Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein zuverlässiges und effizientes In-vitro-Modell der Blutschranke des Gehirns. Die Methode verwendet zerebrale vaskuläre Endothelzellen der Maus bEnd.3 und misst den elektrischen Widerstand der Transmembran.

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine dynamische physiologische Struktur, die aus mikrovaskulären Endothelzellen, Astrozyten und Perizyten besteht. Durch die Koordination der Wechselwirkung zwischen dem eingeschränkten Transit von Schadstoffen, der Nährstoffaufnahme und der Metaboliten-Clearance im Gehirn ist die BHS für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Zentralnervensystems unerlässlich. Die Erstellung von In-vitro-Modellen der BHS ist ein wertvolles Werkzeug zur Erforschung der Pathophysiologie neurologischer Erkrankungen und zur Entwicklung pharmakologischer Behandlungen. Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Erstellung eines in vitro Monolayer-BHS-Zellmodells durch Aussaat von bEnd.3-Zellen in die obere Kammer einer 24-Well-Platte. Um die Integrität der Zellbarrierefunktion zu beurteilen, wurde das konventionelle Epithelzellvoltmeter verwendet, um den transmembranellen elektrischen Widerstand von normalen Zellen und CoCl 2-induzierten hypoxischen Zellen in Echtzeit aufzuzeichnen. Wir gehen davon aus, dass die oben genannten Experimente effektive Ideen für die Erstellung von In-vitro-Modellen für BHS und Medikamente zur Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems liefern werden.

Einleitung

BHS ist eine einzigartige biologische Schnittstelle zwischen Blutkreislauf und Nervengewebe, die aus vaskulären Endothelzellen, Perizyten, Astrozyten, Neuronen und anderen zellulären Strukturen besteht¹. Der Fluss von Ionen, Chemikalien und Zellen zwischen Blut und Gehirn wird durch diese Barriere streng reguliert. Diese Homöostase schützt das Nervengewebe vor Toxinen und Krankheitserregern und ermöglicht gleichzeitig die entsprechende Funktion der Nerven des Gehirns ^2,3. Die Aufrechterhaltung der Integrität der BHS kann die Entwicklung und das Fortschreiten von Störungen, die das zentr....

Protokoll

ANMERKUNG: Aus dem Gehirn von Mäusen gewonnene Endothelzellen.3 (bEnd.3) wurden in die Kammern einer 24-Well-Platte inokuliert, um ein einfaches In-vitro-Modell der BHS unter bestimmten Mediumbedingungen zu konstruieren. Die TEER von normalen Zellen und hypoxischen Zellen wurden mit einem TEER-Messgerät gemessen (Abbildung 1 und Abbildung 2).

1. Vorbereitung der Lösung

1. Bereiten Sie das DMEM-Zellkulturmedium vor, das FBS (10 %, v/v), 100 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin enthält (siehe Materialtabelle).
2. Bereiten ....

Diskussion

Das Gehirn ist eines der am weitesten entwickelten Körperorgane und steuert eine Vielzahl komplizierter physiologischer Prozesse, darunter Gedächtnis, Kognition, Hören, Riechen und Bewegung²⁷. Das Gehirn ist eines der kompliziertesten und zugleich am meisten erkrankten Organe des menschlichen Körpers. Das Auftreten vieler Erkrankungen des Zentralnervensystems zeigt eine wachsende Tendenz von Jahr zu Jahr, was auf Faktoren wie Luftverschmutzung, unregelmäßiges Essverhalten und andere Faktoren.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well transwell plate	Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm)	10522023
75 % ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
96-well plate	Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd	220412-078-B
bEnd.3 cells	Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd	CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8)	Boster Biological Technology Co., Ltd	BG0025
Cell culture dish (100mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	1192022
Cobalt Chloride (CoCl2)	Sigma	15862
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8121587
Fetal bovine serum	Gibco ThermoFisher Scientific	2166090RP
GraphPad Prism software	GraphPad Software	9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV)	MedChemexpress	HY-K6002
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)	Boster Biological Technology Co., Ltd	17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8120485
Sodium hypochlorite	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2022091501
Transmembrane resistance meter	World Precision Instruments LLC	VOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x)	HyClone	J210045