A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذجا يمكن الاعتماد عليه وفعالا في المختبر لحاجز الدم في الدماغ. تستخدم الطريقة الخلايا البطانية الوعائية الدماغية للفأر bEnd.3 وتقيس المقاومة الكهربائية عبر الغشاء.

Abstract

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو هيكل فسيولوجي ديناميكي يتكون من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة والخلايا النجمية والخلايا المحيطة. من خلال تنسيق التفاعل بين العبور المقيد للمواد الضارة ، وامتصاص المغذيات ، وإزالة المستقلب في الدماغ ، فإن BBB ضروري في الحفاظ على توازن الجهاز العصبي المركزي. يعد بناء نماذج في المختبر من BBB أداة قيمة لاستكشاف الفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات العصبية وإنشاء علاجات دوائية. تصف هذه الدراسة إجراء لإنشاء نموذج خلية BBB أحادي الطبقة في المختبر عن طريق زرع خلايا bEnd.3 في الغرفة العلوية لصفيحة 24 بئرا. لتقييم سلامة وظيفة حاجز الخلية ، تم استخدام مقياس الفولتميتر الخلوي الظهاري التقليدي لتسجيل المقاومة الكهربائية عبر الغشاء للخلايا الطبيعية وخلايا نقص الأكسجين التي يسببها CoCl2 في الوقت الفعلي. نتوقع أن توفر التجارب المذكورة أعلاه أفكارا فعالة لإنشاء نماذج في المختبر من BBB والأدوية لعلاج اضطرابات أمراض الجهاز العصبي المركزي.

Introduction

BBB هي واجهة بيولوجية فريدة بين الدورة الدموية والأنسجة العصبية ، والتي تتكون من الخلايا البطانية الوعائية ، والخلايا المحيطة ، والخلايا النجمية ، والخلايا العصبية ، والهياكل الخلويةالأخرى 1. يتم تنظيم تدفق الأيونات والمواد الكيميائية والخلايا بين الدم والدماغ بشكل صارم بواسطة هذا الحاجز. يحمي هذا التوازن الأنسجة العصبية من السموم ومسببات الأمراض مع تمكين التشغيل المناسب لأعصاب الدماغ 2,3. يمكن أن يؤدي الحفاظ على سلامة BBB إلى منع تطور وتطور الاضطرابات التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي بشكل فعال ، مثل الخلل الوظيفي العصبي والوذمة والالتهاب العصبي4. ومع ذلك ، فإ....

Protocol

ملاحظة: تم تلقيح الخلايا البطانية المشتقة من دماغ الفأر.3 (bEnd.3) في غرف صفيحة 24 بئرا لبناء نموذج بسيط في المختبر من BBB في ظل ظروف متوسطة محددة. تم قياس TEER للخلايا الطبيعية وخلايا نقص الأكسجين بواسطة مقياس TEER (الشكل 1 والشكل 2).

1. إعداد الحل

  1. تحضير وسط زراعة الخلايا DMEM الذي يحتوي على FBS (10٪ ، v / v) ، 100 U / mL البنسلين ، و 10 ملغ / مل من الستربتومايسين (انظر جدول المواد).
  2. قم بإعداد محلول مخزون 100 mM CoCl2 بإضافة 1.30 مجم CoCl2 إلى 100 ميكرولتر محلول DMSO.
    ملاحظة: تم تخزين جميع المح....

النتائج

سمح هذا البروتوكول بتسجيل التغييرات في قيم مقاومة الخلايا وفقا للمعايير المحددة في مقياس المقاوم عبر البطانة. تم فحص صلاحية خلايا bEnd.3 (عدد الخلايا الحية) المعالجة بتركيزات مختلفة من CoCl2 بواسطة مقايسة CCK-8. تم تمثيل تلف الخلايا الأكبر الناتج عن CoCl2 من خلال انخفاض صلاحية الخلية. وج.......

Discussion

أحد أكثر أعضاء الجسم تطورا ، يتحكم الدماغ في مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية المعقدة ، بما في ذلك الذاكرة والإدراك والسمع والشم والحركة27. الدماغ هو واحد من أكثر أعضاء جسم الإنسان تعقيدا ومرضا في نفس الوقت. يظهر حدوث العديد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي ميلا متزايدا ?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نحن نقدر الدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82274207 و 82104533) ، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي في نينغشيا (2023BEG02012) ، ومشروع تعزيز أبحاث Xinglin Scholar التابع لجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (XKTD2022013).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well transwell plateCorning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm)10522023
75 % ethanolChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd2023052901
96-well plateGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd220412-078-B
bEnd.3 cellsHunan Fenghui Biotechnology Co., LtdCL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8)Boster Biological Technology Co., LtdBG0025
Cell culture dish (100mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd1192022
Cobalt Chloride (CoCl2)Sigma15862
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)Gibco ThermoFisher Scientific8121587
Fetal bovine serumGibco ThermoFisher Scientific2166090RP
GraphPad Prism softwareGraphPad Software9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV)MedChemexpressHY-K6002
Microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
OriginPro 8 softwareOriginLab Corporationv8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)Boster Biological Technology Co., Ltd17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x)Gibco ThermoFisher Scientific8120485
Sodium hypochloriteChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd2022091501
Transmembrane resistance meterWorld Precision Instruments LLCVOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x)HyCloneJ210045

References

  1. Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
  2. Bagchi, S., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BEnd 3 BBB 24 CoCl2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved