Registro de la integridad funcional de la barrera en las células endoteliales vasculares bEnd.3 mediante detección de resistencia eléctrica transendotelial

Resumen

Este protocolo describe un modelo in vitro fiable y eficiente de la barrera hematoencefálica. El método utiliza células endoteliales vasculares cerebrales de ratón bEnd.3 y mide la resistencia eléctrica transmembrana.

Resumen

La barrera hematoencefálica (BHE) es una estructura fisiológica dinámica compuesta por células endoteliales microvasculares, astrocitos y pericitos. Al coordinar la interacción entre el tránsito restringido de sustancias nocivas, la absorción de nutrientes y la eliminación de metabolitos en el cerebro, la BHE es esencial para preservar la homeostasis del sistema nervioso central. La construcción de modelos in vitro de la BHE es una herramienta valiosa para explorar la fisiopatología de los trastornos neurológicos y crear tratamientos farmacológicos. Este estudio describe un procedimiento para crear un modelo de células BBB monocapa in vitro mediante la siembra de células bEnd.3 en la cámara superior de una placa de 24 pocillos. Para evaluar la integridad de la función de barrera celular, se utilizó el voltímetro de celda epitelial convencional para registrar la resistencia eléctrica transmembrana de las células normales y las células hipóxicas inducidas por CoCl₂ en tiempo real. Anticipamos que los experimentos anteriores proporcionarán ideas efectivas para la creación de modelos in vitro de BHE y medicamentos para tratar trastornos de enfermedades del sistema nervioso central.

Introducción

La BHE es una interfaz biológica única entre la circulación sanguínea y el tejido nervioso, que está compuesta por células endoteliales vasculares, pericitos, astrocitos, neuronas y^{otras estructuras} celulares. El flujo de iones, sustancias químicas y células entre la sangre y el cerebro está estrictamente regulado por esta barrera. Esta homeostasis protege los tejidos nerviosos contra toxinas y patógenos, al tiempo que permite el funcionamiento adecuado de los nervios del cerebro ^2,3. Mantener la integridad de la BHE puede prevenir eficazmente el desarrollo y la progresión de trastornos....

Protocolo

NOTA: Se inocularon células endoteliales derivadas del cerebro de ratón.3 (bEnd.3) en las cámaras de una placa de 24 pocillos para construir un modelo in vitro simple de BHE en condiciones específicas del medio. Los TEER de células normales e hipóxicas se midieron con medidor TEER (Figura 1 y Figura 2).

1. Preparación de la solución

1. Prepare el medio de cultivo celular DMEM que contenga FBS (10%, v/v), 100 U/mL de penicilina y 10 mg/mL de estreptomicina (ver Tabla de Materiales).
2. Prepare 100 mM de solución madre de CoCl<....

Discusión

El cerebro, uno de los órganos corporales más desarrollados, controla una amplia gama de intrincados procesos fisiológicos, como la memoria, la cognición, la audición, el olfato y^{el movimiento.} El cerebro es uno de los órganos más complicados y enfermos del cuerpo humano al mismo tiempo. La aparición de muchos trastornos del sistema nervioso central muestra una tendencia creciente año tras año debido a factores como la contaminación del aire, los patrones de alimentación irregulares y .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well transwell plate	Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm)	10522023
75 % ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
96-well plate	Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd	220412-078-B
bEnd.3 cells	Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd	CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8)	Boster Biological Technology Co., Ltd	BG0025
Cell culture dish (100mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	1192022
Cobalt Chloride (CoCl2)	Sigma	15862
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8121587
Fetal bovine serum	Gibco ThermoFisher Scientific	2166090RP
GraphPad Prism software	GraphPad Software	9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV)	MedChemexpress	HY-K6002
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)	Boster Biological Technology Co., Ltd	17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8120485
Sodium hypochlorite	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2022091501
Transmembrane resistance meter	World Precision Instruments LLC	VOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x)	HyClone	J210045