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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier demonstrieren wir die Technik der Verwendung impedanzbasierter Biosensoren: ECIS und cellZscope zur Messung der Endothelbarriere des Gehirns. Wir beschreiben die Vorbereitung und Technik des Hinzufügens verschiedener Stimuli zu einem in vitro-Modell des Gehirnendothels. Wir messen, erfassen und analysieren die Ergebnisse repräsentativ.

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) schützt das Hirnparenchym vor schädlichen Krankheitserregern im Blut. Die BHS besteht aus der neurovaskulären Einheit, die aus Perizyten, astrozytären Fußfortsätzen und fest verklebten Endothelzellen besteht. Hier bilden die Endothelzellen des Gehirns die erste Barrierelinie gegen durch Blut übertragbare Krankheitserreger. Bei Erkrankungen wie Krebs und Neuroinflammation können zirkulierende Faktoren im Blut diese Barriere stören. Das Fortschreiten der Erkrankung verschlechtert sich nach der Unterbrechung der Barriere erheblich, was den Zugang zu oder die Beeinträchtigung von Regionen des Gehirns ermöglicht. Dies verschlechtert die Prognosen erheblich, insbesondere aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten auf der Ebene des Gehirns. Daher zielen neue Studien darauf ab, potenzielle Therapeutika zu untersuchen, die verhindern können, dass diese schädlichen Faktoren im Blut mit den Endothelzellen des Gehirns interagieren.

Die kommerziell erhältlichen Geräte Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) und cellZscope messen die Impedanz von zellulären Monoschichten, wie z. B. dem BHS-Endothel, um deren Barrierestärke zu bestimmen. Hier beschreiben wir die Verwendung beider Biosensoren zur Beurteilung der Integrität der endothelialen Barriere des Gehirns nach Hinzufügung verschiedener Stimuli. Entscheidend ist, dass wir die Bedeutung ihrer Hochdurchsatzfähigkeit für die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Variablen und biologischer Behandlungen hervorheben.

Einleitung

In diesem Artikel werden aktuelle Trends bei der Beurteilung von mikrovaskulären Zellen diskutiert. Wir beschreiben insbesondere die Verwendung von zwei kommerziell erhältlichen Plattformen zur Messung der Barriereeigenschaften von zerebralen mikrovaskulären Endothelzellen. Endothelzellen sind dem Blut zugewandte Zellen, die die Gefäßwand auskleiden. Zerebrale Mikrogefäße sind jedoch einzigartig, da sie zur Bildung der schützenden Blut-Hirn-Schranke (BHS) beitragen1,2,3. Die BHS reguliert den Transport von Molekülen aus dem Blut zum Gehirn. Periphere Erkrankungen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) betreffen, sind häufig mit einem Funktionsversagen der BHS verbunden 4,5. Die anatomischen Strukturen, die die BHS bilden, sind an der Blut-Gewebe-Grenzfläche an anderer Stelle im Körper nicht vorhanden6. Diese anatomischen Strukturen bestehen aus Perizyten, die sich in der Nähe der Endothelzellen des Gehirns befinden und deren Proliferation und Permeabilität regulieren; astrozytäre Fußfortsätze, die an der Nährstoffmischung und der anatomischen Unterstützung beteiligt sind 7,8; Mikroglia, die die im Gehirn ansässigen Makrophagen sind, die häufig an Neuroinflammation und Ischämie beteiligt sind 9,10,11,12, und das Hirnendothel, das eine Monoschicht aus fest verklebten Zellen ohne Fenestrationen bildet13,14. Das Hirnendothel ist in der Regel als "Hirnendothelbarriere" bekannt und bildet auf fünf verschiedene Arten eine strukturelle und funktionelle Barriere. Zunächst wird die parazelluläre Barrierekomponente durch Adhäsion an lateralen Zell-Zell-Verbindungen gebildet. Zweitens wird die transzelluläre Barrierekomponente durch die Regulierung der Endozytose aufrechterhalten. Drittens verankert und stützt eine spezialisierte Basalmembran das Endothel über eine reichhaltige extrazelluläre Matrix, die hauptsächlich aus Kollagen besteht15,16. Die letzten beiden Mechanismen erfolgen über Enzyme und Transporter, die helfen, den Stoffwechsel von Medikamenten bzw. die Aufnahme großer Moleküle zu regulieren17.

Die parazellulären Wechselwirkungen bilden die Hauptkomponente der endothelialen Barriere des Gehirns, die durch Tight Junctions (TJs) erleichtert wird, die aus den Membranproteinen Claudin, Occludin und junktionalen Adhäsionsmolekülen (JAMs) bestehen18. Die starke homotypische Bindung der Membranproteine bildet die erste strukturelle Barriere, obwohl JAMs auch an akzessorische Proteine zonula occludens binden und so die TJs an das Aktin-Zytoskelett binden19,20. Die Aktin-Links platzieren die TJs in der apikalen Region des Endothels21, die die Endothelzellen funktionell polarisiert, um die strukturelle Barriere auf dieser apikalen oder "blutzugewandten" Seite zu bilden. In der basolateralen Region des Endothels spielen hochspezialisierte Adherens-Junctions (AJs) eine regulatorische Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellmorphologie. AJs bestehen aus kalziumabhängigen Cadherinen, die das Zytoskelett benachbarter Endothelzellen über den Catenin-Familienkomplexverbinden 20,22. Vaskuläres endotheliales Cadherin (VE-Cadherin) ist ein solches Cadherin, das die Expression von TJ-Proteinen und die gesamte endotheliale Barrierefunktion reguliert, um die Integrität der endothelialen Monoschicht aufrechtzuerhalten 23,24,25,26,27. Entzündungsmodulatoren wie der Tumornekrosefaktor-alfa (TNFα) signalisieren die VE-Cadherin-Internalisierung weg von den Zellverbindungen, was zu einer Destabilisierung der Endothelbarriere führt 28,29,30. Das Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül (PECAM)31 ist ein weiteres AJ-Cadherin, das die Endothelverbindungen stabilisiert und umbaut32,33. Die Dichte dieser Verbindungsproteine schränkt den Elektronenfluss durch den parazellulären Raum zwischen den Endothelzellen ein. Dieses Attribut wird verwendet, um die Stärke der endothelialen Barriere oder den transendothelialen elektrischen Widerstand (TER) in konfluenten Zellmonoschichten wie dem Endothel des Gehirns zu messen.

Therapeutische Studien konzentrieren sich auf das Endothel des Gehirns, da es eine wichtige Rolle an der Blut-Hirn-Schnittstelle spielt. Mehrere Krankheiten wirken sich negativ auf das Endothel des Gehirns aus, darunter neuroinflammatorische Erkrankungen wie Multiple Sklerose, Schlaganfall, neurodegenerative Erkrankungen und Krebs 34,35,36,37. Sobald die Endothelschranke des Gehirns gestört ist, verschlechtert sich das Fortschreiten der Krankheit erheblich, da das Gehirn effektiv den schädlichen Reizen im Blut ausgesetzt ist38. Wir haben bereits gezeigt, dass Entzündungsmediatoren und metastasierende Melanomzellen die Endothelbarriere des Gehirns stören, indem wir zwei Technologien verwendet haben, die die Stärke der Endothelbarriere messen 39,40,41.

Die elektrische Zellsubstrat-Impedanzmessung (ECIS) ist ein impedanzbasierter Biosensor, der eine markierungsfreie Echtzeitbewertung der Integrität der Endothelzellbarriere ermöglicht. Hier sind die Assay-Wells mit vergoldeten Elektroden ausgekleidet, wodurch Wechselstrom (AC) in das Assay-System eingeleitet wird. In diese Vertiefungen werden Endothelzellen des Gehirns ausgesät, was bedeutet, dass AC durch die Zellen verabreicht werden kann. (Abbildung 1A-Brunnen; Seitenansicht). Dadurch wird der elektrische Stromkreis aufgebaut, der zur Berechnung der Impedanz herangezogen wird (Abbildung 1A-Schaltplan). Die Impedanz nimmt zu, wenn die Endothelzellen des Gehirns an der Platte haften und beginnen, ihre parazellulären Verbindungen zu bilden. Die Impedanz erreicht ein Plateau, wenn die Endothelzellen zusammenfließen, eine Monoschicht bilden und den Stromfluss einschränken. Die Anwendung von Wechselstrom bei unterschiedlichen Frequenzen beeinflusst den Weg des Stromflusses durch die Endothelzellen. Der Strom fließt durch den Endothelzellkörper, wenn er mit einer höheren Frequenz (>10,4 Hz) angelegt wird. Dies gibt Aufschluss über die Kapazität der Zellmonoschicht, die zur Beurteilung der Zelladhäsion und -ausbreitung verwendet wird. Bei niedrigen Frequenzen (10,2-10,4 Hz) ist die Membranimpedanz hoch, was den Stromfluss durch die Zellen einschränkt. In diesem Fall navigiert der Großteil des Stroms zwischen den Zellen. Bei etwa 4.000 Hz wird der Widerstand gegen den Stromfluss hauptsächlich auf die endothelialen Zell-Zell-Verbindungen über den Interzellularraum zurückgeführt. Daher gibt jede Änderung des Widerstands bei dieser Frequenz Aufschluss über die Integrität der Endothelbarriere.

Während Rohimpedanzmessungen Aufschluss über die Barriereeigenschaften geben können, kann die ECIS-Software dann den über mehrere Wechselstromfrequenzen gemessenen Gesamtwiderstand mathematisch modellieren und ihn genauer in zwei Schlüsselparameter der Barriereintegrität unterteilen. Diese Parameter sind der parazelluläre Widerstand zwischen den lateralen Membranen benachbarter Zellen (Resistenz beta-Rb; parazelluläre Barriere; Abbildung 1A-grüne Pfeile) und der basolaterale Widerstand zwischen der Basalzellschicht und der Elektrode (Widerstand alpha-Alpha; basolaterale Barriere; Abbildung 1A-blaue Pfeile). Ein dritter modellierter Parameter wird ebenfalls als Zellmembrankapazität (Cm; Abbildung 1A - rote Pfeile). Das Cm zeigt den kapazitiven Stromfluss durch die Zellen an, der auf die Zusammensetzung der Zellmembran hinweist. Hier deuten Veränderungen der Rb- oder parazellulären Barriere auf Veränderungen in den TJs und AJs hin, die für die Aufrechterhaltung der Integrität der Endothelbarriere entscheidend sind. Um den Rb zuverlässig zu interpretieren, werden vier Schlüsselannahmen getroffen, wie sie von Giaever und Keese42 entwickelt und von Stolwijk et al. kritisch diskutiert wurden.43. Obwohl diese Annahmen wichtig sind, um die Gültigkeit der ECIS-Modellierung zu gewährleisten, werden sie von einer konfluenten endothelialen Monoschicht ohne weiteres erfüllt.

Wie ECIS ermöglicht das cellZscope die Messung von Änderungen des Endothelbarrierewiderstands; Die Zellen werden jedoch auf einem porösen Membraneinsatz kultiviert. Bei diesem System befindet sich der Stromkreis zwischen zwei Elektroden auf beiden Seiten eines Membraneinsatzes. Die endotheliale Monoschicht wird auf diesem Membraneinsatz kultiviert, was die Messung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TER) ermöglicht (Abbildung 1B-Well; Seitenansicht). Wie bei ECIS kann auch bei diesem System die Gesamtimpedanz auf mehrere Barrierekomponenten zurückgeführt werden, die von der Frequenz des angelegten Stromsabhängen 44. Bei niedrigen Frequenzen dominiert die Elektrodenkapazität (CEl) die Gesamtimpedanz des Systems. Alternativ dominiert bei hohen Frequenzen der Widerstand des Mediums (R-Medium) die Gesamtimpedanz. Daher liegen die brauchbarsten Messungen im mittleren Frequenzbereich (102-10 4 Hz), der Aufschluss über zwei Schlüsselkomponenten der Endothelbarriere gibt (Abbildung 1B-Schaltplan). Erstens dominiert bei 103-10 4 Hz die Kapazität der Zellschicht (CCl) die Gesamtimpedanz, da der Membranwiderstand(R-Membran) hoch genug ist, um vernachlässigt zu werden, und der Strom überwiegend über den Kondensator fließt. Das CCl zeigt also Veränderungen der Resistenz durch die Zellmembran an. Alternativ vermittelt TER überwiegend die Gesamtimpedanz bei 10 2-10 3 Hz, wobei der Stromfluss durch Übergangsräume zwischen benachbarten Zellen geleitet wird, die durch Verbindungsproteine zusammengehalten werden. Dies liefert somit Informationen über die parazelluläre Komponente der Endothelbarriere, wie sie zuvor bei Rb auf ECIS beobachtet wurde.

Abbildung 1C zeigt, wie bestimmte Regionen des Endothels des Gehirns durch die Behandlung mit Melanomzellen gestört werden. Diese Störung wird von den Biosensoren durch eine Änderung des Stromflusses durch den parazellulären Raum (gemessen als Rb oder TER) erkannt; der basolaterale Raum (gemessen als Alpha); und die Zellmembran (gemessen als Cm oder CCl). Wir haben beide Biosensoren, die in dieser Einführung beschrieben werden, verwendet, um die Veränderung der Endothelbarriere des Gehirns nach der Behandlung mit verschiedenen Stimuli wie Zytokinen oder invasiven Melanomzellen zu messen. Der gemessene Widerstand nimmt ab, wenn ein gegebener Reiz die Endothelbarriere unterbricht, wodurch ein Pfad mit dem geringsten Widerstand entsteht, um den Stromfluss zu ermöglichen. Daher deutet eine Abnahme der "Barriereresistenz" auf einen Verlust der Barriereintegrität oder eine Störung der endothelialen Barriere des Gehirns hin. In diesen Assays haben wir diese Störung untersucht, indem wir den Widerstand und modellierte Parameter in Echtzeit interpretiert haben. Die Anwendung von ECIS und cellZscope bei der Beantwortung solcher Forschungsfragen wird an anderer Stelle ausführlich beschrieben 39,41,45,46.

Die In-vitro-Forschung ermöglicht die Entdeckung entscheidender Krankheitsmechanismen, indem sie Moleküle und Funktionswege aufdeckt, die die Krankheit fortschreiten. Dies erfordert jedoch eine zuverlässige Vermehrung der Krankheit in vitro, die sich wesentlich von einem funktionierenden Körper unterscheidet. Im Idealfall sollte die In-vitro-Forschung reproduzierbar, nicht-invasiv, markierungsfrei, quantitativ sein und strukturelle Einflüsse nachahmen, die in vivo gefunden werden. In diesem Artikel beschreiben wir die Methodik für die Verwendung dieser beiden konkurrierenden Technologien zur Messung behandlungsinduzierter Veränderungen der Integrität der Endothelbarriere des Gehirns. Wir diskutieren die Vorteile der Kombination ihrer Ergebnisse, um ein umfassenderes Bild der Barrierendurchbrüche zu erhalten und Grenzen zu teilen, die noch überwunden werden müssen.

Protokoll

1. Verwendung von ECIS zur Überwachung von Veränderungen der Integrität der Endothelbarriere des Gehirns als Reaktion auf verschiedene Behandlungen

  1. Einrichten der Software, der Array-Station und des Rechners
    1. Schließen Sie die 96-Well-Array-Station an die Maschine an. Legen Sie die Array-Station in eine Plastiktüte und legen Sie sie mindestens 1 Stunde vor dem Assay in den Inkubator, damit sie sich aufwärmen kann. Entfernen Sie die Plastiktüte unmittelbar vor dem Experiment.
    2. Sobald Sie fertig sind, schalten Sie das Gerät ein und öffnen Sie die entsprechende Software auf dem Computer. Klicken Sie auf die Schaltfläche Setup auf der Registerkarte Collect Data . Die Software führt eine Verbindungsprüfung durch, die den Typ des angeschlossenen Adapters (z. B. 96-Well-Array-Station) erkennt und rote Wells in der dargestellten Plattenkarte anzeigt. Dies besagt, dass die Software den Adapter erkennt, aber eine angebrachte Platte nicht erkennen kann. Das System ist nun bereit für die 96-Well-Platte.
  2. Vorbereiten der 96-Well-Biosensorplatte
    HINWEIS: Es wird die 96-Well-Plattenanordnung verwendet. Der Boden jeder Vertiefung ist mit ineinander verzahnten Fingern aus vergoldeten Elektroden gemustert. Die Platten werden in sterilen Packungen geliefert, die nur in einer sterilen Haube/biologischen Sicherheitswerkbank geöffnet werden sollten. Die Goldelektroden müssen zunächst durch Zugabe von 10 mM Cystein chemisch stabilisiert werden, um die Elektrodenkapazität zu erhalten.
    1. Bereiten Sie das 10 mM Cystein in einem sterilen Trog vor und pipettieren Sie mit einem Mehrkanal vorsichtig 100 μl in jede Vertiefung. Inkubieren Sie das Cystein 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und aspirieren Sie es dann vorsichtig, wobei Sie nur an den Rändern der Vertiefung pipettieren, um ein Zerkratzen der Elektrode zu vermeiden. Waschen Sie das Cystein mindestens 2x mit sterilem deionisiertem Wasser (nicht PBS) mit der gleichen Pipettiertechnik ab.
      HINWEIS: Die Plattenelektroden können auch elektrisch mit warmen Medien auf dem ECIS-Gerät stabilisiert werden, anstatt eine Cysteinbeschichtung zu verwenden, wie im Protokoll des Herstellers beschrieben.
    2. Bereiten Sie das ECM-Substrat so vor, dass es als Basalmembran auf dem Boden der Vertiefung wirkt.
      HINWEIS: ECM-Substrate wie Kollagen oder Laminin können je nach den Anforderungen der Endothelzelllinie des Gehirns gewählt werden. Hier verwenden wir Kollagen für eine humane zerebrale mikrovaskuläre Endothelzelllinie (hCMVEC).
    3. Bereiten Sie 1 μg/cm2 Rattenschwanzkollagen I in 0,02 M Essigsäure in einem frischen, sterilen Trog (100 μL pro Vertiefung) vor. Lassen Sie das Kollagen 1 h bei schwachem Licht in der sterilen Haube, waschen Sie es dann 2x vorsichtig mit deionisiertem Wasser und pipettieren Sie es vorsichtig.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass nach dem letzten Waschen so viel wie möglich von deionisiertem Wasser entfernt wird, und lassen Sie die Platte in der Haube trocknen. Es wird empfohlen, die Platte kurz nach der Beschichtung zu verwenden. Es kann jedoch vorübergehend (unter einer Woche) in Wasser bei 4 °C gelagert werden. Die Platte ist nun gebrauchsfertig.
  3. Vorbereitung der Endothelzellen des Gehirns für die Aussaat auf die 96-Well-Biosensorplatte
    HINWEIS: Es wird empfohlen, zunächst die Wachstumsphase und die Aussaatdichte der zu verwendenden Endothelzelllinie zu optimieren. In diesem Protokoll wurde die hCMVEC-Linie verwendet, die nach der Aussaat von 20.000 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte 48 Stunden benötigt, um die Konfluenz zu erreichen.
    1. Ernten Sie die Endothelzellen des Gehirns in einer sterilen Haube mit einem sanften Dissoziationsreagenz und führen Sie eine genaue Zellzählung durch. Verwenden Sie 20.000 hCMVECs in 100 μl Medium pro Vertiefung für eine stetige Wachstumsphase für 48 Stunden. Bereiten Sie überschüssige Endothelzellen des Gehirns vor, um ein optimales Pipettieren aller 96 Wells zu gewährleisten.
      HINWEIS: Daher werden für eine 96-Well-Platte ca. 2.000.000 Zellen in 10 ml vorgewärmtem Medium benötigt.
    2. Übertragen Sie die Endothelzellen des Gehirns in einen frischen sterilen Trog und fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig 100 μl (20.000 Zellen) der Zellsuspension pro Vertiefung hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen regelmäßig sanft im Trog, um zu vermeiden, dass sich die Endothelzellen mit der Zeit absetzen. Stellen Sie sicher, dass 1 Vertiefung nur Medien und keine Zellen enthält, um eine mathematische Modellierung zu ermöglichen (zellfreie Vertiefung) und dass die gesamte Platte innerhalb von 30 s ausgesät wird.
  4. Starten des Experiments
    1. Befestigen Sie die Platte vorsichtig am Adapter im Inkubator, indem Sie die roten Clips auf beiden Seiten des Plattenadapters nach außen schieben. Richten Sie die Vertiefung A1 der Platte an der A1-Region des Adapters aus. Halten Sie die Platte vorsichtig mit einer Hand darauf fest und klicken Sie mit der anderen Hand die roten Clips wieder ein.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Platte stabil im Adapter sitzt.
    2. Schließen Sie den Inkubator und drücken Sie erneut auf Setup . Suchen Sie in der Plattenkarte nach grünen Vertiefungen, die auf korrekt erkannte Vertiefungen hinweisen. Alle Wells, die rot angezeigt werden, weisen einen Verbindungsfehler auf. Um dies zu beheben, bringen Sie die Platte schnell wieder an,
      HINWEIS: Übermäßiger Zeitaufwand für den Versuch, Vertiefungen mit schlechten Verbindungen zu reparieren, kann die Zellgesundheit beeinträchtigen.
    3. Drücken Sie Prüfen , um die Aufsätze erneut als absolute Impedanzanzeigen zu überprüfen. Dies dauert einige Minuten.
    4. Drücken Sie auf den Pfeil unter der Plattenmaske, um sicherzustellen, dass der richtige Plattenkatalog ausgewählt ist. In diesem Fall ist es 96w20idf.
    5. Drücken Sie die Multifrequenz-Taste , um sicherzustellen, dass die Impedanz bei mehreren Wechselstromfrequenzen gemessen wird, um zukünftige mathematische Modellierungen zu ermöglichen.
    6. Drücken Sie Start , um das Experiment zu starten. Lassen Sie die Zellen ~48 h lang proliferieren und bilden Sie ihre typische Monoschicht mit hohem Widerstand, gemessen an einer Erhöhung der Ohm.
  5. Behandlung der Endothelzellen des Gehirns mit Krebszellen oder Zytokinen auf der 96-Well-Platte
    HINWEIS: Da die 96-Well-Platte das gleichzeitige Testen mehrerer Stimuli ermöglicht, erstellen Sie eine übersichtliche Plattenkarte mit den gewünschten Behandlungsoptionen (Ergänzende Abbildung S1-unten). Jede Behandlung kann und muss durchgeführt werden Mindestens in dreifacher Ausfertigung (drei replizierbare Vertiefungen), um statistische Analysen zu ermöglichen; Vier Replikate werden jedoch in Ergänzende Abbildung S1.
    1. Überprüfen Sie nach 48 Stunden das Wachstum der Endothelzellen des Gehirns. Stellen Sie sicher, dass ein Plateau erreicht ist, bevor Sie Behandlungslösungen vorbereiten.
      HINWEIS: Unterschiedliche Endothelzelllinien können unterschiedlich lange brauchen, um ein Plateau zu erreichen. Daher müssen ihre Wachstumsphase und die Aussaatdichte vor der Durchführung dieses Experiments optimiert werden. Die Bohrlöcher sollten in der Regel innerhalb derselben Stunde ein Plateau erreichen. Ist dies nicht der Fall, könnten sie kompromittiert oder ungenau pipettiert werden und dürfen nicht aufgenommen werden.
    2. Für die Behandlung mit Zytokinen sind geeignete Konzentrationen der Zytokine in vorgewärmten vollständigen Medien zusammen mit den entsprechenden Vehikel- und Medienkontrollen vorzubereiten.
      1. Bereiten Sie die Zytokine in der 2-fachen gewünschten Endkonzentration vor, da sie 1:1 verdünnt werden, wenn sie in jede Vertiefung gegeben werden, die Endothelzellen des Gehirns enthält.
      2. Damit jede Behandlung in dreifacher Ausführung durchgeführt werden kann, bereiten Sie alle Zytokine in einem Gesamtvolumen von mehr als 300 μl (d. h. mindestens 350 μl insgesamt) für eine Behandlungszugabe von 100 μl pro Vertiefung vor.
    3. Für die Behandlung mit Zellen ernten Sie die Zellen (drei verschiedene vom Patienten stammende Melanomzelllinien, die in diesem Protokoll verwendet werden) mit einem sanften Dissoziationsreagenz und führen Sie eine genaue Zellzählung durch. Führen Sie zellbasierte Behandlungen mit einem Top-Effektor:Ziel-Verhältnis (E:T-Verhältnis) von 1:1 durch, wobei die Behandlungszellen die Effektorzellen (z. B. Melanomzellen) und die Endothelzellen des Gehirns die Zielzellen sind, d. h. fügen Sie 20.000 Melanomzellen zu 20.000 Endothelzellen des Gehirns pro Vertiefung hinzu.
      1. Bei Bedarf für kleinere E:T-Verhältnisse von 1:10 oder 1:100 seriell verdünnen. Um die Behandlung in dreifachen Vertiefungen zu ermöglichen, zählen Sie die Zellen und bereiten Sie sie in über 300 μl Gesamtvolumen (d. h. mindestens 350 μl insgesamt) für die Behandlungszugabe von 100 μl pro Vertiefung vor.
    4. Beschriften Sie 1,1-ml-Polypropylen-Cluster-Röhrchen, die im 8-Röhrchen-Streifenformat (d. h. 1-ml-Streifenröhrchen) gemäß der 96-Well-Plattenkarte geliefert werden (Ergänzende Abbildung S1-Top). Setzen Sie die Streifenröhrchen in die Streifenrohrplatten ein und autoklavieren Sie diese vor dem Experiment. Geben Sie das Gesamtvolumen der Behandlungszytokine oder -zellen (d. h. volle 350 μl Behandlung) in die sterilen Streifenröhrchen und lassen Sie sie im Inkubator, um sie warm zu halten.
    5. Drücken Sie in der Software auf Pause , um das Experiment anzuhalten. Dies kann einige Sekunden dauern. Öffnen Sie nach der Pause den Inkubator und lösen Sie vorsichtig die beiden roten Clips mit einer Hand, während Sie die Platte mit der anderen Hand stabilisieren. Halten Sie das Experiment pausiert und bringen Sie die Platte in die sterile Haube.
    6. Entfernen Sie die Röhrchen des Behandlungsstreifens aus dem Inkubator. Mit einer Mehrkanalpipette den Inhalt der Behandlungsstreifenröhrchen vorsichtig resuspendieren und dann 100 μl Behandlung aus den Streifenröhrchen in die richtigen Vertiefungen auf der 96-Well-Platte geben, ohne den Boden der Vertiefung zu berühren. Geben Sie vorsichtig eine Behandlung in alle Vertiefungen und Medien nur in die zellfreie Vertiefung und führen Sie diesen Schritt in weniger als 5 Minuten für eine volle 96-Well-Platte durch, da eine übermäßige Abkühlung die Widerstandsfähigkeit der endothelialen Monoschicht beeinträchtigt.
    7. Setzen Sie die behandelte Platte wieder in die Maschine ein, bringen Sie sie wie zuvor an und überprüfen Sie dann erneut die Elektrodenverbindungen zum Adapter, indem Sie Setup | Stimmt.
    8. Stellen Sie sicher, dass der richtige Plattenkatalog und die richtigen Einstellungen für die Mehrfrequenzerfassung ausgewählt sind, und drücken Sie Fortsetzen , um das Experiment fortzusetzen. Warten Sie, bis das Experiment fortgesetzt wird, und führen Sie es bis zum gewünschten Endpunkt aus.
    9. Drücken Sie auf Fertig stellen , um das Experiment abzuschließen, wodurch die aufgezeichnete abp.-Datei automatisch gespeichert wird. Navigieren Sie zu Datei | Daten exportieren , um diese Datei als xls abzurufen. oder csv. Datei für weitere Analysen.

2. Verwendung von cellZscope zur Überwachung von Veränderungen der Integrität der Endothelbarriere des Gehirns als Reaktion auf verschiedene Behandlungen

  1. Vorbereiten der Metallkomponenten, des Adapters und des Einsatzes der porösen Membran des Geräts
    1. Reinigen Sie die Metallkomponenten nacheinander mit entionisiertem Wasser, dann mit 70 % Ethanol und dann wieder mit entionisiertem Wasser.
    2. Autoklavieren Sie die untere Elektrode oder die "Töpfe" und die oberen Tauchelektroden und sterilisieren Sie alle anderen Komponenten des Zellmoduls mit 70 % Ethanol.
    3. Installieren Sie in einer sterilen Haube alle 24 unteren Elektroden/"Töpfe", indem Sie sie in das Zellmodul einschrauben, wobei Sie darauf achten, dass die Sterilität durchgehend erhalten bleibt.
    4. Geben Sie 900 μl Basismedium in die Vertiefungen.
      HINWEIS: Das Basismedium wird in die untere Vertiefung gegeben, die als Basalkompartiment des Endothels fungiert. Es wird empfohlen, in diesem Kompartiment kein Serum zu verwenden, um die basale Umgebung des Gehirnendothels zuverlässiger zu replizieren.
    5. Verbinden Sie die Tauchelektroden magnetisch mit dem Deckel des Zellmoduls und schließen Sie den Deckel über den Vertiefungen, sodass die Tauchelektroden in die unteren Elektrodentöpfe gesteckt werden.
    6. Befestigen Sie das Cell Module an dem Adapter in einem Inkubator und lassen Sie es mindestens 1 h lang äquilibrieren. Öffnen Sie zu diesem Zeitpunkt die Software, um die experimentelle Plattenkarte auf der Registerkarte Layout zu laden, wodurch die Behandlungsplattenkarte in die Dateien eingebettet wird, die letztendlich die Daten enthalten.
    7. Wenn eine Beschichtung erforderlich ist, beschichten Sie die Membraneinsätze in einer sterilen Haube, indem Sie eine sterile 24-Well-Kulturplatte verwenden, um die Einsätze zu halten, und das ECM-Substrat (z. B. Kollagen) in den inneren Teil der Vertiefung geben, wie in Abschnitt 1.2.3 beschrieben. Verwenden Sie eine Einkanalpipette, um das EZM-Substrat vorsichtig in jede Vertiefung zu laden.
  2. Vorbereitung der Endothelzellen des Gehirns für die Aussaat auf den Membraneinsatz und Start des Experiments
    1. Die Endothelzellen des Gehirns werden gemäß Abschnitt 1.3 entnommen und gezählt, aber die abschließende erforderliche Zelltitration in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen vorbereitet. Stellen Sie sicher, dass sich die geernteten Zellen in einem warmen, vollständigen Medium befinden, einschließlich aller erforderlichen Wachstumsfaktoren und des Serums.
    2. Mit einer Einkanalpipette säen Sie die Endothelzellen des Gehirns (80.000 in diesem Protokoll) vorsichtig in die apikale Kammer eines Wells ein, das in 350 μl vollständiges Medium eingesetzt wird.
    3. Fügen Sie eine zellfreie Vertiefung hinzu, indem Sie das gesamte Medium nur in einen der Einsätze pipettieren.
    4. Nehmen Sie das Zellmodul aus dem Inkubator und legen Sie es in die sterile Haube. Übertragen Sie die vorbereiteten Einsätze mit einer Pinzette in die unteren Elektrodentöpfe, um nur die oberen Stützen des Einsatzes zu bearbeiten. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen unter der Membran.
    5. Setzen Sie das Cell Module wieder in den Inkubator über den Adapter ein.
    6. Wählen Sie in der Software auf der Registerkarte "Experiment " im Abschnitt "Spektrum " die Option "Bei 1 Hz starten " und "Bei 100 kHz stoppen " aus, um Daten über den gesamten Frequenzbereich zu erfassen. Wählen Sie feine Schritte.
    7. Wählen Sie unter Wartezeit die Option 15 Minuten aus, um kontinuierliche Messungen mit der schnellsten Geschwindigkeit zu ermöglichen, die von der Software durchgeführt wird.
    8. Drücken Sie Start , um das Experiment zu starten und den Endothelzellen des Gehirns zu erlauben, sich zu vermehren und eine Monoschicht mit hohem Widerstand zu bilden. Dieser Schritt dauert ca. 48 h.
  3. Behandlung der Endothelzellen des Gehirns mit Krebszellen und Zytokinen auf den Membraneinsätzen
    1. Nach 48 Stunden sind die Zytokine oder Zellen (z. B. Melanomzellen) gemäß Abschnitt 1.5 für die Behandlung vorzubereiten, gegebenenfalls einschließlich der Durchführung von Zellzählungen, und in 1-ml-Streifenröhrchen oder Äquivalenten auffangen.
    2. Bereiten Sie die Behandlung in den richtigen Konzentrationen vor, indem Sie 70 μl in jede Vertiefung (Einsatz) geben. Legen Sie die Behandlungen in den Inkubator, um sich warm zu halten.
    3. Da das Instrument alle 15 Minuten Messungen durchführt, wählen Sie eine Behandlungszeit, die unmittelbar nach Abschluss einer Messung beginnt. Nehmen Sie zu diesem Zeitpunkt das Cell Module aus dem Inkubator und wischen Sie es vorsichtig mit fusselfreien Tüchern mit 70 % Ethanol ab.
    4. Öffnen Sie in einer sterilen Haube das Cell Module und pipettieren Sie vorsichtig 70 μl der Behandlung in die apikale Kammer des jeweiligen Einsatzes. Tun Sie dies mit einer Einkanalpipette und fügen Sie sie in kreisenden Bewegungen hinzu, um Blasen zu vermeiden. Schließen Sie diesen Schritt in weniger als 10 Minuten ab, um das Cell Module wieder an den Adapter zu senden, bevor die nächste Messung beginnt.
    5. Drücken Sie Stopp , um das Experiment zu beenden. Exportieren Sie die Daten direkt in eine xls-Datei. Datei unter dem Menüpunkt Datei | Registerkarte Exportieren . Benennen und speichern Sie diese Datei nach dem Öffnen entsprechend.

Ergebnisse

Interpretation von ECIS-Impedanzdaten

Optimale Versuchsbedingungen verstehen
Dabei können die Daten direkt mit der Software angezeigt werden (Abbildung 2A) oder zur Analyse und grafischen Darstellung exportiert werden (Abbildung 2B). Abbildung 2A zeigt ein Beispiel für Daten, die auf der tatsächlichen Softwareschnittstelle angezeigt werden. Das linke Diagramm...

Diskussion

Therapeutische Studien zu Krankheiten, die die BHS betreffen, müssen die Bedeutung der Integrität und Regulation der Endothelbarriere im Gehirn berücksichtigen. Zum Beispiel wird die Störung der Endothelbarriere des Gehirns bei der Metastasierung von Krebs in das Gehirn von anderen anatomischen Stellen kritisch untersucht. Denn das Hirnendothel bildet die erste Barriere gegen zirkulierende Tumorzellen. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, müssen In-vitro-Studien zur Integrität der Endothelbarriere repro...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Akshata Anchan wurde von der Neurological Foundation of New Zealand für das Gillespie-Stipendium (Förderkennzeichen: 1628-GS) und das First Fellowship (Förderkennzeichen: 2021 FFE) gefördert. Die Forschungskosten wurden auch teilweise durch das Neurological Foundation Fellowship-2021 FFE und den Faculty Research Development Fund der University of Auckland finanziert. James Hucklesby wurde durch ein Stipendium der Auckland Medical Research Foundation finanziert. Vielen Dank an das Baguley-Team und das Auckland Cancer Society Research Centre für die von Patienten stammenden neuseeländischen Melanom-NZM-Zelllinien.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
aMEMGibco12561072Melanoma cell base media
cellZscope arraynanoAnalyticscellZscope2; software v4.3.1TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tailGibcoA1048301ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMPSigma-AldrichD0627Brain endothelial media supplement
ECIS array Applied BiophysicsECIS ZΘ; software v1.2.163.0Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate Applied Biophysics96W20idf 96-well biosensor plate
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Brain endothelial media supplement
hCMVECApplied Biological MaterialsT0259Brain endothelial cell line
hEGFPeproTechPTAF10015100Brain endothelial media supplement
HeparinSigma-AldrichH-3393Brain endothelial media supplement
hFGFPeproTechPTAF10018B50Brain endothelial media supplement
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Brain endothelial media supplement
IL-1βPeproTech200-01BCytokine
Insulin-Transferrin-Sodium SeleniteSigma-Aldrich11074547001Melanoma cell media supplement
M199Gibco11150-067Brain endothelial cell base media
MilliQ waterDeionized water
PBS 1xGibco10010-023
TNFαPeproTech300-01ACytokine
Transwell insertCorningCLS3464Porous membrane insert
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Dissociation reagent

Referenzen

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