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Resumo

Aqui demonstramos a técnica de uso de biossensores baseados em impedância: ECIS e cellZscope, para medir a força da barreira endotelial cerebral. Detalhamos a preparação e a técnica de adição de vários estímulos a um modelo in vitro do endotélio cerebral. Medimos, registramos e fornecemos uma análise representativa dos resultados.

Resumo

A barreira hematoencefálica (BHE) protege o parênquima cerebral contra patógenos nocivos no sangue. A BHE consiste na unidade neurovascular, compreendendo pericitos, processos astrocíticos do pé e células endoteliais fortemente aderidas. Aqui, as células endoteliais do cérebro formam a primeira linha de barreira contra patógenos transmitidos pelo sangue. Em condições como câncer e neuroinflamação, fatores circulantes no sangue podem romper essa barreira. A progressão da doença piora significativamente após a ruptura da barreira, o que permite o acesso ou comprometimento de regiões do cérebro. Isso piora significativamente os prognósticos, principalmente devido às opções limitadas de tratamento disponíveis no nível do cérebro. Assim, estudos emergentes visam investigar potenciais terapêuticas que podem impedir que esses fatores prejudiciais no sangue interajam com as células endoteliais do cérebro.

Os instrumentos Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) e cellZscope disponíveis comercialmente medem a impedância através de monocamadas celulares, como o endotélio BBB, para determinar sua força de barreira. Aqui detalhamos o uso de ambos os biossensores na avaliação da integridade da barreira endotelial cerebral após a adição de vários estímulos. Crucialmente, destacamos a importância de sua capacidade de alto rendimento para investigação simultânea de múltiplas variáveis e tratamentos biológicos.

Introdução

Este artigo discute as tendências atuais na avaliação de células microvasculares. Detalhamos especificamente o uso de duas plataformas comercialmente disponíveis para medir as propriedades de barreira das células endoteliais microvasculares cerebrais. As células endoteliais são células voltadas para o sangue, que revestem a parede do vaso. No entanto, os microvasos cerebrais são únicos, pois ajudam a formar a barreira hematoencefálica protetora (BHE)1,2,3. O BBB funciona para regular o transporte de moléculas do sangue para o cérebro. As doenças periféricas que acometem o sistema nervoso central (SNC) são comumente associadas a uma falha funcional da BHE 4,5. As estruturas anatômicas que formam a BHE não estão presentes na interface sangue-tecido em outras partes do corpo6. Essas estruturas anatômicas compreendem pericitos, que estão localizados próximos às células endoteliais cerebrais, e regulam sua proliferação e permeabilidade; processos astrocíticos do pé, que estão envolvidos no embaralhamento de nutrientes e suporte anatômico 7,8; a micróglia, que são os macrófagos residentes no cérebro, frequentemente implicados na neuroinflamação e isquemia 9,10,11,12, e o endotélio cerebral, que forma uma monocamada de células fortemente aderidas sem fenestrações13,14. O endotélio cerebral é tipicamente conhecido como "barreira endotelial cerebral" e forma uma barreira estrutural e funcional de cinco maneiras distintas. Primeiro, o componente de barreira paracelular é formado por adesão nas junções laterais célula-célula. Em segundo lugar, o componente de barreira transcelular é sustentado pela regulação da endocitose. Em terceiro lugar, uma membrana basal especializada ancora e sustenta o endotélio por meio de uma rica matriz extracelular composta em grande parte por colágeno15,16. Os dois últimos mecanismos são por meio de enzimas e transportadores que ajudam a regular o metabolismo de drogas e a captação de grandes moléculas, respectivamente17.

As interações paracelulares formam o principal componente da barreira endotelial cerebral, facilitada por junções apertadas (TJs), compreendendo proteínas de membrana claudinas, oclusina e moléculas de adesão juncional (JAMs)18. A forte ligação homotípica das proteínas de membrana forma a primeira barreira estrutural, embora os JAMs também se liguem às proteínas acessórias zonula occludens, ligando assim os TJs ao citoesqueleto de actina19,20. As ligações de actina colocam os TJs na região apical do endotélio21, que polariza funcionalmente as células endoteliais para formar a barreira estrutural neste lado apical ou "voltado para o sangue". Na região basolateral do endotélio, junções aderentes (AJs) altamente especializadas desempenham um papel regulador na manutenção da morfologia celular. Os AJs compreendem caderinas dependentes de cálcio, que ligam o citoesqueleto das células endoteliais vizinhas por meio do complexo familiar da catenina20,22. A caderina endotelial vascular (VE-caderina) é uma dessas caderinas, que regula a expressão das proteínas TJ e a função geral da barreira endotelial para manter a integridade da monocamada endotelial 23,24,25,26,27. Moduladores inflamatórios, como o fator de necrose tumoral-alfa (TNFα), sinalizam a internalização da VE-caderina para longe das junções celulares, levando à desestabilização da barreira endotelial 28,29,30. A molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias (PECAM)31 é outra caderina AJ que estabiliza e remodela as junções endoteliais32,33. A densidade dessas proteínas juncionais restringe o fluxo de elétrons através do espaço paracelular entre as células endoteliais. Este atributo é utilizado para medir a força da barreira endotelial ou resistência elétrica transendotelial (TER) em monocamadas de células confluentes, como o endotélio cerebral.

Os estudos terapêuticos enfocam o endotélio cerebral devido ao seu papel vital na interface sangue-cérebro. Várias doenças afetam negativamente o endotélio cerebral, incluindo condições neuroinflamatórias como esclerose múltipla, acidente vascular cerebral, doenças neurodegenerativas e câncer 34,35,36,37. Uma vez que a barreira endotelial cerebral é rompida, a progressão da doença piora significativamente à medida que o cérebro é efetivamente exposto aos estímulos nocivos no sangue38. Mostramos anteriormente que mediadores inflamatórios e células de melanoma metastático rompem a barreira endotelial cerebral usando duas tecnologias que medem a força da barreira endotelial 39,40,41.

O sensor de impedância de substrato de célula elétrica (ECIS) é um biossensor baseado em impedância que permite a avaliação em tempo real e sem marcação da integridade da barreira celular endotelial. Aqui, os poços de ensaio são revestidos com eletrodos banhados a ouro, o que introduz corrente alternada (CA) no sistema de ensaio. As células endoteliais cerebrais são semeadas nesses poços, o que significa que a CA pode ser aplicada através das células. (Figura 1A-poço; vista lateral). Isso estabelece o circuito elétrico, que é usado para calcular a impedância (Figura 1A-diagrama de circuito). A impedância aumenta quando as células endoteliais cerebrais aderem à placa e começam a formar suas junções paracelulares. A impedância se estabiliza quando as células endoteliais se tornam confluentes, formando uma monocamada e restringindo o fluxo de corrente. A aplicação de CA em diferentes frequências influencia a rota de fluxo de corrente através das células endoteliais. A corrente flui através do corpo celular endotelial quando aplicada em uma frequência mais alta (>104 Hz). Isso fornece informações sobre a capacitância da monocamada celular, usada para avaliar a fixação e disseminação celular. Em baixas frequências (102-10 4 Hz), a impedância da membrana é alta, restringindo o fluxo de corrente através das células. Nesse caso, a maioria da corrente navega entre as células. Em aproximadamente 4.000 Hz, a resistência ao fluxo de corrente é atribuída principalmente às junções célula-célula endotelial, através do espaço intercelular . Portanto, qualquer alteração na resistência nessa frequência fornece informações sobre a integridade da barreira endotelial.

Embora as medições de impedância bruta possam fornecer informações sobre as propriedades da barreira, o software ECIS pode modelar matematicamente a resistência total medida em várias frequências CA e, mais precisamente, separá-la em dois parâmetros-chave de integridade da barreira. Esses parâmetros são a resistência paracelular entre as membranas laterais das células vizinhas (resistência beta-Rb; barreira paracelular; Figura 1A-setas verdes) e a resistência basolateral entre a camada de células basais e o eletrodo (resistência alfa-Alfa; barreira basolateral; Figura 1A - setas azuis). Um terceiro parâmetro modelado também é medido como a capacitância da membrana celular (Cm; Figura 1A - setas vermelhas). O Cm exibe o fluxo capacitivo de corrente através das células, indicativo da composição da membrana celular. Aqui, alterações na Rb ou na barreira paracelular indicam alterações nas JTs e AJs, cruciais na manutenção da integridade da barreira endotelial. Para interpretar de forma confiável o Rb, quatro suposições principais são feitas, conforme desenvolvido por Giaever e Keese42 e discutido criticamente por Stolwijk et al.43. Embora essas suposições sejam importantes para garantir a validade da modelagem ECIS, elas são prontamente atendidas por uma monocamada endotelial confluente.

Como o ECIS, o cellZscope permite a medição de mudanças na resistência da barreira endotelial; no entanto, as células são cultivadas em uma inserção de membrana porosa. Neste sistema, o circuito elétrico está entre dois eletrodos de cada lado de uma inserção de membrana. A monocamada endotelial é cultivada no topo dessa inserção de membrana, permitindo a medição da resistência elétrica transendotelial (TER) (Figura 1B-poço; vista lateral). Assim como no ECIS, nesse sistema, a impedância total pode ser atribuída a vários componentes de barreira, dependendo da frequência da corrente aplicada44. Em baixas frequências, a capacitância do eletrodo (CEl) domina a impedância total do sistema. Alternativamente, em altas frequências, a resistência do meio (meio R) domina a impedância total. Portanto, as medições mais úteis estão dentro da faixa de frequência média (102-10 4 Hz), que fornece informações sobre dois componentes-chave da barreira endotelial (Figura 1B-diagrama de circuito). Primeiro, a 103-10 4 Hz, a capacitância da camada celular (CCl) domina a impedância geral, pois a resistência da membrana (membrana R) é alta o suficiente para ser negligenciada e a corrente flui predominantemente através do capacitor. Portanto, o CCl indica mudanças na resistência através da membrana celular. Alternativamente, o TER transmite predominantemente a impedância geral a 102-10 3 Hz, onde o fluxo de corrente é canalizado através de espaços juncionais entre células vizinhas, mantidas juntas por proteínas juncionais. Portanto, isso fornece informações sobre o componente paracelular da barreira endotelial, como visto anteriormente com Rb na ECIS.

A Figura 1C detalha como regiões específicas do endotélio cerebral são interrompidas pelo tratamento com células de melanoma. Essa interrupção é detectada pelos biossensores por uma mudança no fluxo de corrente através do espaço paracelular (medido como Rb ou TER); o espaço basolateral (medido como Alfa); e a membrana celular (medida como Cm ou CCl). Usamos os dois biossensores detalhados nesta introdução para medir a mudança da barreira endotelial cerebral após o tratamento com vários estímulos, como citocinas ou células invasivas de melanoma. A resistência medida diminui se um determinado estímulo romper a barreira endotelial, criando um caminho de menor resistência para permitir o fluxo de corrente. Portanto, uma diminuição na "resistência da barreira" sugere perda da integridade da barreira ou ruptura da barreira endotelial cerebral. Nesses ensaios, estudamos essa ruptura interpretando a resistência e os parâmetros modelados em tempo real. A aplicação do ECIS e do cellZscope na abordagem de tais questões de pesquisa é detalhada em outro lugar 39,41,45,46.

A pesquisa in vitro permite a descoberta de mecanismos cruciais da doença, revelando moléculas e vias funcionais, que progridem a doença. No entanto, isso requer replicação confiável da doença in vitro, que difere substancialmente de um corpo funcional. Em um cenário ideal, a pesquisa in vitro deve ser reprodutível, não invasiva, livre de marcadores, quantitativa e imitar as influências estruturais encontradas in vivo. Neste artigo, detalhamos a metodologia para usar essas duas tecnologias concorrentes para medir as mudanças induzidas pelo tratamento na integridade da barreira endotelial cerebral. Discutimos as vantagens de combinar seus resultados para fornecer uma imagem mais abrangente da ruptura de barreiras e compartilhar limitações que ainda precisam ser superadas.

Protocolo

1. Usando ECIS para monitorar mudanças na integridade da barreira endotelial cerebral em resposta a vários tratamentos

  1. Configurando o software, a estação de matriz e a máquina
    1. Conecte a estação de matriz de 96 poços à máquina. Coloque a estação de matriz em um saco plástico e coloque-a na incubadora pelo menos 1 h antes do ensaio para permitir que ela aqueça. Remova o saco plástico imediatamente antes do experimento.
    2. Quando estiver pronto, ligue a máquina e abra o software correspondente no computador. Pressione o botão Configuração na guia Coletar dados . O software concluirá uma verificação de conexão, que detectará o tipo de adaptador conectado (por exemplo, estação de matriz de 96 poços) e exibirá poços vermelhos no mapa de placas representado. Isso afirma que o software detecta o adaptador, mas não consegue detectar uma placa conectada. O sistema agora está pronto para a placa de 96 poços.
  2. Preparando a placa do biossensor de 96 poços
    NOTA: O arranjo de placa de 96 poços é usado. A base de cada poço é padronizada com dedos interdigitantes de eletrodos banhados a ouro. As placas vêm em embalagens estéreis que só devem ser abertas em um capuz estéril/cabine de segurança biológica. Os eletrodos de ouro devem primeiro ser estabilizados quimicamente adicionando cisteína de 10 mM para manter a capacitância do eletrodo.
    1. Prepare a cisteína 10 mM em uma calha estéril e, usando um multicanal, pipete cuidadosamente 100 μL em cada poço. Incube a cisteína por 15 min em temperatura ambiente e, em seguida, aspire cuidadosamente, pipetando apenas nas bordas do poço, para evitar arranhar o eletrodo. Lave a cisteína pelo menos 2x com água deionizada estéril (não PBS) usando a mesma técnica de pipetagem.
      NOTA: Os eletrodos da placa também podem ser estabilizados eletricamente usando meios quentes no aparelho ECIS, em vez de usar revestimento de cisteína, conforme detalhado no protocolo do fabricante.
    2. Prepare o substrato ECM para atuar como uma membrana basal no fundo do poço.
      NOTA: Substratos de ECM como colágeno ou laminina podem ser escolhidos dependendo da necessidade da linha de células endoteliais cerebrais. Aqui usamos colágeno para uma linha de células endoteliais microvasculares cerebrais humanas (hCMVEC).
    3. Prepare 1 μg/cm2 de colágeno de cauda de rato I dissolvido em ácido acético 0,02 M em uma calha fresca e estéril (100 μL por alvéolo). Deixe o colágeno por 1 h com pouca luz no capuz estéril e, em seguida, lave 2x cuidadosamente com água deionizada e pipetagem cuidadosa.
      NOTA: Certifique-se de que o máximo de água deionizada seja removido com o máximo de cuidado possível após a última lavagem e deixe a placa secar no exaustor. Recomenda-se usar a placa logo após o revestimento; no entanto, pode ser armazenado em água a 4 °C temporariamente (menos de uma semana). A placa agora está pronta para uso.
  3. Preparando as células endoteliais cerebrais para semear na placa do biossensor de 96 poços
    NOTA: Recomenda-se primeiro otimizar a fase de crescimento e a densidade de semeadura da linhagem de células endoteliais a ser utilizada. A linha hCMVEC foi usada neste protocolo, que leva 48 h para atingir a confluência após a semeadura a 20.000 células por poço em uma placa de 96 poços.
    1. Colha as células endoteliais cerebrais em um capuz estéril usando um reagente de dissociação suave e conduza uma contagem precisa de células. Use 20.000 hCMVECs em 100 μL de meio por poço para uma fase de crescimento constante por 48 h. Prepare o excesso de células endoteliais cerebrais para garantir a pipetagem ideal de todos os 96 poços.
      NOTA: Portanto, para uma placa de 96 poços, são necessárias aproximadamente 2.000.000 de células em 10 mL de meio pré-aquecido.
    2. Transfira as células endoteliais cerebrais para uma calha estéril fresca e, usando uma pipeta multicanal, adicione cuidadosamente 100 μL (20.000 células) da suspensão celular por poço. Ressuspenda as células suavemente na calha regularmente para evitar que as células endoteliais se assentem com o tempo. Certifique-se de que 1 poço tenha apenas meio e nenhuma célula para permitir a modelagem matemática (poço livre de células) e que toda a placa seja semeada em 30 s.
  4. Iniciando o experimento
    1. Prenda cuidadosamente a placa ao adaptador na incubadora movendo os clipes vermelhos em ambos os lados do adaptador de placa para fora. Alinhe o poço A1 da placa com a região A1 do adaptador. Segure suavemente a placa no lugar com uma mão na parte superior e clique os clipes vermelhos de volta no lugar com a outra mão.
      NOTA: Certifique-se de que a placa esteja estável no adaptador.
    2. Feche a incubadora e pressione Configuração novamente. Procure poços verdes no mapa de placas indicando poços detectados corretamente. Todos os poços vermelhos têm um erro de conexão. Para corrigir isso, recoloque a placa rapidamente,
      NOTA: O tempo excessivo gasto tentando consertar poços com conexões ruins pode comprometer a saúde da célula.
    3. Pressione Verificar para verificar novamente os anexos como leituras de impedância absoluta. Isso levará vários minutos.
    4. Pressione a seta sob o mapa de chapas para garantir que o catálogo de chapas correto esteja selecionado. Nesse caso, é 96w20idf.
    5. Pressione o botão multifrequência para garantir que a impedância seja medida em várias frequências CA para permitir modelagem matemática futura.
    6. Pressione Iniciar para iniciar o experimento. Permita que as células proliferem por ~ 48 h e formem sua monocamada típica de alta resistência, medida por um aumento em ohms.
  5. Tratamento das células endoteliais cerebrais com células cancerígenas ou citocinas na placa de 96 poços
    NOTA: Como a placa de 96 poços permite o teste simultâneo de vários estímulos, prepare um mapa de placa claro com as opções de tratamento desejadas (Figura Suplementar S1-inferior). Cada tratamento pode e deve ser realizado pelo menos em triplicata (três poços replicados) para permitir análises estatísticas; no entanto, quatro réplicas são mostradas em Figura Suplementar S1.
    1. Às 48 h, verifique o crescimento das células endoteliais cerebrais. Certifique-se de que um platô seja atingido antes de preparar as soluções de tratamento.
      NOTA: Diferentes linhagens de células endoteliais podem levar diferentes períodos de tempo para atingir um platô. Portanto, sua fase de crescimento e densidade de semeadura devem ser otimizadas antes da realização deste experimento. Os poços normalmente devem se estabilizar na mesma hora. Caso contrário, eles podem ser comprometidos ou pipetados de forma imprecisa e não devem ser incluídos.
    2. Para o tratamento com citocinas, prepare concentrações apropriadas das citocinas em meios completos pré-aquecidos, juntamente com seus controles relevantes de veículos e meios.
      1. Prepare as citocinas em 2x a concentração final desejada, pois elas serão diluídas 1:1 quando adicionadas a cada poço contendo células endoteliais cerebrais.
      2. Para permitir que cada tratamento seja conduzido em triplicata, prepare todas as citocinas em mais de 300 μL de volume total (ou seja, pelo menos 350 μL no total), para adição de tratamento de 100 μL por poço.
    3. Para tratamento com células, colha as células (três diferentes linhagens celulares de melanoma derivadas de pacientes usadas neste protocolo) com um reagente de dissociação suave e conduza uma contagem precisa de células. Realize tratamentos baseados em células nas principais proporções efetor:alvo (razões E:T) de 1:1, onde as células de tratamento são as células efetoras (por exemplo, células de melanoma) e as células endoteliais cerebrais são as células-alvo, ou seja, adicione 20.000 células de melanoma a 20.000 células endoteliais cerebrais por poço.
      1. Diluir em série para proporções E:T menores de 1:10 ou 1:100, quando necessário. Para permitir o tratamento em poços triplicados, conte as células e prepare-as em mais de 300 μL de volume total (ou seja, pelo menos 350 μL no total) para adição de tratamento de 100 μL por poço.
    4. Rotule os tubos de polipropileno de 1,1 mL, que vêm em formato de tira de 8 tubos (ou seja, tubos de tira de 1 mL), de acordo com o mapa de placas de 96 poços (Figura Suplementar S1-Top). Insira os tubos de tira nas placas do tubo de tira e autoclave-os antes do experimento. Adicione o volume total de citocinas ou células de tratamento (ou seja, 350 μL completos de tratamento) aos tubos de tiras estéreis e deixe-os na incubadora para se manterem aquecidos.
    5. No software, pressione Pausar para pausar o experimento. Isso pode levar alguns segundos para ser concluído. Uma vez pausado, abra a incubadora e solte cuidadosamente os dois clipes vermelhos com uma mão enquanto estabiliza a placa com a outra. Mantenha o experimento pausado e leve a placa para o exaustor estéril.
    6. Remova os tubos das tiras de tratamento da incubadora. Usando uma pipeta multicanal, ressuspenda cuidadosamente o conteúdo dos tubos de tiras de tratamento e, em seguida, adicione 100 μL de tratamento dos tubos de tiras aos poços corretos na placa de 96 poços sem tocar no fundo do poço. Adicione cuidadosamente o tratamento a todos os poços e meios apenas ao poço livre de células e conclua esta etapa em menos de 5 minutos para uma placa completa de 96 poços, pois o resfriamento excessivo afetará a resistência da monocamada endotelial.
    7. Retorne a placa tratada para a máquina, conecte-a como feito anteriormente e, em seguida, verifique as conexões do eletrodo com o adaptador novamente pressionando Setup | Verificar.
    8. Certifique-se de que o catálogo de placas e as configurações de aquisição de multifrequência corretos estejam selecionados e pressione Retomar para retomar o experimento. Permita que o experimento progrida e execute-o até o ponto de extremidade desejado.
    9. Pressione Concluir para concluir o experimento, que salva automaticamente o arquivo abp. gravado. Navegue até Arquivo | Exportar dados para recuperar esse arquivo como um xls. ou csv. arquivo para análises posteriores.

2. Usando cellZscope para monitorar mudanças na integridade da barreira endotelial cerebral em resposta a vários tratamentos

  1. Preparando os componentes metálicos do aparelho, adaptador e inserção de membrana porosa
    1. Limpe os componentes metálicos sequencialmente com água deionizada, depois etanol 70% e depois água deionizada novamente.
    2. Autoclave o eletrodo inferior ou "potes" e os eletrodos de imersão superior e esterilize todos os outros componentes do Módulo de Célula com etanol a 70%.
    3. Em um exaustor estéril, instale todos os 24 eletrodos/"potes" inferiores aparafusando-os no Módulo de Célula, tomando cuidado para manter a esterilidade por toda parte.
    4. Adicione 900 μL de meio base aos poços.
      NOTA: A mídia de base é adicionada ao poço inferior, que atua como o compartimento basal do endotélio. Recomenda-se não usar soro neste compartimento para replicar de forma mais confiável o ambiente basal do endotélio cerebral.
    5. Conecte os eletrodos de imersão magneticamente à tampa do módulo de célula e feche a tampa sobre os poços para que os eletrodos de imersão se encaixem nos potes de eletrodos inferiores.
    6. Conecte o Módulo Celular ao adaptador em uma incubadora e deixe-o por pelo menos 1 h para equilibrar. Nesta fase, abra o software para carregar o mapa da placa experimental na guia Layout , incorporando assim o mapa da placa de tratamento nos arquivos, que conterão os dados.
    7. Quando o revestimento for necessário, cubra as inserções da membrana em uma capa estéril usando uma placa de cultura estéril de 24 poços para segurar as inserções e adicionando o substrato ECM (por exemplo, colágeno) à seção interna do poço, conforme detalhado na seção 1.2.3 Use uma pipeta de canal único para carregar o substrato ECM em cada poço com cuidado.
  2. Preparando as células endoteliais do cérebro para semear na inserção da membrana e iniciar o experimento
    1. Colha e conte as células endoteliais cerebrais de acordo com a seção 1.3, mas prepare a titulação celular final necessária em um tubo de centrífuga de 50 mL. Certifique-se de que as células colhidas estejam em meios completos quentes, incluindo todos os fatores de crescimento e soro necessários.
    2. Usando uma pipeta de canal único, semeie cuidadosamente as células endoteliais cerebrais (80.000 neste protocolo) na câmara apical de um poço inserido em 350 μL de meio completo.
    3. Inclua um poço sem células pipetando meios completos apenas em um dos insertos.
    4. Remova o Módulo de Célula da incubadora e coloque-o na coifa estéril. Transfira as inserções preparadas para os potes de eletrodo inferiores usando uma pinça para manusear apenas os suportes superiores da inserção. Evite a formação de bolhas sob a membrana.
    5. Coloque o módulo de célula de volta na incubadora sobre o adaptador.
    6. No software, na guia experimento , na seção Espectro , selecione Iniciar em 1 Hz e Parar em 100 kHz para adquirir dados em toda a faixa de frequência; Selecione Etapas finas .
    7. Em Tempo de espera, selecione 15 min para permitir medições contínuas na taxa mais rápida conduzida pelo software.
    8. Pressione Iniciar para iniciar o experimento e permitir que as células endoteliais cerebrais proliferem e formem uma monocamada com alta resistência. Esta etapa leva aproximadamente 48 h.
  3. Tratamento das células endoteliais cerebrais com células cancerígenas e citocinas nas inserções de membrana
    1. Em 48 h, prepare as citocinas ou células de tratamento (por exemplo,., células de melanoma) de acordo com a seção 1.5, incluindo a realização de contagens de células, quando aplicável, e colete em tubos de tira de 1 mL ou equivalente.
    2. Prepare o tratamento em concentrações corretas para adicionar 70 μL a cada poço (inserção). Coloque os tratamentos na incubadora para se aquecer.
    3. Como o instrumento aqui realiza medições a cada 15 minutos, escolha um tempo de tratamento que comece imediatamente após a conclusão de uma medição. Neste momento, remova o Módulo de Célula da incubadora e limpe-o suavemente com etanol 70% usando lenços sem fiapos.
    4. Em uma coifa estéril, abra o Módulo Celular e pipete cuidadosamente 70 μL do tratamento na câmara apical do respectivo inserto. Faça isso usando uma pipeta de canal único e adicione em movimentos circulares, evitando bolhas. Conclua esta etapa em menos de 10 minutos para retornar o módulo de célula ao adaptador antes do início da próxima medição.
    5. Pressione Parar para encerrar o experimento. Exporte os dados diretamente para um xls. arquivo na barra lateral Arquivo | Nomeie e salve este arquivo apropriadamente após abri-lo.

Resultados

Interpretando dados de impedância ECIS

Entendendo as condições experimentais ideais
Aqui, os dados podem ser visualizados diretamente usando o software (Figura 2A) ou exportados para análise e plotagem gráfica (Figura 2B). A Figura 2A mostra um exemplo de dados exibidos na interface de software real. O gráfico à esquerda mostra um exemplo de uma conexão ...

Discussão

Estudos terapêuticos sobre doenças que acometem a BHE devem considerar a importância da integridade e regulação da barreira endotelial cerebral. Por exemplo, a ruptura da barreira endotelial cerebral é criticamente investigada na metástase do câncer para o cérebro a partir de outros locais anatômicos. Isso ocorre porque o endotélio cerebral forma a primeira barreira contra as células tumorais circulantes. Como mencionado anteriormente na introdução, os estudos in vitro sobre a integridade da barrei...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Akshata Anchan foi financiado pela Fundação Neurológica da Nova Zelândia para a Gillespie Scholarship (referência da concessão: 1628-GS) e First Fellowship (referência da concessão: 2021 FFE). O custo da pesquisa também foi parcialmente financiado pela Neurological Foundation Fellowship-2021 FFE e pelo Fundo de Desenvolvimento de Pesquisa do Corpo Docente da Universidade de Auckland. James Hucklesby foi financiado por uma bolsa de estudos da Auckland Medical Research Foundation. Obrigado à equipe de Baguley e ao Centro de Pesquisa da Sociedade do Câncer de Auckland pelas linhas celulares NZM de melanoma da Nova Zelândia derivadas de pacientes.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
aMEMGibco12561072Melanoma cell base media
cellZscope arraynanoAnalyticscellZscope2; software v4.3.1TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tailGibcoA1048301ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMPSigma-AldrichD0627Brain endothelial media supplement
ECIS array Applied BiophysicsECIS ZΘ; software v1.2.163.0Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate Applied Biophysics96W20idf 96-well biosensor plate
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Brain endothelial media supplement
hCMVECApplied Biological MaterialsT0259Brain endothelial cell line
hEGFPeproTechPTAF10015100Brain endothelial media supplement
HeparinSigma-AldrichH-3393Brain endothelial media supplement
hFGFPeproTechPTAF10018B50Brain endothelial media supplement
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Brain endothelial media supplement
IL-1βPeproTech200-01BCytokine
Insulin-Transferrin-Sodium SeleniteSigma-Aldrich11074547001Melanoma cell media supplement
M199Gibco11150-067Brain endothelial cell base media
MilliQ waterDeionized water
PBS 1xGibco10010-023
TNFαPeproTech300-01ACytokine
Transwell insertCorningCLS3464Porous membrane insert
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Dissociation reagent

Referências

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