通过跨内皮电阻检测对bEnd.3血管内皮细胞进行屏障功能完整性记录

摘要

该协议描述了一种可靠且有效的脑血屏障 体外 模型。该方法使用小鼠脑血管内皮细胞bEnd.3并测量跨膜电阻。

摘要

血脑屏障（BBB）是由微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞组成的动态生理结构。通过协调有害物质的受限转运、营养吸收和大脑中代谢物清除之间的相互作用，血脑屏障对于维持中枢神经系统稳态至关重要。建立血脑屏障的 体外 模型是探索神经系统疾病的病理生理学和创建药物治疗的宝贵工具。本研究描述了一种通过将 bEnd.3 细胞接种到 24 孔板的上腔室中来创建 体外 单层 BBB 细胞模型的过程。为了评估细胞屏障功能的完整性，采用常规的上皮细胞电压表实时记录正常细胞和CoCl₂诱导的缺氧细胞的跨膜电阻。我们预计上述实验将为创建BBB的 体外 模型和治疗中枢神经系统疾病的药物提供有效的思路。

引言

血脑屏障是血液循环和神经组织之间独特的生物界面，由血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞、神经元和其他^{细胞结构组成}1。离子、化学物质和细胞在血液和大脑之间的流动受到该屏障的严格调节。这种稳态可以保护神经组织免受毒素和病原体的侵害，同时也使大脑神经能够正常运作^2,3。维持血脑屏障的完整性可以有效预防影响中枢神经系统的疾病的发展和进展，如神经元功能障碍、水肿和神经炎症⁴.然而，BBB独特的生理特性阻止了超过98%的小分子药物和100%的大分子药物进入中枢神经系统⁵。因此，在中枢神经系统药物开发过程中增加药物通过血脑屏障的渗透对于实现治疗效果至关重要 ^6,7。尽管底物的计算机模拟筛选大大提高了候选药物穿越 BBB 的概率，但仍需要可靠且负担得起的体外/体内 BBB 模型来满足科学研究的需要⁸。

一种快速且经济实惠的高通量药物筛选技术是体外模型⁹。为了阐明药物对血脑屏障功能影响的基本过程及其在疾病发展和进展中的作用，已经创建了一系列简化的体外血脑屏障模型。目前，常见的体外BBB模型有单层、共培养、动态和微流控模型10,11,12，^由血管内皮细胞和星形胶质细胞、周细胞或小胶质细胞^13,14构建。尽管 3D 细胞培养物更符合 BBB¹⁵ 的生理结构，但它们作为 BBB 药物筛选手段的应用仍然受到其复杂设计和低于标准的可重复性的限制。相比之下，单层体外模型是最常用于研究BBB的模型，适用于确定特定细胞中膜转运蛋白和紧密连接蛋白的表达。

跨膜电阻 （TEER） 测量是一种评估和监测电阻层的细胞层并评估屏障的细胞完整性和渗透性的技术。通过同时将两个电极插入单层两侧的生长培养基或缓冲溶液中，可以测量通过电池致密层^16,17的交流电或电阻抗。为了确定体外BBB模型是否已正确创建，TEER的测量通常将采用作为金标准¹⁸。另一方面，通过测量药物受累后细胞层电阻的变化，可以准确预测药物作用对BBB通透性的趋势¹⁹。例如，Feng等人发现，地黄科的主要活性单体楸波尔（地黄科的主要活性单体）可以有效逆转脂多糖诱导的血脑屏障中紧密连接蛋白的下调，提高小鼠脑内皮细胞层²⁰的TEER值。

神经炎症反应通常是血脑屏障稳态失衡的主要原因²¹.低氧治疗诱发神经炎症损伤是破坏血脑屏障的主要方法，主要包括物理方法和化学试剂方法。前者主要利用三气体培养箱来改变细胞生长环境中的氧含量以模拟缺氧条件²²，而后者是通过人为地将脱氧试剂（如CoCl₂）引入细胞培养基²³来实现的。如果 Fe²⁺ 被血红素中的 Co²⁺ 取代，细胞将保持脱氧状态。如果催化基团中的Fe²⁺被Co²⁺取代，则脯氨酸羟化酶和天冬氨酸羟化酶活性将受到抑制，导致缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）²⁴的积累。在持续缺氧下，细胞质中HIF-1α的去磷酸化触发细胞死亡并激活血管内皮生长因子，最终提高血管通透性。在先前的研究 ^25,26 中，已经充分证明缺氧可以显着降低内皮紧密连接蛋白的表达，从而增加 BBB 的通透性。在这项研究中，测量了接种在 24 孔板中的 bEnd.3 细胞的时间电阻曲线，以创建一个简单的 BBB 模型。使用该模型，我们表征了 CoCl₂ 干预后细胞 TEER 的变化，以构建可用于筛选 BBB 保护药物的细胞模型。

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研究方案

注:将小鼠脑源性内皮细胞.3 （bEnd.3） 接种到 24 孔板的腔室中，以在特定培养基条件下构建简单的 BBB 体外 模型。通过TEER仪测量正常细胞和缺氧细胞的TEER（图1 和 图2）。

1. 溶液制备

1. 制备含有FBS（10%，v / v），100U / mL青霉素和10mg / mL链霉素的DMEM细胞培养基（参见 材料表）。
2. 通过向 100 μL DMSO 溶液中加入 1.30 mg CoCl₂ 来制备 100 mM CoCl₂ 储备溶液。
   注:上述所有溶液均在4°C条件下储存，使用前根据所需浓度稀释储备溶液。
3. 通过将 2 mL 次氯酸钠溶液加入 38 mL 双蒸水中来制备 5% 次氯酸钠溶液 （v/v）。

2. 细胞培养和细胞活力

1. 在含有密度为1×10 6个细胞/mL的DMEM培养基的培养皿（100mm）中接种1mL bEnd.3细胞，并在37°C下在5%CO₂的湿化气氛中培养。每 2 至 3 天更换培养基，每周 2 次对细胞进行传代培养。
2. bEnd.3细胞生长至80%汇合后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞30秒。
3. 使用DMEM培养基通过细胞计数器制备密度为7 x 10⁴ 个细胞/mL的bEnd.3细胞悬浮液。然后，在 96 孔板中接种 100 μL bEnd.3 细胞悬液。
4. 细胞粘附后，用PBS清洁细胞，并在相同条件下用100μL培养基或含药物培养基（100μM，200μM，300μM，400μM，500μM CoCl₂）培养细胞24小时。除去孔板内的培养基并用PBS清洗后，加入100μLCCK-8溶液。
   注意: 不要在孔中产生气泡，这会影响光密度 （OD） 的值。
5. 将96孔板置于37°C环境中，孵育1小时。使用酶标仪测量96孔板在450nm处的吸光度。
   注意:为避免组内差异，在检测前将孔板冷却至室温。
6. 根据公式[OD_药物 - OD_空白]/[OD_对照 - OD_空白]×100%，计算不同浓度的CoCl₂诱导的细胞活力。选择与对照组相比，细胞活力降低有显着差异的CoCl₂浓度进行下一次实验。

3.模型组装

1. 用PBS冲洗24孔板的上腔室。
   注意:细胞在24孔板上腔室的底部生长和融合，细胞之间逐渐形成紧密的连接以发挥屏障作用。如果某些研究中使用的内皮细胞不能独立地在PET膜上形成完全屏障，则需要在细胞接种前用胶原IV溶液涂覆膜。
2. 使用涡旋混合器将 bEnd.3 细胞与 DMEM 培养基混合，以 5 x 10⁵ 个细胞/mL 的密度制成悬浮液。然后，在 24 孔板（0.33 cm 2,0.4 μm 膜孔径）的上腔室中的 PET 膜上接种 200 μL bEnd.3 细胞悬浮液。
   注:该方案的初步研究发现，当使用5至10次bEnd.3细胞进行实验时，结果没有差异。为确保建模成功的概率，请参考本协议的细胞数间隔。
3. 向板的下腔室中加入 1200 μL 完全培养基，以确保上下腔室的渗透压趋于稳定。根据类型，添加的培养基体积存在差异;确保上腔和下腔室的液位齐平。
4. 每天固定时间更换上腔室和下腔室的介质，同时监测电阻值。
   1. 更换培养基时，细胞层的完整性会因人工触摸或过度运动而受到破坏。为避免上述情况，用负压移液器从一侧缓慢去除旧介质，并在流体交换过程中沿壁缓慢添加新介质。

4. TEER的测量

1. 工作开始前，将电阻器、5% 次氯酸钠溶液、75% 乙醇和双蒸水溶液放入超净工作台中。打开紫外线照射 30 分钟以消除残留的细菌和病原体。
2. 将电极置于5%次氯酸钠溶液中，缓慢摇动3秒至5秒，然后浸入75%乙醇中15分钟。最后，转移到PBS或双蒸水溶液中直至使用。
3. 打开电池电阻表背面的开关，根据表1中的参数点击选择板，选择24孔板。
4. 根据操作需要，选择合适的检测顺序。我们在这项研究中选择了 A1 程序。
5. 将 kΩ 电阻插入右侧插头以校准仪器。如果校准结果为 1000 ± 5 Ω，则认为仪器的精度正常。
   1. 如果校准结果不是1000 Ω，点击主界面的 模式单位 选择 欧姆，再点击主界面的 校准 重新校准仪器。
6. 拉出右侧的kΩ电阻，用连接线替换测量电极。
7. 将电极放入 24 孔板中，不垂直接种细胞，然后单击仪器主屏幕上的 空白处理 。没有接种细胞的板抗性的背景值约为 134.4 Ω。
8. 将两个电极插入带有电池的播种板的上下腔室中，使电池层位于它们之间，然后轻轻踩 踏踏板记录电阻值。
   1. 确保电极不接触上腔室和下腔室底部的电池。电极在溶液中的浸泡时间对电阻值没有影响，只需要确保电极处于正确的位置即可。
9. 通过将电阻值（欧姆）乘以上腔室的底部面积（cm²）获得TEER值（Ωcm²），如等式所示:
   TEER （Ωcm²） = 电阻 （Ω） x S_插件 （cm²）
10. 绘制 TEER-Time 的折线图（以天为单位）。当电阻值没有随时间进一步增加（以天为单位测量）时，考虑细胞形成屏障。
    注意:bEnd.3 细胞的单层 BBB 模型将通过培养具有本研究中参数的 bEND.3 细胞约 6 天来成功构建。bEnd.3细胞单层模型的TEER范围为16.49±2.12 Ωcm² 至27.59±1.50 Ωcm^2,6 天内（n=8，平均值± SD）。

5. 屏障破坏和统计分析

1. 根据TEER-时间曲线，选择具有屏障功能的孔，并将其分为对照组和CoCl₂ 组（n=4）。
2. 将培养基和含有300μM CoCl₂ （200μL）的培养基分别加入对照组和CoCl₂ 组上腔。
3. 使用步骤4中描述的程序在37°C孵育的12小时和24小时检测对照组和CoCl₂ 组的电阻值。
4. 使用商业软件绘制用或不用 300 μM CoCl₂ 培养的细胞屏障的 TEER 值趋势。
5. 使用统计分析软件分析CoCl2处理的细胞与正常细胞之间的抗性值差异（n=4，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

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结果

该协议允许根据跨内皮电阻仪中设置的参数记录细胞电阻值的变化。采用CCK-8法筛选不同浓度CoCl₂处理的bEnd.3细胞（活细胞数）。CoCl₂ 产生的细胞损伤越大，细胞活力越低。我们发现 300 μM 的 CoCl₂ 在体外具有显着的细胞毒性，该浓度用于后续实验（图 3A）。通过监测bEnd.3的生长抗性变化，我们发现细胞TEER值在第^5天开始稳定。在第^{6 ...}

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讨论

大脑是最发达的身体器官之一，控制着各种复杂的生理过程，包括记忆、认知、听觉、嗅觉和运动²⁷.大脑是人体最复杂、最患病的器官之一。由于空气污染、饮食习惯不规律和其他因素，许多中枢神经系统疾病的发生呈逐年增长趋势 27,28,29。有趣的是，一些中枢神经系统疾病的开始和进展，如中风、癫痫和阿...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well transwell plate	Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm)	10522023
75 % ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
96-well plate	Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd	220412-078-B
bEnd.3 cells	Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd	CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8)	Boster Biological Technology Co., Ltd	BG0025
Cell culture dish (100mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	1192022
Cobalt Chloride (CoCl2)	Sigma	15862
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8121587
Fetal bovine serum	Gibco ThermoFisher Scientific	2166090RP
GraphPad Prism software	GraphPad Software	9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV)	MedChemexpress	HY-K6002
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)	Boster Biological Technology Co., Ltd	17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8120485
Sodium hypochlorite	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2022091501
Transmembrane resistance meter	World Precision Instruments LLC	VOM3 (verison 1.6)