicura di queste cellule terapeutiche sono scarsi. La vitalità cellulare altamente variabile e il recupero funzionale delle cellule RPE dopo la crioconservazione sono i problemi più comunemente riscontrati. Nel presente protocollo, abbiamo mirato a ottenere il miglior tasso di recupero cellulare dopo lo scongelamento selezionando la fase cellulare ottimale per il congelamento in base alle condizioni sperimentali originali. Le cellule sono state congelate nella fase esponenziale determinata utilizzando il saggio di marcatura della 5-etinil-2'-deossiuridina, che ha migliorato la vitalità cellulare e il tasso di recupero dopo lo scongelamento. Cellule stabili e funzionali sono state ottenute poco dopo lo scongelamento, indipendentemente da un lungo processo di differenziazione. I metodi qui descritti consentono la conservazione e lo scongelamento semplici, efficienti ed economici delle cellule RPE derivate da hESC. Sebbene questo protocollo si concentri sulle cellule RPE, questa strategia di congelamento può essere applicata a molti altri tipi di cellule differenziate.

Introduzione

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato pigmentato di cellule necessario per mantenere la corretta funzione della retina¹. La disfunzione e la morte dell'EPR sono strettamente associate a molte malattie degenerative della retina, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa e la malattia di Stargardt ^2,3. La terapia sostitutiva dell'EPR è uno dei regimi terapeutici più promettenti per queste malattie 4,5,6,7. Una fornitura stabile di cellule RPE del donatore è vitale per la terapia cellulare. Le cellule RPE derivate da cellule staminali embrionali umane (hESC) sono una fonte cellulare ideale per la terapia cellulare perché imitano la funzione delle cellule RPE primarie e possono produrre una fornitura teoricamente illimitata⁸. Tuttavia, il processo di differenziazione è laborioso e la durata di conservazione delle cellule RPE ottenute è relativamente breve a causa della successiva transizione epitelio-mesenchimale (EMT). Pertanto, la crioconservazione delle cellule RPE derivate da hESC è un passaggio indispensabile per lo stoccaggio a lungo termine e la distribuzione su richiesta⁹.

Il danno cellulare indotto dalla crioconservazione può inavvertitamente compromettere l'efficacia terapeutica^10,11. Pertanto, recenti studi sulla crioconservazione hanno proposto che le condizioni ottimali di conservazione criogenica dovrebbero essere determinate durante la progettazione di terapie cellulari¹². Il successo della crioconservazione garantisce un recupero cellulare efficiente, un'elevata vitalità e il ripristino della funzione cellulare dopo il ciclo di congelamento-scongelamento. Tuttavia, studi precedenti sulla crioconservazione dei monostrati aderenti di cellule di mammifero hanno riportato tassi di sopravvivenza altamente variabili (35%-95%) dopo lo scongelamento 13,14,15. Molti fattori influenzano notevolmente i risultati della crioconservazione, in particolare durante la fase di congelamento^16,17. Ricerche recenti hanno dimostrato che le cellule RPE congelate in diversi momenti hanno mostrato un recupero vario dopo lo scongelamento¹⁷. Per quanto ne sappiamo, mancano studi sulla determinazione della finestra temporale di congelamento ottimale per le cellule RPE derivate da cellule staminali. In diversi studi, le cellule sono state congelate in varie fasi: alcune cellule sono state congelate poco dopo il passaggio o prima della confluenza o della pigmentazione ^8,15,18, mentre altre sono state congelate in altri punti temporali ^9,19,20,21. Inoltre, non ci sono prove chiare del fatto che la fase o lo stadio delle cellule RPE utilizzate per la crioconservazione influenzi la funzione dell'RPE dopo lo scongelamento. Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato per la prima volta che la fase esponenziale della crescita cellulare (P2D5) è la fase migliore per la crioconservazione delle cellule RPE derivate da hESC in termini di vitalità cellulare e recupero delle proprietà e delle funzioni cellulari¹⁷.

Il metodo qui stabilito mira a crioconservare l'RPE derivato da hESC in una fase ottimale per ottenere la migliore conservazione in termini di vitalità e funzione cellulare dopo lo scongelamento. Utilizzando il saggio di marcatura 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) per rilevare la fase esponenziale della sintesi del DNA prima della crioconservazione, le cellule RPE scongelate hanno mostrato una vitalità e un tasso di attaccamento del >80%, espressione genica specifica per RPE, morfologia cellulare polarizzata, secrezione di fattori derivati dall'epitelio pigmentato, resistenza transepiteliale appropriata e capacità fagocitaria ^8,17,22. Sebbene questo protocollo si concentri sulle cellule RPE derivate da hESC e non tutte le cellule terapeutiche siano crioconservate allo stesso modo, la strategia del congelamento nella fase esponenziale può essere applicata a molte altre cellule terapeutiche.

Protocollo

1. Dissociazione cellulare

1. Mantenere le cellule RPE come descritto in precedenza^17,22.
   NOTA: Tutte le cellule vengono coltivate a 37 °C in un'atmosfera di CO₂ al 5% per tutta la durata dei protocolli.
2. Preparare la quantità necessaria di PBS e terreno di coltura in un bagno d'acqua a 37 ° C e porre il reagente di dissociazione cellulare a temperatura ambiente.
3. Scartare la soluzione di coltura e lavare le piastre due volte con 1 mL di PBS preriscaldato per pozzetto.
4. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare alle piastre a 6 pozzetti e digerire le cellule a 37 °C per 15 minuti. Dopo l'incubazione, osservare al microscopio le cellule che si restringono e brillano ai bordi per confermare la fine della digestione.
   NOTA: La dissociazione a base di tripsina non è raccomandata in quanto offre una bassa vitalità cellulare.
5. Pipettare delicatamente su e giù 10 volte con una pipetta da 1 mL per dissociare le cellule e diluire la sospensione cellulare con terreno di coltura preriscaldato (senza Y-27632) in un rapporto di 1:10. Quindi, centrifugare le celle a temperatura ambiente per 3 minuti a 250 × g.
6. Versare rapidamente il surnatante dopo la centrifugazione, risospendere delicatamente il pellet cellulare in 2 mL del terreno di coltura e risospendere le cellule 10-15 volte con una pipetta.
7. Filtrare la sospensione cellulare con un filtro cellulare da 40 μm per ottenere una sospensione a cella singola e calcolare il numero di cellule.
   NOTA: Una sospensione a cella singola è essenziale per un conteggio accurato delle cellule e una densità di semina uniforme delle cellule dopo lo scongelamento.

2. Determinazione dello stadio cellulare ottimale per la crioconservazione

NOTA: Poiché lo stato cellulare varia tra i metodi di differenziazione e le linee cellulari, la fase esponenziale delle cellule RPE coltivate in diversi laboratori deve essere determinata prima del congelamento.

1. Scongelare un flaconcino di soluzione di matrice di membrana basale su ghiaccio a 4 °C per una notte. Diluire la matrice in 12 mL di DMEM/F-12 freddo e mescolare bene. Aggiungere un vetrino coprioggetti per pozzetto e rivestire ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 0,25 ml di soluzione diluita. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C prima dell'uso e aspirare la soluzione di rivestimento appena prima di galvanizzare le cellule.
   NOTA: Le istruzioni per il volume dell'aliquota sono specifiche per lotto in base alla concentrazione proteica e si trovano nella scheda tecnica del prodotto.
2. Seminare le singole cellule RPE della fase 1.7 sui vetrini coprioggetto rivestiti con matrice di membrana basale a una densità di 10⁵/cm² in 1 mL di terreno di coltura. Aggiornare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni.
3. Nei punti temporali indicati (1, 3, 5, 7 e 11 giorni dopo il passaggio), incubare le cellule RPE con 10 μM di EdU nel terreno per 24 ore. Fissare, permeabilizzare e colorare le cellule con il cocktail di reazione come descritto nel manuale per rilevare l'EdU incorporata.
4. Acquisisci immagini da cinque campi casuali sotto un microscopio a fluorescenza e calcola la percentuale di cellule EdU-positive. Traccia le corrispondenti curve proporzionale-tempo EdU-positive per generare una curva di crescita. Quindi, determinare la finestra di congelamento o la fase esponenziale per ogni linea cellulare in base alla curva di crescita.
   NOTA: La morfologia esagonale delle celle ristabilita indica che le cellule escono dalla fase esponenziale.

3. Crioconservazione

1. Seguendo i passaggi da 1.1 a 1.7, con la differenza che il tempo di digestione diminuisce a 5 minuti, centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per 3 minuti a 250 × g.
2. Scartare il surnatante versandolo rapidamente dopo la centrifugazione e risospendere delicatamente il pellet cellulare nel terreno di crioconservazione a una densità di 2 × 10⁶ cellule/mL e trasferire 1 mL di sospensione cellulare in fiale criogeniche da 1,2 mL.
3. Collocare immediatamente le fiale criogeniche in un contenitore di congelamento, congelarle a -80 °C durante la notte per ottenere una velocità di raffreddamento di -1 °C/min, quindi trasferire le fiale in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

4. Scongelamento

1. Riscaldare il terreno di coltura in un bagno d'acqua a 37 °C e preriempire 10 mL di terreno di coltura preriscaldato in una provetta da 15 mL.
2. Scongelare rapidamente le fiale criogeniche prelevate direttamente dal deposito di azoto liquido utilizzando un sistema di scongelamento automatizzato.
3. Versare 0,5-1 mL di terreno di coltura preriscaldato nella fiala criogenica per garantire che le cellule congelate si adattino gradualmente al nuovo ambiente. Quindi, trasferire 1,5-2 mL di sospensione cellulare in 10 mL di terreno di coltura in una provetta da 15 mL e centrifugare le cellule a 250 × g per 3 minuti a temperatura ambiente.
4. Scartare il surnatante versandolo rapidamente dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 2 mL di terreno di coltura preriscaldato e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro per determinare i tassi di recupero e sopravvivenza utilizzando l'esclusione standard del blu di tripano (colorazione blu di tripano allo 0,4%).
5. Coltura delle cellule su superfici rivestite di matrice di membrana basale a una densità di 10⁵ cellule vitali/cm² in un terreno di coltura integrato con Y-27632 (concentrazione finale: 10 μM). Rimuovere Y-27632 dopo 24 ore.
6. Per determinare il tasso di attacco, dissociare nuovamente le cellule e contare il numero di cellule 24 ore dopo lo scongelamento.

5. Convalida della fase di congelamento ottimale

1. Per convalidare la fase di congelamento ottimale determinata nella fase 2.4, scongelare le cellule RPE congelate in diversi punti temporali e coltivare per 28 giorni. Raccogliere le cellule per l'analisi qPCR e immunocolorazione per valutare l'espressione dei marcatori RPE come precedentemente descritto¹⁷.

Risultati

Qui, le cellule RPE derivate da hESC a P1D35 sono state fatte passare e seminate a una densità di 10⁵/cm². Entro una settimana dalla semina, la caratteristica morfologia esagonale e la pigmentazione sono andate perse durante la fase di ritardo (circa 2 giorni). Le cellule RPE hanno gradualmente riadottato la morfologia esagonale nella fase esponenziale (circa 5 giorni, Figura 1A) e sono entrate nella fase di decelerazione (circa 6 giorni) con una morfologia più poligo...

Discussione

Nel presente studio, viene descritto un protocollo di congelamento-scongelamento di successo per le cellule RPE derivate da hESC per la ricerca e le esigenze cliniche. A differenza della linea cellulare di RPE immortalizzata, ARPE-19, le cellule RPE con fenotipo epiteliale e funzione caratteristici adeguati, come le cellule RPE derivate da cellule staminali, sono più sensibili alla crioconservazione. Meno del 32% delle cellule è rimasto a 24 ore dopo lo scongelamento se non adeguatamente conservato^17<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049