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Resumen

Este protocolo describe un modelo in vitro fiable y eficiente de la barrera hematoencefálica. El método utiliza células endoteliales vasculares cerebrales de ratón bEnd.3 y mide la resistencia eléctrica transmembrana.

Resumen

La barrera hematoencefálica (BHE) es una estructura fisiológica dinámica compuesta por células endoteliales microvasculares, astrocitos y pericitos. Al coordinar la interacción entre el tránsito restringido de sustancias nocivas, la absorción de nutrientes y la eliminación de metabolitos en el cerebro, la BHE es esencial para preservar la homeostasis del sistema nervioso central. La construcción de modelos in vitro de la BHE es una herramienta valiosa para explorar la fisiopatología de los trastornos neurológicos y crear tratamientos farmacológicos. Este estudio describe un procedimiento para crear un modelo de células BBB monocapa in vitro mediante la siembra de células bEnd.3 en la cámara superior de una placa de 24 pocillos. Para evaluar la integridad de la función de barrera celular, se utilizó el voltímetro de celda epitelial convencional para registrar la resistencia eléctrica transmembrana de las células normales y las células hipóxicas inducidas por CoCl2 en tiempo real. Anticipamos que los experimentos anteriores proporcionarán ideas efectivas para la creación de modelos in vitro de BHE y medicamentos para tratar trastornos de enfermedades del sistema nervioso central.

Introducción

La BHE es una interfaz biológica única entre la circulación sanguínea y el tejido nervioso, que está compuesta por células endoteliales vasculares, pericitos, astrocitos, neuronas yotras estructuras celulares. El flujo de iones, sustancias químicas y células entre la sangre y el cerebro está estrictamente regulado por esta barrera. Esta homeostasis protege los tejidos nerviosos contra toxinas y patógenos, al tiempo que permite el funcionamiento adecuado de los nervios del cerebro 2,3. Mantener la integridad de la BHE puede prevenir eficazmente el desarrollo y la progresión de trastornos que afectan al sistema nervioso central, como la disfunción neuronal, el edema y la neuroinflamación. Sin embargo, las propiedades fisiológicas únicas de la BHE impiden que más del 98% de los medicamentos de moléculas pequeñas y el 100% de los productos farmacéuticos macromoleculares entren enel sistema nervioso central. Por lo tanto, el aumento de la penetración de los medicamentos a través de la BHE durante el desarrollo de fármacos para el sistema nervioso central es esencial para alcanzar la eficacia terapéutica 6,7. A pesar de que el cribado por simulación informática de sustratos ha aumentado significativamente la probabilidad de que los candidatos a fármacos crucen la barrera hematoencefálica, todavía se necesitan modelos fiables y asequibles in vitro/in vivo de la BHE para satisfacer las necesidades de la investigación científica8.

Una técnica rápida y asequible para el cribado de fármacos de alto rendimiento es el modelo in vitro 9. Para arrojar luz sobre los procesos fundamentales de los efectos de los medicamentos sobre la función de la BHE y su papel en el desarrollo y la progresión de la enfermedad, se han creado una serie de modelos simplificados de BHE in vitro. En la actualidad, los modelos más comunes de BHE in vitro son los modelos monocapa, cocultivo, dinámico y microfluídico 10,11,12, construidos por células endoteliales vasculares y astrocitos, pericitos o microglía 13,14. Aunque los cultivos celulares 3D están más en línea con la estructura fisiológica de la barrera hematoencefálica15, su aplicación como medio de detección de fármacos para la barrera hematoencefálica sigue estando limitada por su intrincado diseño y su deficiente reproducibilidad. Por el contrario, el modelo monocapa in vitro es el más utilizado para investigar la BHE y es aplicable para determinar la expresión de transportadores de membrana y proteínas de unión estrecha en células particulares.

La medición de la resistencia eléctrica transmembrana (TEER) es una técnica para evaluar y monitorear la capa de células a través de la resistencia y evaluar la integridad celular y la permeabilidad de la barrera. Al insertar simultáneamente dos electrodos en el medio de crecimiento o en la solución tampón a cada lado de la monocapa, es posible medir la corriente alterna o la impedancia eléctrica a través de la capa compacta de la célula16,17. Con el fin de determinar si el modelo de BHE in vitro se ha creado correctamente, la medición de TEER se empleará generalmente como el estándar de oro18. Por otro lado, la tendencia de la acción de la medicación sobre la permeabilidad de la BHE puede predecirse con precisión midiendo el cambio en la resistencia eléctrica de la capa celular después de la afectación del fármaco19. Por ejemplo, Feng et al. descubrieron que el catalpol (el monómero activo primario de rehmanniae) podría revertir eficazmente la regulación a la baja inducida por lipopolisacáridos de las proteínas de unión estrecha en la BHE y aumentar el valor TEER de la capa20 de células endoteliales del cerebro de ratón.

La respuesta neuroinflamatoria suele ser la principal causa del desequilibrio de la homeostasis de la BHE21. El tratamiento hipóxico para inducir lesiones neuroinflamatorias es el principal método para destruir la barrera hematoencefálica, incluyendo principalmente métodos físicos y métodos de reactivos químicos. El primero utiliza principalmente una incubadora de tres gases para variar el contenido de oxígeno en el entorno de crecimiento celular para simular condiciones hipóxicas22, mientras que el segundo se logra mediante la introducción artificial de reactivos desoxi como el CoCl2 en el medio de cultivo celular23. Las células permanecerán en una condición desoxigenada si el Fe2+ se sustituye por Co2+ en el hemo. Si el Fe2+ es sustituido por el Co2+ en el grupo catalítico, la actividad de la prolina hidroxilasa y la aspartato hidroxilasa se inhibirá, lo que resultará en una acumulación del factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α)24. Bajo hipoxia persistente, la desfosforilación de HIF-1α en el citoplasma desencadena la muerte celular y activa el factor de crecimiento endotelial vascular, lo que en última instancia aumenta la permeabilidad vascular. En estudios previos25,26, se ha demostrado que la hipoxia puede reducir significativamente la expresión de proteínas de unión estrecha endotelial para aumentar la permeabilidad de la BHE. En este estudio, se midió la curva de resistencia temporal de las células bEnd.3 sembradas en placas de 24 pocillos para crear un modelo BBB sencillo. Utilizando este modelo, caracterizamos los cambios en el TEER celular después de la intervención con CoCl2 con el fin de construir un modelo celular que pueda utilizarse para detectar fármacos para la protección de la BHE.

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Protocolo

NOTA: Se inocularon células endoteliales derivadas del cerebro de ratón.3 (bEnd.3) en las cámaras de una placa de 24 pocillos para construir un modelo in vitro simple de BHE en condiciones específicas del medio. Los TEER de células normales e hipóxicas se midieron con medidor TEER (Figura 1 y Figura 2).

1. Preparación de la solución

  1. Prepare el medio de cultivo celular DMEM que contenga FBS (10%, v/v), 100 U/mL de penicilina y 10 mg/mL de estreptomicina (ver Tabla de Materiales).
  2. Prepare 100 mM de solución madre de CoCl2 añadiendo 1,30 mg de CoCl2 a 100 μL de solución de DMSO.
    NOTA: Todas las soluciones anteriores se almacenaron a 4 °C y la solución madre se diluyó de acuerdo con la concentración deseada antes de su uso.
  3. Prepare una solución de hipoclorito de sodio al 5% (v/v) agregando 2 ml de solución de hipoclorito de sodio a 38 ml de agua bidestilada.

2. Cultivo celular y viabilidad celular

  1. Siembre 1 mL de células bEnd.3 en placa de cultivo (100 mm) que contenga medio DMEM a una densidad de 1 x 106 células/mL y cultivo a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% CO2. Cambie el medio cada 2 o 3 días y subcultive las células 2 veces por semana.
  2. Después de que las células bEnd.3 crezcan hasta una confluencia del 80 %, digiera las células con tripsina al 0,25 % durante 30 s.
  3. Realice una suspensión de células bEnd.3 a una densidad de 7 x 104 células/ml utilizando medio DMEM a través de un contador de células. A continuación, siembre 100 μL de suspensión celular bEnd.3 en una placa de 96 pocillos.
  4. Después de la adhesión celular, limpie las células con PBS y cultive las células con 100 μL de medio de cultivo o medio que contenga fármaco (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) durante 24 h en las mismas condiciones. Después de retirar el medio dentro de la placa de pocillos y limpiarlo con PBS, agregue 100 μL de solución CCK-8.
    NOTA: No genere burbujas en el pocillo, que afectarán los valores de densidad óptica (DO).
  5. Coloque placas de 96 pocillos a un ambiente de 37 °C e incube durante 1 h. Mida la absorbancia de las placas de 96 pocillos a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
    NOTA: Para evitar diferencias dentro del grupo, las placas de pocillos se enfriaron a temperatura ambiente antes de la detección.
  6. Calcular la viabilidad celular inducida por diferentes concentraciones de CoCl2 según la fórmula [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Seleccione la concentración de CoCl2 con una diferencia significativa en la reducción de la viabilidad celular en comparación con el grupo de control para el siguiente experimento.

3. Montaje del modelo

  1. Enjuague la cámara superior de las placas de 24 pocillos con PBS.
    NOTA: Las células crecieron y se fusionaron en la parte inferior de la cámara superior de la placa de 24 pocillos, y las uniones estrechas entre las células se formaron gradualmente para desempeñar un papel de barrera. Si las células endoteliales utilizadas en algunos estudios no son capaces de formar una barrera completa en las membranas de PET de forma independiente, es necesario recubrir las membranas con una solución de colágeno IV antes de la inoculación celular.
  2. Mezcle las celdas bEnd.3 con medio DMEM para hacer una suspensión a una densidad de 5 x 105 celdas/mL usando un mezclador de vórtice. A continuación, siembre 200 μL de suspensión celular bEnd.3 en la membrana PET en la cámara superior de una placa de 24 pocillos (0,33 cm2, tamaño de poro de la membrana de 0,4 μm).
    NOTA: El estudio piloto de este protocolo no encontró diferencias en los resultados cuando se utilizaron de 5 a 10 pasajes de células bEnd.3 para experimentos. Para garantizar la probabilidad de un modelado exitoso, consulte el intervalo de número de celda de este protocolo.
  3. Agregue 1200 μL de medio completo a la cámara inferior de la placa para asegurarse de que la presión osmótica de las cámaras superior e inferior tienda a estabilizarse. Existen diferencias en el volumen de medio añadido según el tipo; Asegúrese de que el nivel de líquido de las cámaras superior e inferior esté al ras del suelo.
  4. Cambie el medio de la cámara superior y la cámara inferior a una hora fija todos los días y controle el valor de resistencia al mismo tiempo.
    1. Al cambiar el medio, la integridad de la capa celular se dañará por el tacto artificial o el movimiento excesivo. Para evitar la situación anterior, retire lentamente el medio viejo de un lado con una pipeta de presión negativa y agregue lentamente un medio nuevo a lo largo de la pared durante el intercambio de fluidos.

4. Medición de TEER

  1. Antes de comenzar el trabajo, coloque la resistencia, la solución de hipoclorito de sodio al 5%, el etanol al 75% y la solución de agua destilada doble en una mesa ultralimpia. Encienda la irradiación UV durante 30 minutos para eliminar las bacterias y patógenos residuales.
  2. Coloque los electrodos en una solución de hipoclorito de sodio al 5% con agitación lenta durante 3 s a 5 s, y luego sumérjalos en etanol al 75% durante 15 min. Finalmente, transfiera a PBS o solución de agua doblemente destilada hasta su uso.
  3. Encienda el interruptor en la parte posterior del medidor de resistencia de celda, haga clic en Seleccionar placa de acuerdo con los parámetros de la Tabla 1 y seleccione Placa de 24 pocillos.
  4. De acuerdo con las necesidades de operación, seleccione la secuencia de detección adecuada. En este estudio se seleccionó el procedimiento A1 .
  5. Inserte una resistencia kΩ en el enchufe derecho para calibrar el instrumento. Si el resultado de la calibración es de 1000 ± 5 Ω, considere que la precisión del instrumento es normal.
    1. Si el resultado de la calibración no es de 1000 Ω, haga clic en Unidades de modo en la interfaz principal para seleccionar OHMS y, a continuación, haga clic en Calibrar en la pantalla principal para volver a calibrar el instrumento.
  6. Extraiga la resistencia kΩ del lado derecho y sustituya el electrodo de medición por un cable de conexión.
  7. Coloque el electrodo en la placa de 24 pocillos sin sembrar celdas verticalmente y haga clic en Manipulación de piezas en bruto en la pantalla principal del instrumento. El valor de fondo de la resistencia de la placa sin células sembradas es de aproximadamente 134,4 Ω.
  8. Inserte los dos electrodos en las cámaras superior e inferior de la placa sembrada con celdas de modo que la capa de celdas quede entre ellas, y luego registre el valor de resistencia pisando suavemente el pedal.
    1. Asegúrese de que el electrodo no toque las celdas de la cámara superior y la parte inferior de la cámara inferior. El tiempo de remojo del electrodo en la solución no tiene ningún efecto sobre el valor de resistencia, y solo es necesario asegurarse de que el electrodo esté en la posición correcta.
  9. Obtener los valores de TEER (Ωcm2) multiplicando los valores de resistencia eléctrica (ohmios) por el área inferior (cm2) de la cámara superior, como en la ecuación:
    TEER (Ωcm2) = Resistencia (Ω) xinserto S (cm2)
  10. Dibuje un gráfico de líneas de TEER-Time (en días). Cuando el valor de resistencia no aumenta más con el tiempo (medido a lo largo de días), considere que la celda formó una barrera.
    NOTW: El modelo monocapa BBB de células bEnd.3 se construirá con éxito mediante el cultivo de células bEND.3 con los parámetros de este estudio durante unos 6 días. El TEER del modelo monocapa de células bEnd.3 osciló entre 16,49 ± 2,12Ωcm2 y 27,59 ± 1,50Ωcm2 en 6 días (n=8, media ± DE).

5. Destrucción de barreras y análisis estadístico

  1. De acuerdo con la curva TEER - tiempo, seleccione los pozos con función barrera y divídalos en el grupo control y el grupo CoCl2 (n = 4).
  2. Añadir el medio de cultivo y el medio de cultivo que contienen 300 μM de CoCl2 (200 μL) en la cámara superior del grupo control y del grupo CoCl2 , respectivamente.
  3. Detectar los valores de resistencia de los grupos control y CoCl2 a las 12 h y a las 24 h de incubación a 37 °C mediante el procedimiento descrito en el paso 4.
  4. Utilice software comercial para mapear la tendencia de los valores de TEER de la barrera de células cultivadas con o sin 300 μM de CoCl2.
  5. Utilice un software de análisis estadístico para analizar la diferencia en los valores de resistencia entre las células tratadas con CoCl2 y las células normales (n = 4, * p< 0,05, ** p<0,01, *** p<0,001).

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Resultados

Este protocolo permitió el registro de cambios en los valores de resistencia de las celdas de acuerdo con los parámetros establecidos en el medidor de resistencia transendotelial. La viabilidad de las células bEnd.3 (número de células vivas) tratadas con diferentes concentraciones de CoCl2 se examinó mediante el ensayo CCK-8. El mayor daño celular producido por el CoCl2 estuvo representado por una menor viabilidad celular. Encontramos que 300 μM de CoCl2 eran significativamente ci...

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Discusión

El cerebro, uno de los órganos corporales más desarrollados, controla una amplia gama de intrincados procesos fisiológicos, como la memoria, la cognición, la audición, el olfato yel movimiento. El cerebro es uno de los órganos más complicados y enfermos del cuerpo humano al mismo tiempo. La aparición de muchos trastornos del sistema nervioso central muestra una tendencia creciente año tras año debido a factores como la contaminación del aire, los patrones de alimentación irregulares y ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82274207 y 82104533), el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Ningxia (2023BEG02012) y el Proyecto de Promoción de la Investigación Xinglin Scholar de la Universidad de MTC de Chengdu (XKTD2022013).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well transwell plateCorning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm)10522023
75 % ethanolChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd2023052901
96-well plateGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd220412-078-B
bEnd.3 cellsHunan Fenghui Biotechnology Co., LtdCL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8)Boster Biological Technology Co., LtdBG0025
Cell culture dish (100mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd1192022
Cobalt Chloride (CoCl2)Sigma15862
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)Gibco ThermoFisher Scientific8121587
Fetal bovine serumGibco ThermoFisher Scientific2166090RP
GraphPad Prism softwareGraphPad Software9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV)MedChemexpressHY-K6002
Microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
OriginPro 8 softwareOriginLab Corporationv8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)Boster Biological Technology Co., Ltd17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x)Gibco ThermoFisher Scientific8120485
Sodium hypochloriteChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd2022091501
Transmembrane resistance meterWorld Precision Instruments LLCVOM3 (verison 1.6)

Referencias

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