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요약

이 프로토콜은 뇌 혈액 장벽의 신뢰할 수 있고 효율적인 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스 대뇌 혈관 내피 세포 bEnd.3를 사용하고 막관통 전기 저항을 측정합니다.

초록

혈액뇌장벽(BBB)은 미세혈관 내피세포, 성상세포, 주위세포로 구성된 역동적인 생리학적 구조입니다. BBB는 유해 물질의 제한된 통과, 영양소 흡수 및 뇌의 대사 산물 제거 사이의 상호 작용을 조정함으로써 중추 신경계 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. BBB의 체외 모델 구축은 신경 장애의 병태생리학을 탐구하고 약리학적 치료법을 만드는 데 유용한 도구입니다. 이 연구는 24웰 플레이트의 상부 챔버에 bEnd.3 세포를 파종하여 시험관 내 단층 BBB 세포 모델을 생성하는 절차를 설명합니다. 세포 장벽 기능의 무결성을 평가하기 위해 기존의 상피 세포 전압계를 사용하여 정상 세포와 CoCl2 유도 저산소 세포의 막횡단 전기 저항을 실시간으로 기록했습니다. 우리는 위의 실험이 BBB의 체외 모델 및 중추 신경계 질환의 장애를 치료하는 약물을 만드는 데 효과적인 아이디어를 제공할 것으로 기대합니다.

서문

BBB는 혈관 내피 세포, 주위 세포, 성상 세포, 뉴런 및 기타 세포 구조로 구성된 혈액 순환과 신경 조직 사이의 독특한 생물학적 인터페이스입니다1. 혈액과 뇌 사이의 이온, 화학 물질 및 세포의 흐름은 이 장벽에 의해 엄격하게 조절됩니다. 이 항상성은 독소와 병원균으로부터 신경 조직을 보호하는 동시에 뇌 신경의 적절한 작동을 가능하게 합니다 2,3. BBB의 무결성을 유지하면 신경 기능 장애, 부종 및 신경 염증과 같은 중추 신경계에 영향을 미치는 장애의 발생 및 진행을 효과적으로 예방할 수 있습니다4. 그러나 BBB의 독특한 생리학적 특성으로 인해 저분자 약물의 98% 이상과 고분자 약물의 100% 이상이 중추신경계에 들어가는 것을 방지할 수 있다5. 따라서 중추 신경계에 대한 약물 개발 중에 BBB를 통한 약물 침투를 증가시키는 것은 치료 효능을 달성하는 데 필수적입니다 6,7. 기질의 컴퓨터 시뮬레이션 스크리닝으로 인해 약물 후보 물질이 BBB를 통과할 확률이 크게 높아졌지만, 과학 연구의 요구를 충족하기 위해서는 여전히 신뢰할 수 있고 저렴한 in vitro/in vivo BBB 모델이 필요하다8.

고처리량 약물 스크리닝을 위한 빠르고 저렴한 기술은 in vitro 모델9입니다. BBB 기능에 대한 의약품의 효과와 질병의 발병 및 진행에 대한 의약품의 역할의 근본적인 과정을 밝히기 위해 일련의 단순화된 체외 BBB 모델이 만들어졌습니다. 현재, 일반적인 in vitro BBB 모델은 혈관 내피 세포와 성상세포, 주위 세포 또는 미세아교세포(microglia)에 의해 구성된 단층, 공동 배양, 동적 및 미세유체 모델(10,11,12)이다(13,14). 3D 세포 배양은 BBB15의 생리학적 구조와 더 일치하지만, BBB에 대한 약물 스크리닝 수단으로서의 적용은 복잡한 설계와 수준 이하의 재현성으로 인해 여전히 제약을 받고 있습니다. 대조적으로, 단층 in vitro 모델은 BBB를 연구하는 데 가장 자주 사용되는 모델이며 특정 세포에서 막 수송체 및 밀착 접합 단백질의 발현을 결정하는 데 적용할 수 있습니다.

막관통 전기 저항(TEER) 측정은 저항을 가로지르는 셀 층을 평가 및 모니터링하고 장벽의 셀 무결성 및 투과성을 평가하는 기술입니다. 단층(monolayer)의 어느 한쪽에 있는 성장 매체 또는 완충 용액에 2개의 전극을 동시에 삽입함으로써, 전지의 조밀한 층(16,17)을 통해 교류 또는 전기 임피던스를 측정할 수 있다. 시험관 내 BBB 모델이 적절하게 생성되었는지의 여부를 결정하기 위해, TEER의 측정은 통상적으로 골드 스탠다드(gold standard)18로 채택될 것이다. 한편, BBB 투과성에 대한 약물 작용의 경향은 약물 침범 후 세포층의 전기 저항 변화를 측정함으로써 정확하게 예측할 수 있다19. 예를 들어, Feng et al.은 catalpol (rehmanniae의 주요 활성 단량체)이 BBB에서 단단한 접합 단백질의 지질 다당류 유도 하향 조절을 효과적으로 역전시키고 마우스 뇌 내피 세포층20의 TEER 값을 높일 수 있음을 발견했습니다.

신경염증 반응은 일반적으로 BBB 항상성 불균형의 주요 원인이다21. 신경염증성 손상을 유발하는 저산소 치료는 혈액뇌장벽을 파괴하는 주요 방법이며, 주로 물리적 방법과 화학적 시약방법을 포함합니다. 전자는 저산소 조건(22)을 시뮬레이션하기 위해 세포 성장 환경에서의 산소 함량을 변화시키기 위해 주로 3-기체 인큐베이터를 이용하는 반면, 후자는 CoCl2와 같은 데옥시 시약을 세포 배양 배지(23)에 인위적으로 도입함으로써 달성된다. 헴에서 Fe2 +가 Co2 +로 치환되면 세포는 탈산소 상태로 유지됩니다. 촉매 그룹에서 Fe2 +가 Co2 +로 치환되면 프롤린 하이드 록실 라제 및 아스파르테이트 하이드 록실 라제 활성이 억제되어 저산소증 유도 인자 -1α (HIF-1α) 24가 축적됩니다. 지속적인 저산소증 상태에서 세포질에서 HIF-1α의 탈인산화는 세포 사멸을 유발하고 혈관 내피 성장 인자를 활성화하여 궁극적으로 혈관 투과성을 높입니다. 이전 연구25,26에서, 저산소증이 내피 밀착 접합 단백질의 발현을 현저히 감소시켜 BBB의 투과성을 증가시킬 수 있다는 것이 잘 입증되었습니다. 이 연구에서는 간단한 BBB 모델을 만들기 위해 24웰 플레이트에 파종된 bEnd.3 세포의 시간 저항 곡선을 측정했습니다. 이 모델을 사용하여 BBB 보호를 위한 약물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있는 세포 모델을 구성하기 위해 CoCl2 개입 후 세포 TEER의 변화를 특성화했습니다.

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프로토콜

참고: 마우스 뇌 유래 내피 세포.3(bEnd.3)을 24웰 플레이트의 챔버에 접종하여 특정 배지 조건에서 BBB의 간단한 시험관 내 모델을 구성했습니다. 정상 세포와 저산소 세포의 TEER은 TEER 미터로 측정하였다(도 1 및 도 2).

1. 용액 준비

  1. FBS(10%, v/v), 100U/mL 페니실린 및 10mg/mL 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 세포 배양 배지를 준비합니다( 재료 표 참조).
  2. 100μL DMSO 용액에 1.30mgCoCl2를 첨가하여 100mMCoCl2 원액을 준비합니다.
    참고: 위의 모든 용액을 4°C 조건에서 보관하고, 원액을 원하는 농도에 따라 희석한 후 사용하였다.
  3. 5mL의 이중 증류수에 차아염소산나트륨 용액 2mL를 첨가하여 38% 차아염소산나트륨 용액(v/v)을 준비합니다.

2. 세포 배양 및 세포 생존력

  1. 1 x 106 cells/mL 밀도의 DMEM 배지를 포함하는 배양 접시(100mm)에 bEnd.3 세포 1mL를 파종하고 5%CO2의 가습 분위기에서 37°C에서 배양합니다. 2-3일마다 배지를 교체하고 일주일에 2번 세포를 하위 배양합니다.
  2. bEnd.3 세포가 80% 합류로 성장한 후 30초 동안 0.25% 트립신으로 세포를 분해합니다.
  3. 세포 카운터를 통해 DMEM 배지를 사용하여 7 x 104 cells/mL의 밀도로 bEnd.3 세포를 현탁시킵니다. 그런 다음 100μL의 bEnd.3 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 파종합니다.
  4. 세포 접착 후 PBS로 세포를 세척하고 동일한 조건에서 100μL의 배양 배지 또는 약물 함유 배지(100μM, 200μM, 300μM, 400μM, 500μMCoCl2)로 세포를 배양합니다. 웰 플레이트 내부의 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 100μL의 CCK-8 용액을 추가합니다.
    알림: 광학 밀도(OD) 값에 영향을 미치는 우물에 기포를 생성하지 마십시오.
  5. 96웰 플레이트를 37°C 환경에 놓고 1시간 동안 배양합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 96웰 플레이트의 흡광도를 측정합니다.
    알림: 그룹 내 차이를 피하기 위해 웰 플레이트는 검출 전에 실온으로 냉각되었습니다.
  6. [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100% 공식에 따라 다양한 농도의 CoCl2에 의해 유도된 세포 생존율을 계산합니다. 다음 실험에서 대조군과 비교하여 세포 생존율 감소에 유의한 차이가 있는CoCl2 농도를 선택합니다.

3. 모형 집합

  1. 24웰 플레이트의 상부 챔버를 PBS로 헹굽니다.
    참고: 세포는 24웰 플레이트의 상부 챔버 바닥에서 성장하고 융합되었으며, 세포 사이의 긴밀한 접합부가 점차적으로 형성되어 장벽 역할을 했습니다. 일부 연구에서 사용된 내피 세포가 PET 멤브레인에 독립적으로 완전한 장벽을 형성할 수 없는 경우 세포 접종 전에 콜라겐 IV 용액으로 멤브레인을 코팅해야 합니다.
  2. bEnd.3 셀을 DMEM 배지와 혼합하여 와류 믹서를 사용하여 5 x 105 cells/mL의 밀도로 현탁액을 만듭니다. 그런 다음 24웰 플레이트(0.33cm2, 0.4μm 멤브레인 공극 크기)의 상부 챔버에 있는 PET 멤브레인에 200μL의 bEnd.3 셀 현탁액을 파종합니다.
    참고: 이 프로토콜의 파일럿 연구는 실험을 위해 5-10개의 bEnd.3 세포 통로를 사용할 때 결과에 차이가 없음을 발견했습니다. 성공적인 모델링의 가능성을 보장하려면 이 프로토콜의 셀 번호 간격을 참조하십시오.
  3. 플레이트의 하부 챔버에 1200μL의 완전한 배지를 추가하여 상부 및 하부 챔버의 삼투압이 안정화되는 경향이 있는지 확인합니다. 유형에 따라 추가되는 매체의 양에 차이가 있습니다. 상부 및 하부 챔버의 액체 레벨이 같은 높이인지 확인하십시오.
  4. 상부 챔버와 하부 챔버의 매체를 매일 정해진 시간에 교체하고 동시에 저항 값을 모니터링합니다.
    1. 매체를 변경할 때 인위적인 접촉이나 과도한 움직임으로 인해 세포층의 무결성이 손상됩니다. 위의 상황을 방지하려면 음압 피펫으로 한쪽에서 기존 매체를 천천히 제거하고 유체 교환 중에 벽을 따라 새 매체를 천천히 추가하십시오.

4. TEER 측정

  1. 작업을 시작하기 전에 저항기, 5% 차아염소산나트륨 용액, 75% 에탄올 및 이중 증류수 용액을 매우 깨끗한 테이블에 놓습니다. 잔류 박테리아와 병원균을 제거하기 위해 30분 동안 UV 조사를 켭니다.
  2. 전극을 5% 차아염소산나트륨 용액에 넣고 3초에서 5초 동안 천천히 흔든 다음 75% 에탄올에 15분 동안 담그십시오. 마지막으로 사용할 때까지 PBS 또는 이중 증류수 용액으로 옮깁니다.
  3. 셀 저항기 미터 뒷면의 스위치를 켜고 표 1의 매개변수에 따라 Select Plate를 클릭한 다음 24-Well Plate를 선택합니다.
  4. 작업 요구 사항에 따라 적절한 감지 순서를 선택하십시오. 본 연구에서는 A1 절차를 선택하였다.
  5. kΩ 저항을 오른쪽 플러그에 삽입하여 계측기를 교정합니다. 교정 결과가 1000 ± 5 Ω이면 기기의 정확도가 정상이라고 생각하십시오.
    1. 교정 결과가 1000 Ω이 아닌 경우 메인 인터페이스에서 모드 단위 를 클릭하여 OHMS를 선택한 다음 메인 화면에서 교정 을 클릭하여 기기를 다시 교정합니다.
  6. 오른쪽에 있는 kΩ 저항을 빼내고 측정 전극을 연결 와이어로 교체합니다.
  7. 셀을 수직으로 시드하지 않고 전극을 24웰 플레이트에 놓고 기기의 메인 화면에서 Blank Handling 을 클릭합니다. 시드된 셀이 없는 플레이트 저항의 배경 값은 약 134.4 Ω입니다.
  8. 두 개의 전극을 셀이 있는 시드 플레이트의 상부 및 하부 챔버에 삽입하여 셀층이 그 사이에 오도록 한 다음 페달을 부드럽게 밟아 저항 값을 기록합니다.
    1. 전극이 상부 챔버의 셀과 하부 챔버의 바닥에 닿지 않도록 하십시오. 용액에 전극을 담그는 시간은 저항 값에 영향을 미치지 않으며 전극이 올바른 위치에 있는지 확인하기만 하면 됩니다.
  9. 다음 방정식과 같이 전기 저항 값(ohms)에 상부 챔버의 바닥 면적(cm2)을 곱하여 TEER 값(Ωcm2)을 얻습니다.
    TEER(Ωcm2) = 저항(Ω) x S인서트 (cm2)
  10. TEER-Time(일)의 선 플롯을 그립니다. 저항 값이 시간이 지남에 따라 더 이상 증가하지 않으면(며칠에 걸쳐 측정) 셀이 장벽을 형성했다고 간주합니다.
    알림: bEnd.3 세포의 단층 BBB 모델은 약 6일 동안 이 연구의 매개변수로 bEND.3 세포를 배양하여 성공적으로 구축될 것입니다. bEnd.3 셀 단층 모델의 TEER은 6일 이내에 16.49 ± 2.12 Ωcm2 에서 27.59 ± 1.50 Ωcm2 범위였습니다(n=8, 평균 ± SD).

5. 장벽 파괴 및 통계 분석

  1. TEER-시간 곡선에 따라 장벽 기능이있는 웰을 선택하고 대조군과 CoCl2 그룹 (n = 4)으로 나눕니다.
  2. 300μMCoCl2 (200μL)를 함유하는 배양액 및 배양액을 각각 대조군 및CoCl2 기 상부 챔버에 첨가합니다.
  3. 4단계에서 설명한 절차를 사용하여 37°C에서 배양 12시간 및 24시간에서 대조군과 CoCl2 그룹의 저항값을 검출합니다.
  4. 상용 소프트웨어를 사용하여 300μM CoCl2 유무에 관계없이 배양된 세포 장벽의 TEER 값 추세를 매핑합니다.
  5. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 CoCl2 처리 세포와 정상 세포 간의 저항 값 차이를 분석합니다(n=4, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

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결과

이 프로토콜은 경내피 저항기 측정기에 설정된 매개변수에 따라 세포의 저항 값의 변화를 기록할 수 있었습니다. 다양한 농도의 CoCl2로 처리된 bEnd.3 세포(살아있는 세포의 수)의 생존력은 CCK-8 분석으로 스크리닝되었습니다. CoCl2에 의해 생성된 더 큰 세포 손상은 더 낮은 세포 생존율로 나타났습니다. 300μM의 CoCl2가 시험관 내에서 유의미한 세포독성을 나타낸다는 ?...

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토론

가장 발달된 신체 기관 중 하나인 뇌는 기억, 인지, 청각, 후각, 운동 등 다양하고 복잡한 생리적 과정을 관장한다27. 뇌는 인체에서 가장 복잡하고 병든 기관 중 하나이다. 많은 중추신경계 장애의 발생은 대기 오염, 불규칙한 식습관 및 기타 요인을 포함한 요인으로 인해 해마다 증가하는 경향을 보인다 27,28,29.

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공개

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 말

중국 국립 자연 과학 재단(82274207 및 82104533), 닝샤 중점 연구 개발 프로그램(2023BEG02012) 및 청두 중의학 대학 Xinglin Scholar Research Promotion Project(XKTD2022013)의 재정적 지원에 감사드립니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well transwell plateCorning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm)10522023
75 % ethanolChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd2023052901
96-well plateGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd220412-078-B
bEnd.3 cellsHunan Fenghui Biotechnology Co., LtdCL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8)Boster Biological Technology Co., LtdBG0025
Cell culture dish (100mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd1192022
Cobalt Chloride (CoCl2)Sigma15862
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)Gibco ThermoFisher Scientific8121587
Fetal bovine serumGibco ThermoFisher Scientific2166090RP
GraphPad Prism softwareGraphPad Software9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV)MedChemexpressHY-K6002
Microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
OriginPro 8 softwareOriginLab Corporationv8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)Boster Biological Technology Co., Ltd17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x)Gibco ThermoFisher Scientific8120485
Sodium hypochloriteChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd2022091501
Transmembrane resistance meterWorld Precision Instruments LLCVOM3 (verison 1.6)

참고문헌

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