Messung von Veränderungen der Integrität der endothelialen Barriere des Gehirns mit zwei impedanzbasierten Biosensoren als Reaktion auf Krebszellen und Zytokine

Zusammenfassung

Hier demonstrieren wir die Technik der Verwendung impedanzbasierter Biosensoren: ECIS und cellZscope zur Messung der Endothelbarriere des Gehirns. Wir beschreiben die Vorbereitung und Technik des Hinzufügens verschiedener Stimuli zu einem in vitro-Modell des Gehirnendothels. Wir messen, erfassen und analysieren die Ergebnisse repräsentativ.

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) schützt das Hirnparenchym vor schädlichen Krankheitserregern im Blut. Die BHS besteht aus der neurovaskulären Einheit, die aus Perizyten, astrozytären Fußfortsätzen und fest verklebten Endothelzellen besteht. Hier bilden die Endothelzellen des Gehirns die erste Barrierelinie gegen durch Blut übertragbare Krankheitserreger. Bei Erkrankungen wie Krebs und Neuroinflammation können zirkulierende Faktoren im Blut diese Barriere stören. Das Fortschreiten der Erkrankung verschlechtert sich nach der Unterbrechung der Barriere erheblich, was den Zugang zu oder die Beeinträchtigung von Regionen des Gehirns ermöglicht. Dies verschlechtert die Prognosen erheblich, insbesondere aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten auf der Ebene des Gehirns. Daher zielen neue Studien darauf ab, potenzielle Therapeutika zu untersuchen, die verhindern können, dass diese schädlichen Faktoren im Blut mit den Endothelzellen des Gehirns interagieren.

Die kommerziell erhältlichen Geräte Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) und cellZscope messen die Impedanz von zellulären Monoschichten, wie z. B. dem BHS-Endothel, um deren Barrierestärke zu bestimmen. Hier beschreiben wir die Verwendung beider Biosensoren zur Beurteilung der Integrität der endothelialen Barriere des Gehirns nach Hinzufügung verschiedener Stimuli. Entscheidend ist, dass wir die Bedeutung ihrer Hochdurchsatzfähigkeit für die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Variablen und biologischer Behandlungen hervorheben.

Einleitung

In diesem Artikel werden aktuelle Trends bei der Beurteilung von mikrovaskulären Zellen diskutiert. Wir beschreiben insbesondere die Verwendung von zwei kommerziell erhältlichen Plattformen zur Messung der Barriereeigenschaften von zerebralen mikrovaskulären Endothelzellen. Endothelzellen sind dem Blut zugewandte Zellen, die die Gefäßwand auskleiden. Zerebrale Mikrogefäße sind jedoch einzigartig, da sie zur Bildung der schützenden Blut-Hirn-Schranke (BHS) ^{beitragen1,2,3}. Die BHS reguliert den Transport von Molekülen aus dem Blut zum Gehirn. Periphere Erkrankungen, die das zen....

Protokoll

1. Verwendung von ECIS zur Überwachung von Veränderungen der Integrität der Endothelbarriere des Gehirns als Reaktion auf verschiedene Behandlungen

1. Einrichten der Software, der Array-Station und des Rechners
   1. Schließen Sie die 96-Well-Array-Station an die Maschine an. Legen Sie die Array-Station in eine Plastiktüte und legen Sie sie mindestens 1 Stunde vor dem Assay in den Inkubator, damit sie sich aufwärmen kann. Entfernen Sie die Plastiktüte unmittelbar vor dem Experiment.
   2. Sobald Sie fertig sind, schalten Sie das Gerät ein und öffnen Sie die entsprechende Software auf dem Computer. Klicken Sie auf die Schaltfläche <....

Diskussion

Therapeutische Studien zu Krankheiten, die die BHS betreffen, müssen die Bedeutung der Integrität und Regulation der Endothelbarriere im Gehirn berücksichtigen. Zum Beispiel wird die Störung der Endothelbarriere des Gehirns bei der Metastasierung von Krebs in das Gehirn von anderen anatomischen Stellen kritisch untersucht. Denn das Hirnendothel bildet die erste Barriere gegen zirkulierende Tumorzellen. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, müssen In-vitro-Studien zur Integrität der Endothelbarriere repro.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
aMEM	Gibco	12561072	Melanoma cell base media
cellZscope array	nanoAnalytics	cellZscope2; software v4.3.1	TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tail	Gibco	A1048301	ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Brain endothelial media supplement
ECIS array	Applied Biophysics	ECIS ZΘ; software v1.2.163.0	Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate	Applied Biophysics	96W20idf	96-well biosensor plate
FBS	Sigma-Aldrich	12203C-500ML
GlutaMAX	Gibco	305050-061	Brain endothelial media supplement
hCMVEC	Applied Biological Materials	T0259	Brain endothelial cell line
hEGF	PeproTech	PTAF10015100	Brain endothelial media supplement
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3393	Brain endothelial media supplement
hFGF	PeproTech	PTAF10018B50	Brain endothelial media supplement
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Brain endothelial media supplement
IL-1β	PeproTech	200-01B	Cytokine
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	11074547001	Melanoma cell media supplement
M199	Gibco	11150-067	Brain endothelial cell base media
MilliQ water			Deionized water
PBS 1x	Gibco	10010-023
TNFα	PeproTech	300-01A	Cytokine
Transwell insert	Corning	CLS3464	Porous membrane insert
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Dissociation reagent