経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

要約

このプロトコルは脳の血液関門の信頼できる、有効な 生体外 モデルを記述する。この方法では、マウスの脳血管内皮細胞bEnd.3を使用し、膜貫通電気抵抗を測定します。

要約

血液脳関門(BBB)は、微小血管内皮細胞、星状細胞、および周皮細胞で構成される動的な生理学的構造です。BBBは、有害物質の輸送制限、栄養素の吸収、および脳内の代謝産物クリアランスの間の相互作用を調整することにより、中枢神経系の恒常性を維持するために不可欠です。BBBの in vitro モデルの構築は、神経疾患の病態生理学を探求し、薬理学的治療法を作成するための貴重なツールです。この研究では、bEnd.3細胞を24ウェルプレートの上部チャンバーに播種することにより、 in vitro 単層BBB細胞モデルを作成する手順について説明します。細胞バリア機能の完全性を評価するために、従来の上皮細胞電圧計を使用して、正常細胞とCoCl₂誘導低酸素細胞の膜貫通電気抵抗をリアルタイムで記録しました。以上の実験は、BBBの in vitro モデルや中枢神経系疾患の治療薬の創製に有効なアイデアを提供することが期待されます。

概要

BBBは、血管内皮細胞、周皮細胞、星状膠細胞、ニューロン、その他の細胞構造で構成される血液循環と神経組織の間のユニークな生物学的インターフェースです¹。血液と脳の間のイオン、化学物質、細胞の流れは、このバリアによって厳密に制御されています。このホメオスタシスは、毒素や病原体から神経組織を保護すると同時に、脳の神経の適切な操作を可能にします^2,3。BBBの完全性を維持することで、神経機能障害、浮腫、神経炎症など、中枢神経系に影響を与える疾患の発症と進行を効果的に防ぐ^{ことができます4。}しかし、BBBのユニークな生理学的特性により、低分子医薬品の98%以上、高分子医薬品の100%が中枢神経系に入るのを防ぎます⁵。したがって、中枢神経系の薬剤の開発中にBBBを介した薬剤の浸透性を高めることは、治療効果を達成するために不可欠です^6,7。基質のコンピューターシミュレーションスクリーニングにより、医薬品候補がBBBを通過する確率が大幅に向上しましたが、科学研究のニーズを満たすためには、信頼性が高く手頃な価格のin vitro/in vivo

プロトコル

注:マウス脳由来内皮細胞.3(bEnd.3)を24ウェルプレートのチャンバーに接種し、特定の培地条件下でBBBの単純な in vitro モデルを構築しました。正常細胞と低酸素細胞のTEERをTEERメーターで測定しました(図1 、 図2)。

1. 溶液調製

1. FBS(10%、v/v)、100 U/mLペニシリン、および10 mg/mLストレプトマイシンを含むDMEM細胞培養培地を調製します( 材料表を参照)。
2. 100 μL の DMSO 溶液に 1.30 mg の CoCl₂ を添加して、100 mM CoCl₂ ストック溶液を調製します。
   注:上記の溶液はすべて4°C条件で保存し、原液は使用前に所望の濃度に従って希釈しました。
3. 2mLの次亜塩素酸ナトリウム溶液を38mLの二重蒸留水に加えて、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液(v/v)を調製します。

2. 細胞培養と細胞生存率

1. 1 mLのbEnd.3細胞をDMEM培地を含む培養皿(100 mm)に1 ....

ディスカッション

最も発達した身体器官の1つである脳は、記憶、認知、聴覚、嗅覚、運動など、さまざまな複雑な生理学的プロセスを制御しています²⁷。脳は、人体で最も複雑で病気の器官の1つであると同時に、人体で最も複雑で病気の器官の1つです。多くの中枢神経系疾患の発生は、大気汚染、不規則な食事パターン、およびその他の要因を含む要因により、年々増加傾向を示していま?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well transwell plate	Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm)	10522023
75 % ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
96-well plate	Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd	220412-078-B
bEnd.3 cells	Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd	CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8)	Boster Biological Technology Co., Ltd	BG0025
Cell culture dish (100mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	1192022
Cobalt Chloride (CoCl2)	Sigma	15862
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8121587
Fetal bovine serum	Gibco ThermoFisher Scientific	2166090RP
GraphPad Prism software	GraphPad Software	9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV)	MedChemexpress	HY-K6002
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)	Boster Biological Technology Co., Ltd	17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8120485
Sodium hypochlorite	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2022091501
Transmembrane resistance meter	World Precision Instruments LLC	VOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x)	HyClone	J210045