Medición de cambios en la integridad de la barrera endotelial cerebral con dos biosensores basados en impedancia en respuesta a células cancerosas y citocinas

Resumen

Aquí demostramos la técnica de uso de biosensores basados en impedancia: ECIS y cellZscope, para medir la fuerza de la barrera endotelial cerebral. Detallamos la preparación y técnica de adición de diversos estímulos a un modelo in vitro del endotelio cerebral. Medimos, registramos y damos un análisis representativo de los hallazgos.

Resumen

La barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés) protege el parénquima cerebral contra patógenos dañinos en la sangre. La BHE consiste en la unidad neurovascular, que comprende pericitos, procesos astrocíticos del pie y células endoteliales fuertemente adheridas. Aquí, las células endoteliales del cerebro forman la primera línea de barrera contra los patógenos transmitidos por la sangre. En enfermedades como el cáncer y la neuroinflamación, los factores circulantes en la sangre pueden alterar esta barrera. La progresión de la enfermedad empeora significativamente después de la disrupción de la barrera, lo que permite el acceso o el deterioro de regiones del cerebro. Esto empeora significativamente el pronóstico, particularmente debido a las limitadas opciones de tratamiento disponibles a nivel cerebral. Por lo tanto, los estudios emergentes tienen como objetivo investigar posibles terapias que puedan evitar que estos factores perjudiciales en la sangre interactúen con las células endoteliales del cerebro.

Los instrumentos Electric Cell-Substrate Impedancia Sensing (ECIS) y cellZscope, disponibles en el mercado, miden la impedancia a través de monocapas celulares, como el endotelio BBB, para determinar su resistencia de barrera. Aquí detallamos el uso de ambos biosensores en la evaluación de la integridad de la barrera endotelial cerebral tras la adición de diversos estímulos. De manera crucial, destacamos la importancia de su capacidad de alto rendimiento para la investigación concurrente de múltiples variables y tratamientos biológicos.

Introducción

En este artículo se discuten las tendencias actuales en la evaluación de las células microvasculares. En concreto, detallamos el uso de dos plataformas disponibles en el mercado para medir las propiedades de barrera de las células endoteliales microvasculares cerebrales. Las células endoteliales son células que se encuentran frente a la sangre, que recubren la pared de los vasos. Sin embargo, los microvasos cerebrales son únicos, ya que ayudan a formar la barrera hematoencefálica protectora (BBB)^1,2,3. La función BBB es regular el transporte de moléculas de la sangre al cereb....

Protocolo

1. Uso de ECIS para monitorear cambios en la integridad de la barrera endotelial cerebral en respuesta a diversos tratamientos

1. Configuración del software, la estación de matriz y la máquina
   1. Conecte la estación de matriz de 96 pocillos a la máquina. Coloque la estación del array en una bolsa de plástico y colóquela en la incubadora al menos 1 h antes del ensayo para permitir que se caliente. Retira la bolsa de plástico inmediatamente antes del experimento.
   2. Una vez listo, encienda la máquina y abra el software correspondiente en la computadora. Presione el botón Configuración en la pestaña Reco....

Discusión

Los estudios terapéuticos sobre las enfermedades que afectan a la BHE deben tener en cuenta la importancia de la integridad y regulación de la barrera endotelial cerebral. Por ejemplo, la ruptura de la barrera endotelial cerebral se investiga críticamente en la metástasis del cáncer al cerebro desde otros sitios anatómicos. Esto se debe a que el endotelio cerebral forma la primera barrera contra las células tumorales circulantes. Como se mencionó anteriormente en la introducción, los estudios in vitro s.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
aMEM	Gibco	12561072	Melanoma cell base media
cellZscope array	nanoAnalytics	cellZscope2; software v4.3.1	TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tail	Gibco	A1048301	ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Brain endothelial media supplement
ECIS array	Applied Biophysics	ECIS ZΘ; software v1.2.163.0	Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate	Applied Biophysics	96W20idf	96-well biosensor plate
FBS	Sigma-Aldrich	12203C-500ML
GlutaMAX	Gibco	305050-061	Brain endothelial media supplement
hCMVEC	Applied Biological Materials	T0259	Brain endothelial cell line
hEGF	PeproTech	PTAF10015100	Brain endothelial media supplement
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3393	Brain endothelial media supplement
hFGF	PeproTech	PTAF10018B50	Brain endothelial media supplement
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Brain endothelial media supplement
IL-1β	PeproTech	200-01B	Cytokine
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	11074547001	Melanoma cell media supplement
M199	Gibco	11150-067	Brain endothelial cell base media
MilliQ water			Deionized water
PBS 1x	Gibco	10010-023
TNFα	PeproTech	300-01A	Cytokine
Transwell insert	Corning	CLS3464	Porous membrane insert
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Dissociation reagent