Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı
Bu Makalede
Özet
Bu protokol, beyin kan bariyerinin güvenilir ve verimli bir in vitro modelini tanımlar. Yöntem, fare serebral vasküler endotel hücreleri bEnd.3'ü kullanır ve transmembran elektrik direncini ölçer.
Özet
Kan-beyin bariyeri (BBB), mikrovasküler endotel hücreleri, astrositler ve perisitlerden oluşan dinamik bir fizyolojik yapıdır. Zararlı maddelerin sınırlı geçişi, besin emilimi ve beyindeki metabolit klirensi arasındaki etkileşimi koordine ederek, BBB merkezi sinir sistemi homeostazının korunmasında esastır. BBB'nin in vitro modellerini oluşturmak, nörolojik bozuklukların patofizyolojisini araştırmak ve farmakolojik tedaviler oluşturmak için değerli bir araçtır. Bu çalışma, bEnd.3 hücrelerini 24 oyuklu bir plakanın üst odasına tohumlayarak in vitro tek katmanlı bir BBB hücre modeli oluşturmak için bir prosedürü açıklamaktadır. Hücre bariyeri fonksiyonunun bütünlüğünü değerlendirmek için, normal hücrelerin ve CoCl2 ile indüklenen hipoksik hücrelerin transmembran elektrik direncini gerçek zamanlı olarak kaydetmek için geleneksel epitel hücre voltmetresi kullanıldı. Yukarıdaki deneylerin, merkezi sinir sistemi hastalıklarının bozukluklarını tedavi etmek için in vitro BBB ve ilaç modellerinin oluşturulması için etkili fikirler sağlayacağını tahmin ediyoruz.
Giriş
BBB, vasküler endotel hücreleri, perisitler, astrositler, nöronlar ve diğer hücresel yapılardan oluşan kan dolaşımı ve sinir dokusu arasında benzersiz bir biyolojik arayüzdür1. Kan ve beyin arasındaki iyonların, kimyasalların ve hücrelerin akışı bu bariyer tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bu homeostaz, sinir dokularını toksinlere ve patojenlere karşı korurken, aynı zamanda beyin sinirlerinin uygun şekilde çalışmasını sağlar 2,3. BBB'nin bütünlüğünün korunması, nöronal disfonksiyon, ödem ve nöroinflamasyon gibi merkezi sinir sistemini etkileyen bozuklukların gelişmesini ve ilerlem....
Protokol
NOT: Fare beyninden türetilen Endotel hücreleri.3 (bEnd.3), belirli ortam koşulları altında basit bir in vitro BBB modeli oluşturmak için 24 oyuklu bir plakanın odalarına aşılandı. Normal hücrelerin ve hipoksik hücrelerin TEER metresi ile ölçüldü (Şekil 1 ve Şekil 2).
1. Çözelti hazırlama
- FBS (% 10, v / v), 100 U / mL penisilin ve 10 mg / mL streptomisin içeren DMEM hücre kültürü ortamını hazırlayın (bkz.
- 100 μL DMSO çözeltisine 1.30 mg CoCl 2ekleyerek 100 mM CoCl2 stok çözeltisi hazırlayın.
NOT....
Temsili Sonuçlar
Bu protokol, transendotelyal direnç ölçerde ayarlanan parametrelere göre hücrelerin direnç değerlerindeki değişikliklerin kaydedilmesine izin verdi. Farklı konsantrasyonlarda CoCl2 ile muamele edilen bEnd.3 hücrelerinin (canlı hücre sayısı) canlılığı CCK-8 testi ile tarandı. CoCl2 tarafından üretilen daha büyük hücre hasarı, daha düşük hücre canlılığı ile temsil edildi. 300 μMCoCl2'nin in vitro olarak önemli ölçüde sitotoksik olduğunu buldu.......
Tartışmalar
En gelişmiş vücut organlarından biri olan beyin, hafıza, biliş, işitme, koku alma ve hareket dahil olmak üzere çok çeşitli karmaşık fizyolojik süreçleri kontrol eder27. Beyin aynı zamanda insan vücudunun en karmaşık ve hastalıklı organlarından biridir. Birçok merkezi sinir sistemi bozukluğunun ortaya çıkması, hava kirliliği, düzensiz beslenme alışkanlıkları ve diğer faktörler gibi faktörlere bağlı olarak yıldan yıla artan bir eğilim göstermektedir 27,28,29.......
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (82274207 ve 82104533), Ningxia'nın Temel Araştırma ve Geliştirme Programı'nın (2023BEG02012) ve TCM Chengdu Üniversitesi'nin (XKTD2022013) Xinglin Scholar Araştırma Teşvik Projesi'nin mali desteğini takdir ediyoruz.
....Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
Referanslar
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al.
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiDaha Fazla Makale Keşfet
This article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır