שימור בהקפאה של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בשלב האופטימלי

Summary

מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט לשימור קריוגני יעיל של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע אנושיים.

Abstract

תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הם מקורות תאים מעולים לטיפול בתחליפי תאים אצל אנשים עם מחלות ניווניות ברשתית; עם זאת, מחקרים על הבנקאות היציבה והבטוחה של תאים טיפוליים אלה הם נדירים. כדאיות תאים משתנה מאוד והתאוששות תפקודית של תאי RPE לאחר שימור בהקפאה הן הבעיות הנפוצות ביותר. בפרוטוקול הנוכחי, שאפנו להשיג את קצב התאוששות התאים הטוב ביותר לאחר ההפשרה על ידי בחירת שלב התא האופטימלי להקפאה בהתבסס על תנאי הניסוי המקוריים. התאים הוקפאו בשלב המעריכי שנקבע על ידי שימוש בבדיקת התוויה 5-ethynyl-2′-deoxyuridine, אשר שיפרה את כדאיות התאים ואת קצב ההתאוששות לאחר ההפשרה. תאים יציבים ומתפקדים התקבלו זמן קצר לאחר ההפשרה, ללא תלות בתהליך התמיינות ארוך. השיטות המתוארות כאן מאפשרות שימור והפשרה פשוטים, יעילים וזולים של תאי RPE שמקורם בתאי תאי תאי גזע עובריים עובריים. למרות שפרוטוקול זה מתמקד בתאי RPE, אסטרטגיית הקפאה זו עשויה להיות מיושמת על סוגים רבים אחרים של תאים ממוינים.

Introduction

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבה פיגמנטית של תאים הדרושה לשמירה על תפקוד תקין של הרשתית¹. תפקוד לקוי ומוות של RPE קשורים קשר הדוק למחלות ניווניות רבות ברשתית, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטיניטיס פיגמנטוזה ומחלת סטארגרדט ^2,3. טיפול חלופי RPE הוא אחד משטרי הטיפול המבטיחים ביותר עבור מחלות אלה 4,5,6,7. אספקה יציבה של תאי RPE מתורם חיונית לטיפול תאי. תאי RPE שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הם מקור תאי אידיאלי לטיפול תאי מכיוון שהם מחקים את תפקודם של תאי RPE ראשוניים ויכולים לייצר אספקה בלתי מוגבלת תיאורטית⁸. עם זאת, תהליך ההתמיינות מייגע וחיי המדף של תאי RPE המתקבלים קצרים יחסית בגלל מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) לאחר מכן. לכן, שימור בהקפאה של תאי RPE שמקורם בתאי תאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) הוא צעד הכרחי הנדרש לאחסון לטווח ארוך ולהפצה לפי דרישה⁹.

נזק תאי הנגרם על ידי שימור בהקפאה עלול לפגוע בשוגג ביעילות הטיפולית^10,11. לכן, מחקרים אחרונים על שימור קריוגני הציעו כי יש לקבוע תנאי אחסון קריוגניים אופטימליים בעת תכנון טיפולים תאיים¹². שימור קריוגני מוצלח מבטיח התאוששות תאים יעילה, כדאיות גבוהה ושיקום תפקוד התא לאחר מחזור ההקפאה-הפשרה. עם זאת, מחקרים קודמים על שימור בהקפאה של חד-שכבות דבקות של תאי יונקים דיווחו על שיעורי הישרדות משתנים מאוד (35%-95%) לאחר הפשרה^של 13,14,15. גורמים רבים משפיעים במידה ניכרת על תוצאות השימור בהקפאה, במיוחד בשלב ההקפאה ^16,17. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאי RPE שהוקפאו בנקודות זמן שונות הציגו התאוששות מגוונת לאחר הפשרת¹⁷. למיטב ידיעתנו, חסרים מחקרים על קביעת חלון זמן הקפאה אופטימלי לתאי RPE שמקורם בתאי גזע. במחקרים שונים, התאים הוקפאו בשלבים שונים: חלק מהתאים הוקפאו זמן קצר לאחר המעבר או לפני מפגש או פיגמנטציה ^8,15,18, בעוד שאחרים הוקפאו בנקודות זמן אחרות ^9,19,20,21. יתר על כן, אין ראיות ברורות אם הפאזה או השלב של תאי RPE המשמשים לשימור בהקפאה משפיעים על תפקוד RPE לאחר הפשרה. במחקר הקודם שלנו, הדגמנו לראשונה שהשלב המעריכי של גדילת תאים (P2D5) הוא השלב הטוב ביותר לשימור בהקפאה של תאי RPE שמקורם בתאי תאי גזע עובריים עובריים (תאי גזע עובריים) במונחים של כדאיות התא והתאוששות התכונות והתפקודים התאיים¹⁷.

השיטה שהוקמה כאן שואפת לשמר בהקפאה RPE הנגזר מתאי גזע עובריים בשלב אופטימלי כדי להשיג את השימור הטוב ביותר מבחינת כדאיות התא ותפקודו לאחר ההפשרה. באמצעות בדיקת התיוג 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) כדי לזהות את השלב המעריכי של סינתזת DNA לפני שימור בהקפאה, תאי RPE מופשרים הציגו >80% כדאיות ושיעור התקשרות, ביטוי גנים ספציפיים ל-RPE, מורפולוגיה של תאים מקוטבים, הפרשת גורם שמקורו באפיתל פיגמנט, עמידות טרנסאפיתל מתאימה ויכולת פגוציטית ^8,17,22. למרות שפרוטוקול זה מתמקד בתאי RPE שמקורם בתאי תאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) ולא כל התאים הטיפוליים נשמרים בהקפאה בהקפאה בשלב המעריכי וניתן ליישם אותה על תאים טיפוליים רבים אחרים.

Protocol

1. דיסוציאציה של תאים

1. שמור על תאי RPE כפי שתואר קודם לכן^17,22.
   הערה: כל התאים גדלים בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 5% CO₂ לאורך כל תקופת הפרוטוקולים.
2. הכינו את הכמות הנדרשת של PBS ומדיום תרבית באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס והניחו את מגיב הדיסוציאציה של התא בטמפרטורת החדר.
3. השליכו את תמיסת התרבית ושטפו את הצלחות פעמיים עם 1 מ"ל PBS שחומם מראש לכל באר.
4. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה התא לצלחות 6-well ולעכל את התאים ב 37 ° C במשך 15 דקות. לאחר הדגירה, להתבונן בתאים להתכווץ ולהאיר בקצוות תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את סיום העיכול.
   הערה: דיסוציאציה מבוססת טריפסין אינה מומלצת מכיוון שהיא מעניקה כדאיות תאים נמוכה.
5. פיפטה למעלה ולמטה בעדינות 10x עם פיפטה 1 מ"ל כדי לנתק את התאים, ולדלל את תרחיף התא עם מדיום תרבית שחומם מראש (ללא Y-27632) ביחס של 1:10. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות ב 250 × גרם.
6. לשפוך במהירות את supernatant לאחר צנטריפוגה, בעדינות resuspend את גלולת התא ב 2 מ"ל של מדיום התרבית, ו resuspend את התאים 10-15x עם פיפטה.
7. סנן את תרחיף התא עם מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי לקבל תרחיף של תא בודד וחשב את מספר התאים.
   הערה: תרחיף חד-תאי חיוני לספירת תאים מדויקת ולצפיפות זריעת תאים אחידה לאחר ההפשרה.

2. קביעת שלב התא האופטימלי לשימור בהקפאה

הערה: מאחר שמצב התא משתנה בין שיטות התמיינות לבין קווי תאים, יש לקבוע את השלב המעריכי של תאי RPE בתרבית במעבדות שונות לפני ההקפאה.

1. הפשירו בקבוקון אחד של תמיסת מטריצת קרום מרתף על קרח בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. לדלל את המטריצה לתוך 12 מ"ל של DMEM קר / F-12 ולערבב היטב. מוסיפים כיסוי אחד לכל באר, ומצפים כל באר של צלחת 24 בארות עם 0.25 מ"ל של תמיסה מדוללת. דוגרים על הצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב-4°C לפני השימוש ושאפו את תמיסת הציפוי ממש לפני ציפוי התאים.
   הערה: ההוראות לנפח aliquot הן ספציפיות ללוט בהתבסס על ריכוז החלבון ונמצאות בגיליון מפרט המוצר.
2. זרעו את התאים הבודדים RPE משלב 1.7 על כיסויי המטריצה המצופים בממברנת המרתף בצפיפות של 10⁵/cm² ב 1 מ"ל של מדיום תרבית. רעננו את מדיום התרבות כל 2-3 ימים.
3. בנקודות הזמן שצוינו (1, 3, 5, 7 ו-11 ימים לאחר המעבר), דגרו תאי RPE עם 10 מיקרומטר EdU בתווך למשך 24 שעות. תקן, חלחל והכתים את התאים עם קוקטייל התגובה כמתואר במדריך כדי לזהות EdU משולב.
4. צלם תמונות מחמישה שדות אקראיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וחשב את אחוז התאים החיוביים ל- EdU. התווה את עקומות זמן הפרופורציה החיוביות המתאימות של EdU כדי ליצור עקומת צמיחה. לאחר מכן, קבע את חלון ההקפאה או את הפאזה המעריכית עבור כל קו תא בהתאם לעקומת הצמיחה.
   הערה: מורפולוגיית תאים משושים שהוקמה מחדש מציינת שתאים יוצאים מהשלב המעריכי.

3. שימור בהקפאה

1. לאחר שלבים 1.1 עד 1.7, פרט לכך שזמן העיכול פוחת ל -5 דקות, צנטריפוגו את תרחיף התא בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות ב 250 × גרם.
2. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי מזיגה מהירה לאחר הצנטריפוגה ולהשהות בעדינות את כדורית התא בתווך ההקפאה לצפיפות של 2 × 10⁶ תאים/מ"ל ולהעביר 1 מ"ל מתרחיף התא לבקבוקונים קריוגניים של 1.2 מ"ל.
3. הניחו מיד את הבקבוקונים הקריוגניים במיכל הקפאה, הקפיאו בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה כדי להשיג קצב קירור של -1°C/min, ולאחר מכן העבירו את הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

4. הפשרה

1. חממו את מדיום התרבית באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ומלאו מראש 10 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש לתוך צינור של 15 מ"ל.
2. הפשיר במהירות את הבקבוקונים הקריוגניים שנלקחו ישירות מאחסון החנקן הנוזלי באמצעות מערכת הפשרה אוטומטית.
3. טפטפו 0.5-1 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש לתוך הבקבוקון הקריוגני כדי להבטיח שהתאים הקפואים יסתגלו בהדרגה לסביבה החדשה. לאחר מכן, להעביר 1.5-2 מ"ל של תרחיף התא ל 10 מ"ל של מדיום התרבית בצינור 15 מ"ל צנטריפוגה את התאים ב 250 × גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
4. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי מזיגה מהירה לאחר הצנטריפוגה, להשהות מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש, ולספור את מספר התאים המשתמשים בהמוציטומטר כדי לקבוע את שיעורי ההתאוששות וההישרדות באמצעות הרחקה סטנדרטית של טריפאן כחול (0.4% כתם כחול טריפאן).
5. תרבית את התאים על משטחים מצופים מטריצה של קרום מרתף בצפיפות של 10⁵ תאים ברי קיימא לסמ"ר² בתווך תרבית בתוספת Y-27632 (ריכוז סופי: 10 מיקרומטר). הסר Y-27632 לאחר 24 שעות.
6. כדי לקבוע את קצב ההתקשרות, נתק שוב את התאים וספור את מספר התאים 24 שעות לאחר ההפשרה.

5. אימות שלב ההקפאה האופטימלי

1. כדי לאמת את שלב ההקפאה האופטימלי שנקבע בשלב 2.4, הפשירו תאי RPE שהוקפאו בנקודות זמן שונות ובתרבית שונות למשך 28 יום. קצור את התאים עבור ניתוח qPCR ו immunostaining כדי להעריך את הביטוי של סמני RPE כפי שתואר קודם¹⁷.

תוצאות

כאן, תאי RPE שמקורם ב-hESC ב-P1D35 עברו ונזרעו בצפיפות של 10⁵/cm². תוך שבוע מהזריעה, המורפולוגיה המשושה והפיגמנטציה האופייניות אבדו בשלב הפיגור (כיומיים). תאי RPE אימצו מחדש בהדרגה את המורפולוגיה המשושה בשלב המעריכי (כ-5 ימים, איור 1A) ונכנסו לשלב ההאטה (כ-6 ימים) עם מורפולוגיה ...

Discussion

במחקר הנוכחי מתואר פרוטוקול הקפאה-הפשרה מוצלח עבור תאי RPE שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (תאי גזע עובריים) לצורך מחקר וצרכים קליניים. שלא כמו קו תאי RPE אימורטלי, ARPE-19, תאי RPE עם פנוטיפ אפיתל אופייני תקין ותפקוד, כמו תאי תאי גזע נגזרים RPE, רגישים יותר להקפאה. פחות מ-32% מהתאים נשארו 24 שעות לאחר הה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049