Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نوضح هنا تقنية استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على المعاوقة: ECIS و cellZscope ، لقياس قوة الحاجز البطاني للدماغ. نحن بالتفصيل إعداد وتقنية إضافة محفزات مختلفة إلى نموذج في المختبر من بطانة الدماغ. نحن نقيس ونسجل ونقدم تحليلا تمثيليا للنتائج.

Abstract

يحمي الحاجز الدموي الدماغي (BBB) حمة الدماغ من مسببات الأمراض الضارة في الدم. يتكون BBB من وحدة الأوعية الدموية العصبية ، التي تضم pericytes ، وعمليات القدم النجمية ، والخلايا البطانية الملتصقة بإحكام. هنا ، تشكل الخلايا البطانية للدماغ الخط الأول من الحاجز ضد مسببات الأمراض المنقولة بالدم. في حالات مثل السرطان والتهاب الأعصاب ، يمكن للعوامل المنتشرة في الدم أن تعطل هذا الحاجز. يؤدي تطور المرض إلى تفاقم اضطراب ما بعد الحاجز بشكل كبير ، مما يسمح بالوصول إلى مناطق الدماغ أو ضعفها. هذا يؤدي إلى تفاقم التوقعات بشكل كبير ، لا سيما بسبب خيارات العلاج المحدودة المتاحة على مستوى الدماغ. ومن ثم ، تهدف الدراسات الناشئة إلى التحقيق في العلاجات المحتملة التي يمكن أن تمنع هذه العوامل الضارة في الدم من التفاعل مع الخلايا البطانية في الدماغ.

تقيس أجهزة استشعار مقاومة الخلايا والركيزة الكهربائية (ECIS) وأدوات cellZscope المتاحة تجاريا المقاومة عبر الطبقات الخلوية أحادية الطبقة ، مثل بطانة BBB ، لتحديد قوة حاجزها. هنا نوضح بالتفصيل استخدام كل من أجهزة الاستشعار الحيوية في تقييم سلامة الحاجز البطاني للدماغ عند إضافة محفزات مختلفة. بشكل حاسم ، نسلط الضوء على أهمية قدرتها عالية الإنتاجية للتحقيق المتزامن للمتغيرات المتعددة والعلاجات البيولوجية.

Introduction

تتناول هذه المقالة الاتجاهات الحالية في تقييم خلايا الأوعية الدموية الدقيقة. نحن نوضح بالتفصيل على وجه التحديد استخدام منصتين متاحتين تجاريا لقياس خصائص الحاجز الواقي للخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الدماغية. الخلايا البطانية هي خلايا مواجهة للدم، وتبطن جدار الوعاء الدموي. ومع ذلك ، فإن الأوعية الدقيقة الدماغية فريدة من نوعها لأنها تساعد في تشكيل الحاجز الدموي الدماغي الواقي (BBB) 1،2،3. يعمل BBB على تنظيم نقل الجزيئات من الدم إلى الدماغ. ترتبط الأمراض الطرفية التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS) عادة بالفشل الوظيفي ل BBB 4,5. الهياكل التشريحية التي تشكل BBB غير موجودة في واجهة أنسجة الدم في أي مكان آخر في الجسم6. تتكون هذه الهياكل التشريحية من الخلايا المحيطة ، التي تقع بالقرب من الخلايا البطانية للدماغ ، وتنظم تكاثرها ونفايتها. عمليات القدم النجمية ، التي تشارك في خلط المغذيات والدعم التشريحي 7,8 ؛ الخلايا الدبقية الصغيرة ، وهي الضامة المقيمة في الدماغ ، غالبا ما تكون متورطة في التهاب الأعصاب ونقص التروية9،10،11،12 ، وبطانة الدماغ ، التي تشكل طبقة أحادية من الخلايا الملتصقة بإحكام دون fenestrations13,14. تعرف بطانة الدماغ عادة باسم "الحاجز البطاني الدماغي" وتشكل حاجزا هيكليا ووظيفيا بخمس طرق متميزة. أولا ، يتكون مكون الحاجز شبه الخلوي عن طريق الالتصاق عند تقاطعات الخلايا الخلوية الجانبية. ثانيا ، يتم الحفاظ على مكون الحاجز عبر الخلايا من خلال تنظيم التداخل الخلوي. ثالثا ، يثبت الغشاء القاعدي المتخصص ويدعم البطانة عبر مصفوفة غنية خارج الخلية تتكون إلى حد كبير من الكولاجين15,16. الآليتان الأخيرتان هما من خلال الإنزيمات والناقلات التي تساعد على تنظيم عملية التمثيل الغذائي للأدوية وامتصاص الجزيئات الكبيرة ، على التوالي17.

تشكل التفاعلات شبه الخلوية المكون الرئيسي للحاجز البطاني للدماغ ، ويتم تسهيله بواسطة الوصلات الضيقة (TJs) ، والتي تضم بروتينات الغشاء claudins ، و occludin ، وجزيئات الالتصاق الموصلية (JAMs) 18. يشكل الارتباط المتجانس القوي للبروتينات الغشائية أول حاجز هيكلي ، على الرغم من أن JAMs ترتبط أيضا بالبروتينات الملحقة بانسداد المنطقة ، وبالتالي ربط TJs بالهيكل الخلوي للأكتين19,20. تضع روابط الأكتين TJs في المنطقة القمية من البطانة21 ، والتي تستقطب وظيفيا الخلايا البطانية لتشكيل الحاجز الهيكلي على هذا الجانب القمي أو "المواجه للدم". في المنطقة القاعدية من البطانة ، تلعب تقاطعات الالتصاق عالية التخصص (AJs) دورا تنظيميا في الحفاظ على مورفولوجيا الخلية. تتكون AJs من الكاديرين المعتمد على الكالسيوم ، والذي يربط الهيكل الخلوي للخلايا البطانية المجاورة من خلال مجمع عائلة الكاتينين20,22. الكاديرين البطاني الوعائي (VE-Cadherin) هو أحد هذه الكاديرين ، الذي ينظم التعبير عن بروتينات TJ ووظيفة الحاجز البطاني الشاملة للحفاظ على سلامة الطبقة الأحادية البطانية23،24،25،26،27. تشير المعدلات الالتهابية ، مثل عامل نخر الورم ألفا (TNFα) ، إلى استيعاب VE-cadherin بعيدا عن تقاطعات الخلايا ، مما يؤدي إلى زعزعة استقرار الحاجز البطاني28،29،30. جزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية (PECAM)31 هو كادهيرين AJ آخر يعمل على استقرار وإعادة تشكيل الوصلات البطانية32,33. تقيد كثافة هذه البروتينات الموصلية تدفق الإلكترونات عبر الفضاء شبه الخلوي بين الخلايا البطانية. تستخدم هذه السمة لقياس قوة الحاجز البطاني أو المقاومة الكهربائية عبر البطانة (TER) عبر أحاديات الخلايا المتقاربة مثل بطانة الدماغ.

تركز الدراسات العلاجية على بطانة الدماغ بسبب دورها الحيوي في واجهة الدم والدماغ. تؤثر العديد من الأمراض سلبا على بطانة الدماغ ، بما في ذلك حالات الالتهاب العصبي مثل التصلب المتعدد والسكتة الدماغية والأمراض التنكسية العصبية والسرطان34،35،36،37. بمجرد تعطل الحاجز البطاني للدماغ ، يزداد تطور المرض سوءا بشكل كبير حيث يتعرض الدماغ بشكل فعال للمنبهات الضارة في الدم38. لقد أظهرنا سابقا أن الوسطاء الالتهابيين وخلايا سرطان الجلد النقيلي تعطل الحاجز البطاني في الدماغ باستخدام تقنيتين تقيس قوة الحاجز البطاني39،40،41.

استشعار مقاومة الخلايا الخلوية الكهربائية (ECIS) هو مستشعر حيوي قائم على المعاوقة يسمح بتقييم في الوقت الفعلي وبدون تسمية لسلامة حاجز الخلية البطانية. هنا ، تصطف آبار الفحص بأقطاب كهربائية مطلية بالذهب ، والتي تقدم التيار المتردد (AC) إلى نظام الفحص. يتم زرع الخلايا البطانية للدماغ في هذه الآبار ، مما يعني أنه يمكن تطبيق AC من خلال الخلايا. (الشكل 1 أ - بئر ؛ منظر جانبي). هذا يحدد الدائرة الكهربائية ، والتي تستخدم لحساب المعاوقة (الشكل 1A- مخطط الدائرة). تزداد المعاوقة عندما تلتصق الخلايا البطانية للدماغ بالصفيحة وتبدأ في تكوين تقاطعاتها شبه الخلوية. هضبة المعاوقة عندما تصبح الخلايا البطانية متقاربة ، وتشكل طبقة أحادية ، وتقيد تدفق التيار. يؤثر تطبيق التيار المتردد على ترددات مختلفة على مسار تدفق التيار عبر الخلايا البطانية. يتدفق التيار عبر جسم الخلية البطانية عند تطبيقه بتردد أعلى (>104 هرتز). يوفر هذا معلومات عن سعة الطبقة الأحادية للخلية ، وتستخدم لتقييم ارتباط الخلية وانتشارها. عند الترددات المنخفضة (102-10 4 هرتز) تكون مقاومة الغشاء عالية ، مما يقيد تدفق التيار عبر الخلايا. في هذه الحالة ، يتنقل غالبية التيار بين الخلايا. عند حوالي 4000 هرتز ، تعزى مقاومة التدفق الحالي في الغالب إلى تقاطعات الخلايا البطانية ، عبر الفضاء بين الخلايا . لذلك ، فإن أي تغيير في المقاومة عند هذا التردد يوفر معلومات تتعلق بسلامة الحاجز البطاني.

في حين أن قياسات المعاوقة الخام يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لخصائص الحاجز ، يمكن لبرنامج ECIS بعد ذلك نمذجة المقاومة الكلية المقاسة عبر ترددات التيار المتردد المتعددة وبشكل أكثر دقة ، فصلها إلى معلمتين رئيسيتين لسلامة الحاجز. هذه المعلمات هي المقاومة شبه الخلوية بين الأغشية الجانبية للخلايا المجاورة (مقاومة بيتا Rb ؛ حاجز خلوي ؛ الشكل 1A-الأسهم الخضراء) ، والمقاومة القاعدية بين طبقة الخلية القاعدية والقطب (مقاومة ألفا ألفا ؛ حاجز قاعدي ؛ الشكل 1 أ - الأسهم الزرقاء). يتم قياس معلمة نموذجية ثالثة أيضا على أنها سعة غشاء الخلية (Cm; الشكل 1 أ - الأسهم الحمراء). يعرض Cm التدفق السعوي للتيار عبر الخلايا ، مما يدل على تكوين غشاء الخلية. هنا ، تشير التغييرات في Rb أو الحاجز شبه الخلوي إلى تغيرات في TJs و AJs ، وهي حاسمة في الحفاظ على سلامة الحاجز البطاني. لتفسير Rb بشكل موثوق ، تم وضع أربعة افتراضات رئيسية ، كما طورها Giaever و Keese42 وناقشها Stolwijk et al.43 بشكل نقدي. على الرغم من أن هذه الافتراضات مهمة لضمان صحة نمذجة ECIS ، إلا أنها تتحقق بسهولة من خلال طبقة أحادية البطانية متقاربة.

مثل ECIS ، يسمح cellZscope بقياس التغيرات في مقاومة الحاجز البطاني. ومع ذلك ، يتم استزراع الخلايا على إدراج غشاء مسامي. في هذا النظام ، تكون الدائرة الكهربائية بين قطبين على جانبي إدخال الغشاء. يتم استزراع الطبقة الأحادية البطانية أعلى ملحق الغشاء هذا ، مما يسمح بقياس المقاومة الكهربائية عبر البطانة (TER) (الشكل 1B - البئر ؛ منظر جانبي). كما هو الحال مع ECIS ، في هذا النظام ، يمكن أن تعزى المعاوقة الكلية إلى العديد من مكونات الحاجز ، اعتمادا على تردد التيار المطبق44. عند الترددات المنخفضة ، تهيمن سعة القطب (CEl) على المعاوقة الكلية للنظام. بدلا من ذلك ، عند الترددات العالية ، تهيمن مقاومة الوسائط (R medium) على المعاوقة الكلية. ومن ثم ، فإن القياسات الأكثر فائدة تقع ضمن نطاق التردد المتوسط (102-10 4 هرتز) ، والذي يوفر معلومات تتعلق بمكونين رئيسيين للحاجز البطاني (الشكل 1 ب - مخطط الدائرة). أولا ، عند 103-10 4 هرتز ، تهيمن سعة طبقة الخلية (CCl) على المعاوقة الكلية حيث أن مقاومة الغشاء (غشاء R) عالية بما يكفي لإهمالها ، ويتدفق التيار في الغالب عبر المكثف. ومن ثم، يشير CCl إلى التغيرات التي تطرأ على المقاومة عبر الغشاء الخلوي. بدلا من ذلك ، يضفي TER في الغالب المعاوقة الكلية عند 10 2-10 3 هرتز ، حيث يتم توجيه تدفق التيار عبر المساحات الموصلة بين الخلايا المجاورة ، والتي تجمعها البروتينات الموصلة. ومن ثم ، فإن هذا يوفر معلومات عن المكون شبه الخلوي للحاجز البطاني ، كما رأينا سابقا مع Rb على ECIS.

يوضح الشكل 1 ج كيف تتعطل مناطق معينة من بطانة الدماغ عن طريق العلاج بخلايا الورم الميلانيني. يتم الكشف عن هذا الاضطراب بواسطة أجهزة الاستشعار الحيوية عن طريق تغيير في تدفق التيار عبر الفضاء شبه الخلوي (يقاس على أنه Rb أو TER) ؛ الفضاء القاعدي (يقاس باسم ألفا) ؛ وغشاء الخلية (يقاس ك Cm أو CCl). استخدمنا كلا المستشعرين الحيويين المفصلين في هذه المقدمة لقياس تغير الحاجز البطاني للدماغ بعد العلاج بمحفزات مختلفة مثل السيتوكينات أو خلايا سرطان الجلد الغازية. تنخفض المقاومة المقاسة إذا عطل حافز معين الحاجز البطاني ، مما يخلق مسارا أقل مقاومة للسماح بتدفق التيار. وبالتالي ، فإن انخفاض "مقاومة الحاجز" يشير إلى فقدان سلامة الحاجز أو اضطراب الحاجز البطاني للدماغ. في هذه المقايسات ، درسنا هذا الاضطراب من خلال تفسير المقاومة والمعلمات النموذجية في الوقت الفعلي. تم تفصيل تطبيق ECIS و cellZscope في معالجة مثل هذه الأسئلة البحثية في مكان آخر39،41،45،46.

تسمح الأبحاث في المختبر باكتشاف آليات المرض الحاسمة من خلال الكشف عن الجزيئات والمسارات الوظيفية التي تؤدي إلى تقدم المرض. ومع ذلك ، فإن هذا يتطلب تكرارا موثوقا للمرض في المختبر ، والذي يختلف اختلافا جوهريا عن الجسم الفعال. في السيناريو المثالي ، يجب أن يكون البحث في المختبر قابلا للتكرار ، وغير جراحي ، وخالي من الملصقات ، وكميا ، ويحاكي التأثيرات الهيكلية الموجودة في الجسم الحي. في هذه المقالة ، نوضح بالتفصيل منهجية استخدام هاتين التقنيتين المتنافستين لقياس التغيرات التي يسببها العلاج في سلامة الحاجز البطاني للدماغ. نناقش مزايا الجمع بين نتائجها لتقديم صورة أكثر شمولا لتعطيل الحاجز ومشاركة القيود التي لا يزال يتعين التغلب عليها.

Protocol

1. استخدام ECIS لمراقبة التغيرات في سلامة الحاجز البطاني للدماغ استجابة للعلاجات المختلفة

  1. إعداد البرنامج ومحطة الصفيف والجهاز
    1. قم بتوصيل محطة الصفيف المكونة من 96 بئرا بالجهاز. ضع محطة المصفوفة في كيس بلاستيكي وضعها في الحاضنة قبل 1 ساعة على الأقل من الفحص للسماح لها بالاحماء. قم بإزالة الكيس البلاستيكي مباشرة قبل التجربة.
    2. بمجرد أن تصبح جاهزا ، قم بتشغيل الجهاز وافتح البرنامج المقابل على الكمبيوتر. اضغط على الزر إعداد ( Setup ) ضمن علامة التبويب تجميع البيانات . سيكمل البرنامج فحص الاتصال ، والذي سيكتشف نوع المحول المرفق (على سبيل المثال ، محطة صفيف 96 بئرا) ويعرض الآبار الحمراء في خريطة اللوحة الموضحة. يشير هذا إلى أن البرنامج يكتشف المحول ولكن لا يمكنه استشعار اللوحة المرفقة. النظام جاهز الآن للوحة 96 بئرا.
  2. تحضير لوحة الاستشعار الحيوي المكونة من 96 بئرا
    ملاحظة: يتم استخدام ترتيب لوحة 96 بئرا. تم نقش قاعدة كل بئر بأصابع متداخلة من الأقطاب الكهربائية المطلية بالذهب. تأتي الألواح في عبوات معقمة يجب فتحها فقط في غطاء معقم / خزانة أمان بيولوجي. يجب أولا تثبيت أقطاب الذهب كيميائيا عن طريق إضافة 10 مللي متر سيستين للحفاظ على سعة القطب.
    1. تحضير السيستين 10 mM في حوض معقم واستخدام ماصة متعددة القنوات بعناية 100 ميكرولتر في كل بئر. احتضان السيستين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم نضح بعناية ، ماصة عند حواف البئر فقط ، لتجنب خدش القطب. اغسل السيستين على الأقل 2x بالماء منزوع الأيونات المعقم (وليس PBS) باستخدام نفس تقنية الماصة.
      ملاحظة: يمكن أيضا تثبيت أقطاب اللوحة كهربائيا باستخدام الوسائط الدافئة على جهاز ECIS ، بدلا من استخدام طلاء السيستين ، كما هو مفصل في بروتوكول الشركة المصنعة.
    2. قم بإعداد ركيزة ECM لتكون بمثابة غشاء قاعدي في قاع البئر.
      ملاحظة: يمكن اختيار ركائز ECM مثل الكولاجين أو اللامينين اعتمادا على متطلبات خط الخلايا البطانية في الدماغ. هنا نستخدم الكولاجين لخط الخلايا البطانية الوعائية الدماغية البشرية (hCMVEC).
    3. تحضير 1 ميكروغرام / سم2 من الكولاجين ذيل الجرذ I المذاب في 0.02 M حمض الخليك في حوض طازج ومعقم (100 ميكرولتر لكل بئر). اترك الكولاجين لمدة 1 ساعة في الإضاءة المنخفضة في الغطاء المعقم ، ثم اغسل 2x بعناية بالماء منزوع الأيونات وسحب دقيق للماصات بعناية.
      ملاحظة: تأكد من إزالة أكبر قدر ممكن من الماء منزوع الأيونات بعناية قدر الإمكان بعد آخر غسلة واترك اللوحة تجف في الغطاء. يوصى باستخدام اللوحة بعد فترة وجيزة من الطلاء ؛ ومع ذلك ، يمكن تخزينه في الماء عند 4 درجات مئوية مؤقتا (أقل من أسبوع). اللوحة جاهزة الآن للاستخدام.
  3. تحضير الخلايا البطانية للدماغ للبذر على لوحة الاستشعار الحيوي المكونة من 96 بئرا
    ملاحظة: يوصى أولا بتحسين مرحلة النمو وكثافة البذر لخط الخلايا البطانية المراد استخدامه. تم استخدام خط hCMVEC في هذا البروتوكول ، والذي يستغرق 48 ساعة للوصول إلى نقطة التقاء بعد البذر عند 20000 خلية لكل بئر في صفيحة 96 بئرا.
    1. احصد الخلايا البطانية للدماغ في غطاء معقم باستخدام كاشف تفكك لطيف وقم بإجراء تعداد دقيق للخلايا. استخدم 20000 hCMVECs في 100 ميكرولتر من الوسائط لكل بئر لمرحلة نمو ثابتة لمدة 48 ساعة. قم بإعداد الخلايا البطانية الزائدة في الدماغ لضمان السحب الأمثل لجميع الآبار البالغ عددها 96 بئرا.
      ملاحظة: وبالتالي ، بالنسبة للوحة 96 بئرا ، هناك حاجة إلى ما يقرب من 2,000,000 خلية في 10 مل من الوسائط الدافئة مسبقا.
    2. انقل الخلايا البطانية للدماغ إلى حوض معقم جديد وباستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف بعناية 100 ميكرولتر (20000 خلية) من تعليق الخلية لكل بئر. أعد تعليق الخلايا برفق في الحوض بانتظام لتجنب استقرار الخلايا البطانية بمرور الوقت. تأكد من أن 1 بئر يحتوي على وسائط فقط ولا توجد خلايا للسماح بالنمذجة الرياضية (بئر خال من الخلايا) وأن اللوحة بأكملها مصنفة في غضون 30 ثانية.
  4. بدء التجربة
    1. قم بتوصيل اللوحة بعناية بالمحول في الحاضنة عن طريق تحريك المشابك الحمراء على جانبي محول اللوحة للخارج. قم بمحاذاة بئر A1 للوحة مع منطقة A1 للمحول. أمسك اللوحة برفق في مكانها بيد واحدة في الأعلى وانقر فوق المشابك الحمراء في مكانها باليد الأخرى.
      ملاحظة: تأكد من استقرار اللوحة في المحول.
    2. أغلق الحاضنة واضغط على إعداد مرة أخرى. ابحث عن الآبار الخضراء في خريطة اللوحة التي تشير إلى الآبار المكتشفة بشكل صحيح. أي آبار تظهر باللون الأحمر بها خطأ في الاتصال. لإصلاح ذلك ، أعد إرفاق اللوحة بسرعة ،
      ملاحظة: قد يؤدي قضاء الوقت المفرط في محاولة إصلاح الآبار ذات التوصيلات الضعيفة إلى الإضرار بصحة الخلايا.
    3. اضغط على Check لإعادة التحقق من المرفقات كقراءات مقاومة مطلقة. سيستغرق هذا عدة دقائق.
    4. اضغط على السهم الموجود أسفل خريطة اللوحة للتأكد من تحديد كتالوج اللوحة الصحيح. في هذه الحالة ، هو 96w20idf.
    5. اضغط على الزر متعدد الترددات لضمان قياس المعاوقة عند ترددات تيار متردد متعددة للسماح بالنمذجة الرياضية المستقبلية.
    6. اضغط على ابدأ لبدء التجربة. اسمح للخلايا بالتكاثر لمدة ~ 48 ساعة وتشكيل طبقة أحادية نموذجية ذات مقاومة عالية ، كما تم قياسها بزيادة الأوم.
  5. علاج الخلايا البطانية للدماغ بالخلايا السرطانية أو السيتوكينات على الصفيحة المكونة من 96 بئرا
    ملاحظة: نظرا لأن اللوحة المكونة من 96 بئرا تسمح بالاختبار المتزامن لمحفزات متعددة ، فقم بإعداد خريطة لوحة واضحة مع خيارات المعالجة المطلوبة (الشكل التكميلي S1-أسفل). يمكن ويجب إجراء كل علاج الاقل في ثلاث نسخ (ثلاثة آبار مكررة) للسماح بالتحليلات الإحصائية ؛ ومع ذلك ، يتم عرض أربعة مكررات في الشكل التكميلي S1.
    1. في 48 ساعة ، تحقق من نمو الخلايا البطانية في الدماغ. تأكد من الوصول إلى الهضبة قبل إعداد حلول العلاج.
      ملاحظة: قد تستغرق خطوط الخلايا البطانية المختلفة فترات زمنية مختلفة للوصول إلى الهضبة. وبالتالي ، يجب تحسين مرحلة نموها وكثافة البذر قبل إجراء هذه التجربة. يجب أن تستقر الآبار عادة في نفس الساعة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقد يتم اختراقها أو سحبها بشكل غير دقيق ويجب عدم تضمينها.
    2. للعلاج بالسيتوكينات ، قم بإعداد التركيزات المناسبة من السيتوكينات في الوسائط الكاملة الدافئة مسبقا جنبا إلى جنب مع عناصر التحكم في السيارة والوسائط ذات الصلة.
      1. تحضير السيتوكينات عند 2x التركيز النهائي المطلوب حيث سيتم تخفيفها بنسبة 1: 1 عند إضافتها إلى كل بئر يحتوي على خلايا بطانة الدماغ.
      2. للسماح بإجراء كل معالجة في ثلاث نسخ ، قم بإعداد جميع السيتوكينات في أكثر من 300 ميكرولتر من الحجم الكلي (أي إجمالي 350 ميكرولتر على الأقل) ، لإضافة العلاج بمقدار 100 ميكرولتر لكل بئر.
    3. للعلاج بالخلايا ، احصد الخلايا (ثلاثة خطوط مختلفة لخلايا سرطان الجلد المشتقة من المريض المستخدمة في هذا البروتوكول) باستخدام كاشف تفكك لطيف وإجراء تعداد دقيق للخلايا. قم بإجراء العلاجات القائمة على الخلايا في أعلى مستجيب: نسب مستهدفة (نسب E: T) تبلغ 1: 1 حيث تكون خلايا العلاج هي الخلايا المستجيبة (على سبيل المثال ، خلايا سرطان الجلد) والخلايا البطانية للدماغ هي الخلايا المستهدفة ، أي إضافة 20000 خلية سرطان الجلد إلى 20000 خلية بطانية في الدماغ لكل بئر.
      1. قم بالتخفيف بشكل متسلسل لنسب E: T الأصغر من 1:10 أو 1: 100 عند الحاجة. للسماح بالمعالجة في الآبار الثلاثية ، عد الخلايا وإعدادها في أكثر من 300 ميكرولتر من الحجم الكلي (أي إجمالي 350 ميكرولتر على الأقل) لإضافة معالجة 100 ميكرولتر لكل بئر.
    4. قم بتسمية أنابيب مجموعة البولي بروبلين سعة 1.1 مل ، والتي تأتي في شكل شريط من 8 أنابيب (أي أنابيب شريطية سعة 1 مل) ، وفقا لخريطة لوحة 96 بئرا (الشكل التكميلي S1-Top). أدخل الأنابيب الشريطية في ألواح الأنابيب الشريطية وقم بتعقيمها قبل التجربة. أضف الحجم الكلي لسيتوكينات أو خلايا العلاج (أي 350 ميكرولتر كاملة من العلاج) إلى أنابيب الشريط المعقمة واتركها في الحاضنة للتدفئة.
    5. في البرنامج، اضغط على إيقاف مؤقت لإيقاف التجربة مؤقتا. قد يستغرق هذا بضع ثوان حتى يكتمل. بمجرد التوقف مؤقتا ، افتح الحاضنة وقم بفك كل من المشابك الحمراء بعناية بيد واحدة مع تثبيت اللوحة باليد الأخرى. حافظ على التجربة متوقفة مؤقتا وأحضر اللوحة إلى الغطاء المعقم.
    6. قم بإزالة أنابيب شريط العلاج من الحاضنة. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أعد تعليق محتويات أنابيب شريط المعالجة بعناية ثم أضف 100 ميكرولتر من المعالجة من الأنابيب الشريطية إلى الآبار الصحيحة على لوحة 96 بئرا دون لمس قاع البئر. أضف المعالجة بعناية إلى جميع الآبار والوسائط فقط إلى البئر الخالي من الخلايا وأكمل هذه الخطوة في أقل من 5 دقائق للحصول على لوحة كاملة من 96 بئرا ، لأن التبريد المفرط سيؤثر على مقاومة الطبقة الأحادية البطانية.
    7. أعد اللوحة المعالجة إلى الجهاز ، وقم بتوصيلها كما تم سابقا ، ثم تحقق من توصيلات القطب بالمحول مرة أخرى بالضغط على Setup | تحقق.
    8. تأكد من تحديد كتالوج اللوحة الصحيح وإعدادات اكتساب الترددات المتعددة، واضغط على استئناف لاستئناف التجربة. اسمح للتجربة بالتقدم وتشغيلها حتى نقطة النهاية المطلوبة.
    9. اضغط على إنهاء لإكمال التجربة ، والتي تحفظ تلقائيا ملف abp. المسجل. انتقل إلى ملف | تصدير البيانات لاسترداد هذا الملف بتنسيق xls. أو CSV. لمزيد من التحليلات.

2. استخدام cellZscope لمراقبة التغيرات في سلامة الحاجز البطاني للدماغ استجابة للعلاجات المختلفة

  1. تحضير المكونات المعدنية للجهاز والمحول وإدراج الغشاء المسامي
    1. قم بتنظيف المكونات المعدنية بالتتابع بالماء منزوع الأيونات ، ثم 70٪ إيثانول ، ثم ماء منزوع الأيونات مرة أخرى.
    2. الأوتوكلاف القطب السفلي أو "الأواني" وأقطاب الغمس العلوية وتعقيم جميع المكونات الأخرى لوحدة الخلية بنسبة 70٪ من الإيثانول.
    3. في غطاء معقم ، قم بتثبيت جميع الأقطاب الكهربائية / "الأواني" السفلية البالغ عددها 24 عن طريق شدها في وحدة الخلية ، مع الحرص على الحفاظ على العقم طوال الوقت.
    4. أضف 900 ميكرولتر من الوسائط الأساسية إلى الآبار.
      ملاحظة: تضاف الوسائط الأساسية إلى البئر السفلي ، والتي تعمل كحجرة قاعدية للبطانة. يوصى بعدم استخدام المصل في هذه الحجرة لتكرار البيئة القاعدية لبطانة الدماغ بشكل أكثر موثوقية.
    5. قم بتوصيل أقطاب الغمس مغناطيسيا بغطاء وحدة الخلية وأغلق الغطاء فوق الآبار بحيث يتم فتح أقطاب الغمس في أواني القطب السفلي.
    6. قم بتوصيل وحدة الخلية بالمحول في الحاضنة واتركها لمدة 1 ساعة على الأقل لتحقيق التوازن. في هذه المرحلة ، افتح البرنامج لتحميل خريطة اللوحة التجريبية ضمن علامة التبويب تخطيط ، وبالتالي تضمين خريطة لوحة المعالجة في الملفات ، والتي ستحتوي في النهاية على البيانات.
    7. عندما يكون الطلاء مطلوبا ، قم بتغطية الغشاء بغطاء معقم باستخدام لوحة استزراع معقمة ذات 24 بئرا لتثبيت الإدخالات وإضافة ركيزة ECM (على سبيل المثال ، الكولاجين) إلى القسم الداخلي من البئر ، كما هو مفصل في القسم 1.2.3 استخدم ماصة أحادية القناة لتحميل ركيزة ECM في كل بئر بعناية.
  2. تحضير الخلايا البطانية للدماغ للبذر على الغشاء وبدء التجربة
    1. قم بحصاد الخلايا البطانية للدماغ وعدها وفقا للقسم 1.3 ، ولكن قم بإعداد المعايرة النهائية المطلوبة للخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. تأكد من أن الخلايا المحصودة في وسائط كاملة دافئة ، بما في ذلك جميع عوامل النمو المطلوبة والمصل.
    2. باستخدام ماصة أحادية القناة ، قم بزرع الخلايا البطانية للدماغ بعناية (80000 في هذا البروتوكول) في الغرفة القمية لإدخال البئر في 350 ميكرولتر من الوسائط الكاملة.
    3. قم بتضمين بئر خال من الخلايا عن طريق سحب الوسائط الكاملة فقط في أحد الإدخالات.
    4. قم بإزالة وحدة الخلية من الحاضنة وضعها في غطاء معقم. انقل الحشوات المعدة إلى أواني القطب السفلي باستخدام زوج من الملقط للتعامل مع الدعامات العلوية للملحق فقط. تجنب تكوين الفقاعات تحت الغشاء.
    5. ضع وحدة الخلية مرة أخرى في الحاضنة فوق المحول.
    6. في البرنامج ، في علامة تبويب التجربة ، ضمن قسم الطيف ، حدد البدء عند 1 هرتز والتوقف عند 100 كيلو هرتز للحصول على البيانات عبر نطاق التردد بأكمله ؛ حدد الخطوات الدقيقة .
    7. ضمن وقت الانتظار ، حدد 15 دقيقة للسماح بإجراء قياسات مستمرة بأسرع معدل يجريه البرنامج.
    8. اضغط على ابدأ لبدء التجربة والسماح للخلايا البطانية للدماغ بالتكاثر وتشكيل طبقة أحادية ذات مقاومة عالية. تستغرق هذه الخطوة حوالي 48 ساعة.
  3. علاج الخلايا البطانية للدماغ بالخلايا السرطانية والسيتوكينات على الحشوات الغشائية
    1. في 48 ساعة ، قم بإعداد السيتوكينات أو الخلايا العلاجية (على سبيل المثال ، خلايا سرطان الجلد) وفقا للقسم 1.5 ، بما في ذلك إجراء تعداد الخلايا عند الاقتضاء ، وجمعها في أنابيب شريطية سعة 1 مل أو ما يعادلها.
    2. تحضير المعالجة بتركيزات صحيحة لإضافة 70 ميكرولتر إلى كل بئر (إدراج). ضع العلاجات في الحاضنة للتدفئة.
    3. نظرا لأن الأداة هنا تجري قياسات كل 15 دقيقة ، فاختر وقت العلاج الذي يبدأ فور اكتمال القياس. في هذا الوقت ، قم بإزالة وحدة الخلية من الحاضنة وامسحها برفق باستخدام 70٪ من الإيثانول باستخدام مناديل خالية من النسالة.
    4. في غطاء معقم ، افتح وحدة الخلية وماصة بعناية 70 ميكرولتر من العلاج في الغرفة القمية للإدراج المعني. افعل ذلك باستخدام ماصة أحادية القناة وأضفها بحركة دائرية ، وتجنب الفقاعات. أكمل هذه الخطوة في أقل من 10 دقائق لإعادة وحدة الخلية إلى المحول قبل بدء القياس التالي.
    5. اضغط على إيقاف لإنهاء التجربة. تصدير البيانات مباشرة إلى xls. ملف تحت الملف | تصدير علامة التبويب. قم بتسمية هذا الملف وحفظه بشكل مناسب بعد فتحه.

النتائج

تفسير بيانات مقاومة ECIS

فهم الظروف التجريبية المثلى
هنا يمكن عرض البيانات مباشرة باستخدام البرنامج (الشكل 2 أ) أو تصديرها للتحليل ورسم الرسم البياني (الشكل 2 ب). يوضح الشكل 2 أ مثالا للبيانات المعروضة على...

Discussion

يجب أن تأخذ الدراسات العلاجية حول الأمراض التي تؤثر على BBB في الاعتبار أهمية سلامة وتنظيم الحاجز البطاني للدماغ. على سبيل المثال ، يتم التحقيق بشكل حاسم في اضطراب الحاجز البطاني للدماغ في ورم خبيث من السرطان إلى الدماغ من مواقع تشريحية أخرى. وذلك لأن بطانة الدماغ تشكل الحاجز الأول ضد الخلا...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

تم تمويل Akshata Anchan من قبل مؤسسة الأعصاب في نيوزيلندا لمنحة Gillespie الدراسية (مرجع المنحة: 1628-GS) والزمالة الأولى (مرجع المنحة: 2021 FFE). كما تم تمويل تكلفة البحث جزئيا من قبل زمالة مؤسسة الأعصاب -2021 FFE وصندوق تطوير أبحاث أعضاء هيئة التدريس بجامعة أوكلاند. تم تمويل جيمس هاكلسبي بمنحة دراسية من مؤسسة أوكلاند للأبحاث الطبية. بفضل فريق Baguley ومركز أبحاث جمعية أوكلاند للسرطان لخطوط خلايا سرطان الجلد النيوزيلندية المشتقة من المريض.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
aMEMGibco12561072Melanoma cell base media
cellZscope arraynanoAnalyticscellZscope2; software v4.3.1TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tailGibcoA1048301ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMPSigma-AldrichD0627Brain endothelial media supplement
ECIS array Applied BiophysicsECIS ZΘ; software v1.2.163.0Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate Applied Biophysics96W20idf 96-well biosensor plate
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Brain endothelial media supplement
hCMVECApplied Biological MaterialsT0259Brain endothelial cell line
hEGFPeproTechPTAF10015100Brain endothelial media supplement
HeparinSigma-AldrichH-3393Brain endothelial media supplement
hFGFPeproTechPTAF10018B50Brain endothelial media supplement
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Brain endothelial media supplement
IL-1βPeproTech200-01BCytokine
Insulin-Transferrin-Sodium SeleniteSigma-Aldrich11074547001Melanoma cell media supplement
M199Gibco11150-067Brain endothelial cell base media
MilliQ waterDeionized water
PBS 1xGibco10010-023
TNFαPeproTech300-01ACytokine
Transwell insertCorningCLS3464Porous membrane insert
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Dissociation reagent

References

  1. Fidler, I. J., Schackert, G., Zhang, R. D., Radinsky, R., Fujimaki, T. The biology of melanoma brain metastasis. Cancer Metastasis Reviews. 18 (3), 387-400 (1999).
  2. Tomlinson, E. Theory and practice of site-specific drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 1 (2), 87-198 (1987).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Neuwelt, E., et al. Strategies to advance translational research into brain barriers. The Lancet. Neurology. 7 (1), 84-96 (2008).
  5. Stolp, H. B., Dziegielewska, K. M. Review: Role of developmental inflammation and blood-brain barrier dysfunction in neurodevelopmental and neurodegenerative diseases. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (2), 132-146 (2009).
  6. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: Beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  7. Kacem, K., Lacombe, P., Seylaz, J., Bonvento, G. Structural organization of the perivascular astrocyte endfeet and their relationship with the endothelial glucose transporter: A confocal microscopy study. Glia. 23 (1), 1-10 (1998).
  8. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  9. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the cns are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science. 239 (4837), 290-292 (1988).
  10. Smith, J. A., Das, A., Ray, S. K., Banik, N. L. Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases. Brain Research Bulletin. 87 (1), 10-20 (2012).
  11. Denes, A., et al. Proliferating resident microglia after focal cerebral ischaemia in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (12), 1941-1953 (2007).
  12. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Celular andl Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
  13. Felgenhauer, K. The blood-brain barrier redefined. Journal of Neurology. 233 (4), 193-194 (1986).
  14. Scheinberg, L. C., Edelman, F. L., Levy, W. A. Is the brain "an immunologically privileged site"?I. Studies based on intracerebral tumor homotransplantation and isotransplantation to sensitized hosts. Archives of Neurology. 11, 248-264 (1964).
  15. Carbonell, W. S., Ansorge, O., Sibson, N., Muschel, R. The vascular basement membrane as "soil" in brain metastasis. PLoS One. 4 (6), e5857 (2009).
  16. Nag, S. Morphology and molecular properties of cellular components of normal cerebral vessels. Methods in Molecular Medicine. 89, 3-36 (2003).
  17. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 71 (1), 113-128 (2011).
  18. Bauer, H. C., et al. New aspects of the molecular constituents of tissue barriers. Journal of Neural Transmission (Vienna). 118 (1), 7-21 (2011).
  19. Balda, M. S., Matter, K. Tight junctions as regulators of tissue remodelling. Current Opinion in Cell Biology. 42, 94-101 (2016).
  20. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
  21. Van Itallie, C. M., Tietgens, A. J., Anderson, J. M. Visualizing the dynamic coupling of claudin strands to the actin cytoskeleton through zo-1. Molecular Biology of the Cell. 28 (4), 524-534 (2017).
  22. Takeichi, M. Historical review of the discovery of cadherin, in memory of tokindo okada. Development, Growth & Differentiation. 60 (1), 3-13 (2018).
  23. Vincent, P. A., Xiao, K., Buckley, K. M., Kowalczyk, A. P. Ve-cadherin: Adhesion at arm's length. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286 (5), C987-C997 (2004).
  24. Brasch, J., et al. Structure and binding mechanism of vascular endothelial cadherin: A divergent classical cadherin. Journal of Molecular Biology. 408 (1), 57-73 (2011).
  25. Gavard, J., Patel, V., Gutkind, J. S. Angiopoietin-1 prevents vegf-induced endothelial permeability by sequestering src through mdia. Developmental Cell. 14 (1), 25-36 (2008).
  26. Romero, I. A., et al. Changes in cytoskeletal and tight junctional proteins correlate with decreased permeability induced by dexamethasone in cultured rat brain endothelial cells. Neuroscience Letters. 344 (2), 112-116 (2003).
  27. Aragon-Sanabria, V., et al. Ve-cadherin disassembly and cell contractility in the endothelium are necessary for barrier disruption induced by tumor cells. Scientific Reports. 7, 45835 (2017).
  28. Angelini, D. J., et al. Tnf-alpha increases tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and opens the paracellular pathway through fyn activation in human lung endothelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (6), L1232-L1245 (2006).
  29. Nwariaku, F. E., et al. Tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and the regulation of microvascular permeability. Surgery. 132 (2), 180-185 (2002).
  30. Orsenigo, F., et al. Phosphorylation of ve-cadherin is modulated by haemodynamic forces and contributes to the regulation of vascular permeability in vivo. Nature Communications. 3, 1208 (2012).
  31. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  32. Chen, Z., Tzima, E. Pecam-1 is necessary for flow-induced vascular remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1067-1073 (2009).
  33. Privratsky, J. R., Newman, P. J. Pecam-1: Regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  34. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: Targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 315 (3), C343-C356 (2018).
  35. Bernardo-Castro, S., et al. Pathophysiology of blood-brain barrier permeability throughout the different stages of ischemic stroke and its implication on hemorrhagic transformation and recovery. Frontiers in Neurology. 11, 594672 (2020).
  36. Wilhelm, I., Molnár, J., Fazakas, C., Haskó, J., Krizbai, I. A. Role of the blood-brain barrier in the formation of brain metastases. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1383-1411 (2013).
  37. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier". Frontiers in Neuroscience. 17, 1047778 (2023).
  38. Abate-Daga, D., Ramello, M. C., Smalley, I., Forsyth, P. A., Smalley, K. S. M. The biology and therapeutic management of melanoma brain metastases. Biochemistry & Pharmacology. 153, 35-45 (2018).
  39. Anchan, A., et al. Real-time measurement of melanoma cell-mediated human brain endothelial barrier disruption using electric cell-substrate impedance sensing technology. Biosensors (Basel). 9 (2), (2019).
  40. Anchan, A., et al. Analysis of melanoma secretome for factors that directly disrupt the barrier integrity of brain endothelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8193 (2020).
  41. Hucklesby, J. J. W., et al. Comparison of leading biosensor technologies to detect changes in human endothelial barrier properties in response to pro-inflammatory tnfα and il1β in real-time. Biosensors (Basel). 11 (5), 159 (2021).
  42. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (17), 7896 (1991).
  43. Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of gpcr-mediated changes in endothelial barrier function: Overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 467 (10), 2193-2218 (2015).
  44. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -. J. Impedance-based cell monitoring: Barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 5 (2013).
  45. Anchan, A., Finlay, G., Angel, C. E., Hucklesby, J. J. W., Graham, S. E. Melanoma mediated disruption of brain endothelial barrier integrity is not prevented by the inhibition of matrix metalloproteinases and proteases. Biosensors (Basel). 12 (8), 660 (2022).
  46. Robilliard, L. D., et al. The importance of multifrequency impedance sensing of endothelial barrier formation using ecis technology for the generation of a strong and durable paracellular barrier. Biosensors. 8 (3), 64 (2018).
  47. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. The Journal of Clinical Investigation. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  48. Qi, J., Chen, N., Wang, J., Siu, C. H. Transendothelial migration of melanoma cells involves n-cadherin-mediated adhesion and activation of the beta-catenin signaling pathway. Molecular Biology of the Cell. 16 (9), 4386-4397 (2005).
  49. Brayton, J., Qing, Z., Hart, M. N., Vangilder, J. C., Fabry, Z. Influence of adhesion molecule expression by human brain microvessel endothelium on cancer cell adhesion. Journal of Neuroimmunology. 89 (1-2), 104-112 (1998).
  50. Soto, M. S., Serres, S., Anthony, D. C., Sibson, N. R. Functional role of endothelial adhesion molecules in the early stages of brain metastasis. Neuro-oncology. 16 (4), 540-551 (2014).
  51. García-Martín, A. B., et al. Vla-4 mediated adhesion of melanoma cells on the blood-brain barrier is the critical cue for melanoma cell intercalation and barrier disruption. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (10), 1995-2010 (2018).
  52. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  53. Stone, N. L., England, T. J., O'sulli, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
  54. . Abstracts from the international symposium "signal transduction at the blood-brain barriers" 2022. Fluids and Barriers of the CNS. 20 (1), 26 (2023).
  55. Srinivasan, B., et al. Teer measurement techniques for in vitro barrier model systems. SLAS Technology. 20 (2), 107-126 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BBB ECIS CellZscope

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved