경내피 전기 저항 검출을 통한 bEnd.3 혈관 내피 세포의 장벽 기능 무결성 기록

요약

이 프로토콜은 뇌 혈액 장벽의 신뢰할 수 있고 효율적인 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스 대뇌 혈관 내피 세포 bEnd.3를 사용하고 막관통 전기 저항을 측정합니다.

초록

혈액뇌장벽(BBB)은 미세혈관 내피세포, 성상세포, 주위세포로 구성된 역동적인 생리학적 구조입니다. BBB는 유해 물질의 제한된 통과, 영양소 흡수 및 뇌의 대사 산물 제거 사이의 상호 작용을 조정함으로써 중추 신경계 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. BBB의 체외 모델 구축은 신경 장애의 병태생리학을 탐구하고 약리학적 치료법을 만드는 데 유용한 도구입니다. 이 연구는 24웰 플레이트의 상부 챔버에 bEnd.3 세포를 파종하여 시험관 내 단층 BBB 세포 모델을 생성하는 절차를 설명합니다. 세포 장벽 기능의 무결성을 평가하기 위해 기존의 상피 세포 전압계를 사용하여 정상 세포와 CoCl₂ 유도 저산소 세포의 막횡단 전기 저항을 실시간으로 기록했습니다. 우리는 위의 실험이 BBB의 체외 모델 및 중추 신경계 질환의 장애를 치료하는 약물을 만드는 데 효과적인 아이디어를 제공할 것으로 기대합니다.

서문

BBB는 혈관 내피 세포, 주위 세포, 성상 세포, 뉴런 및 기타 세포 구조로 구성된 혈액 순환과 신경 조직 사이의 독특한 생물학적 인터페이스입니다¹. 혈액과 뇌 사이의 이온, 화학 물질 및 세포의 흐름은 이 장벽에 의해 엄격하게 조절됩니다. 이 항상성은 독소와 병원균으로부터 신경 조직을 보호하는 동시에 뇌 신경의 적절한 작동을 가능하게 합니다 ^2,3. BBB의 무결성을 유지하면 신경 기능 장애, 부종 및 신경 염증과 같은 중추 신경계에 영향을 미치는 장애의 발생 및 진행을 효과적으로 예방할 수 있습니다⁴. 그러나 BBB의 독특한 생리학적 특성으로 인해 저분자 약물의 98% 이상과 고분자 약물의 100% 이상이 중추신경계에 들어가는 것을 방지할 수 있다⁵. 따라서 중추 신경계에 대한 약물 개발 중에 BBB를 통한 약물 침투를 증가시키는 것은 치료 효능을 달성하는 데 필수적입니다 ^6,7. 기질의 컴퓨터 시뮬레이션 스크리닝으로 인해 약물 후보 물질이 BBB를 통....

프로토콜

참고: 마우스 뇌 유래 내피 세포.3(bEnd.3)을 24웰 플레이트의 챔버에 접종하여 특정 배지 조건에서 BBB의 간단한 시험관 내 모델을 구성했습니다. 정상 세포와 저산소 세포의 TEER은 TEER 미터로 측정하였다(도 1 및 도 2).

1. 용액 준비

1. FBS(10%, v/v), 100U/mL 페니실린 및 10mg/mL 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 세포 배양 배지를 준비합니다( 재료 표 참조).
2. 100μL DMSO 용액에 1.30mg_CoCl2를 첨가하여 100mM_CoCl2 원액을 준비합니다.
   참고: 위의 모든 용액을 4°C 조건에서 보관하고, 원액을 원하는 농도에 따라 희석한 후 사용하였다.
3. 5mL의 이중 증류수에 차아염소산나트륨 용액 2mL를 첨가하여 38% 차아염소산나트륨 용액(v/v)을 준비합니다.

2. 세포 배양 및 세포 생존력

1. 1 x 10

토론

가장 발달된 신체 기관 중 하나인 뇌는 기억, 인지, 청각, 후각, 운동 등 다양하고 복잡한 생리적 과정을 관장한다²⁷. 뇌는 인체에서 가장 복잡하고 병든 기관 중 하나이다. 많은 중추신경계 장애의 발생은 대기 오염, 불규칙한 식습관 및 기타 요인을 포함한 요인으로 인해 해마다 증가하는 경향을 보인다 27,28,29.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well transwell plate	Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm)	10522023
75 % ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
96-well plate	Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd	220412-078-B
bEnd.3 cells	Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd	CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8)	Boster Biological Technology Co., Ltd	BG0025
Cell culture dish (100mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	1192022
Cobalt Chloride (CoCl2)	Sigma	15862
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8121587
Fetal bovine serum	Gibco ThermoFisher Scientific	2166090RP
GraphPad Prism software	GraphPad Software	9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV)	MedChemexpress	HY-K6002
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)	Boster Biological Technology Co., Ltd	17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8120485
Sodium hypochlorite	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2022091501
Transmembrane resistance meter	World Precision Instruments LLC	VOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x)	HyClone	J210045