人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞在最佳阶段的冷冻保存

摘要

本研究为人类干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞的有效冷冻保存提供了详细的方案。

摘要

源自人胚胎干细胞 （hESC） 的视网膜色素上皮 （RPE） 细胞是视网膜退行性疾病患者细胞替代疗法的优越细胞来源;然而，关于这些治疗性细胞的稳定和安全储存的研究很少。冻存后RPE细胞的细胞活力和功能恢复变化很大，这是最常遇到的问题。在本方案中，我们旨在通过根据原始实验条件选择最佳的细胞相进行冷冻，从而实现解冻后的最佳细胞回收率。使用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷标记测定法测定的指数期冷冻细胞，提高了解冻后的细胞活力和恢复率。解冻后不久即可获得稳定且功能性的细胞，与漫长的分化过程无关。这里描述的方法允许简单、高效和廉价地保存和解冻 hESC 衍生的 RPE 细胞。尽管该协议侧重于RPE细胞，但这种冷冻策略可以应用于许多其他类型的分化细胞。

引言

视网膜色素上皮 （RPE） 是维持视网膜正常功能所必需的色素沉着单层细胞¹。RPE 功能障碍和死亡与许多视网膜退行性疾病密切相关，包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性和 Stargardt 病 ^2,3。RPE替代疗法是^{这些疾病最}有前途的治疗方案之一4,5,6,7。供体RPE细胞的稳定供应对于细胞治疗至关重要。人胚胎干细胞 （hESC） 衍生的 RPE 细胞是细胞治疗的理想细胞来源，因为它们模仿原代 RPE 细胞的功能，并且可以产生理论上无限的供应⁸。然而，分化过程很费力，并且由于随后的上皮-间充质转化 （EMT），获得的 RPE 细胞的保质期相对较短。因此，hESC来源的RPE细胞的冻存是长期储存和按需分发所必需的必不可少的步骤⁹。

冷冻保存诱导的细胞损伤可能会无意中影响治疗效果^10,11

研究方案

1. 细胞解离

1. 如前所述维持RPE细胞^17,22。
   注意：在整个方案期间，所有细胞在37°C下在5%CO₂ 气氛中生长。
2. 在37°C水浴中制备所需量的PBS和培养基，并将细胞解离试剂置于室温下。
3. 丢弃培养溶液，每孔用 1 mL 预热的 PBS 洗涤板两次。
4. 将 1 mL 细胞解离试剂加入 6 孔板中，并在 37 °C 下消化细胞 15 分钟。孵育后，在显微镜下观察边缘收缩和发光的细胞，以确认消化终止。
   注意：不建议使用基于胰蛋白酶的解离，因为它会导致细胞活力低下。
5. 用 1 mL 移液管轻轻上下移液 10 次以解离细胞，并用预热的培养基（不含 Y-27632）以 1：10 的比例稀释细胞悬浮液。然后，在室温下以 250 × g 离心细胞 3 分钟。
6. 离心后迅速倒出上清液，轻轻地将细胞沉淀重悬于 2 mL 培养基中，然后用移液管重悬细胞 10-15 次。
7. 用40μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液，以获得单细胞悬浮液并计算细胞数。
   注：单细胞悬浮液对于解冻后的准确细胞计数和均匀的细胞接种密度至关重要。

2. 确定冷冻保存....

讨论

在本研究中，描述了用于研究和临床需求的 hESC 衍生的 RPE 细胞的成功冻融方案。与永生化的 RPE 细胞系 ARPE-19 不同，具有适当特征性上皮表型和功能的 RPE 细胞，如干细胞衍生的 RPE 细胞，对冻存更敏感。如果保存不当，不到 32% 的细胞在解冻后 24 小时内保留¹⁷。冷冻保存时间是一个关键参数。永生化细胞冻存的一个既定观点是在指数生长阶段冷冻细胞。分化的细胞离开细胞周期.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049