Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מדגימים את הטכניקה של שימוש בחיישנים ביולוגיים מבוססי עכבה: ECIS ו- cellZscope, למדידת חוזק מחסום אנדותל במוח. אנו מפרטים את ההכנה והטכניקה של הוספת גירויים שונים למודל in vitro של אנדותל המוח. אנו מודדים, רושמים ונותנים ניתוח מייצג של הממצאים.

Abstract

מחסום הדם-מוח (BBB) מגן על פרנכימה במוח מפני פתוגנים מזיקים בדם. BBB מורכב מהיחידה הנוירו-וסקולרית, הכוללת פריציטים, תהליכים אסטרוציטיים ברגל ותאי אנדותל צמודים. כאן, תאי האנדותל במוח מהווים את קו המחסום הראשון מפני פתוגנים הנישאים בדם. במצבים כמו סרטן ודלקת עצבית, גורמים במחזור הדם יכולים לשבש את המחסום הזה. התקדמות המחלה מחמירה באופן משמעותי לאחר הפרעה במחסום, המאפשרת גישה או פגיעה באזורים במוח. זה מחמיר באופן משמעותי את הפרוגנוזות, במיוחד בשל אפשרויות טיפול מוגבלות הזמינות ברמת המוח. לפיכך, מחקרים חדשים שואפים לחקור טיפולים פוטנציאליים שיכולים למנוע מגורמים מזיקים אלה בדם אינטראקציה עם תאי האנדותל במוח.

מכשירי ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) ומכשירי CellZscope הזמינים מסחרית מודדים את העכבה על פני חד-שכבות תאיות כגון אנדותל BBB, כדי לקבוע את חוזק המחסום שלהן. כאן אנו מפרטים את השימוש בשני הביו-חיישנים בהערכת שלמות מחסום האנדותל במוח עם הוספת גירויים שונים. באופן מכריע, אנו מדגישים את החשיבות של יכולת התפוקה הגבוהה שלהם לחקירה בו זמנית של משתנים מרובים וטיפולים ביולוגיים.

Introduction

מאמר זה דן במגמות הנוכחיות בהערכת תאים מיקרו-וסקולריים. אנו מפרטים באופן ספציפי את השימוש בשתי פלטפורמות זמינות מסחרית למדידת תכונות המחסום של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מוחיים. תאי אנדותל הם תאים הפונים לדם, המרפדים את דופן כלי הדם. עם זאת, כלי דם מוחיים הם ייחודיים מכיוון שהם עוזרים ליצור את מחסום הדם-מוח המגן (BBB)1,2,3. ה-BBB פועל לווסת את העברת המולקולות מהדם למוח. מחלות היקפיות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית (CNS) קשורות בדרך כלל לכשל תפקודי של BBB 4,5. המבנים האנטומיים היוצרים את BBB אינם נוכחים בממשק רקמת הדם במקומות אחרים בגוף6. מבנים אנטומיים אלה כוללים פריציטים, הממוקמים קרוב לתאי אנדותל במוח, ומווסתים את התפשטותם וחדירותם; תהליכים אסטרוציטיים ברגל, המעורבים בדשדוש תזונתי ותמיכה אנטומית 7,8; מיקרוגליה, שהם המקרופאגים השוכנים במוח, המעורבים לעתים קרובות בדלקת עצבית ובאיסכמיה 9,10,11,12, ובאנדותל המוח, היוצר שכבה אחת של תאים דבוקים היטב ללא fenestrations 13,14. אנדותל המוח ידוע בדרך כלל בשם "מחסום אנדותל המוח" ויוצר מחסום מבני ותפקודי בחמש דרכים שונות. ראשית, מרכיב המחסום הפארא-תאי נוצר על ידי הידבקות בצמתים רוחביים של תאי התא. שנית, מרכיב המחסום הטרנסתאי נשמר על ידי ויסות אנדוציטוזה. שלישית, קרום מרתף מיוחד מעגן ותומך באנדותל באמצעות מטריצה חוץ-תאית עשירה המורכבת בעיקר מקולגן15,16. שני המנגנונים האחרונים הם באמצעות אנזימים וטרנספורטרים המסייעים לווסת את חילוף החומרים של תרופות ואת ספיגת מולקולות גדולות, בהתאמה17.

האינטראקציות הפארא-תאיות מהוות את המרכיב העיקרי של מחסום האנדותל במוח, המתאפשר על ידי צמתים הדוקים (TJs), הכוללים חלבוני ממברנה קלאודינים, אוקלודין ומולקולות היצמדות צמתיות (JAMs)18. קשירה הומוטיפית חזקה של חלבוני הממברנה יוצרת את המחסום המבני הראשון, אם כי JAMs מקושרים גם לחלבוני עזר zonula occludens, ובכך מקשרים את TJs לשלד האקטין19,20. קישורי האקטין ממקמים את ה-TJs באזור האפי של האנדותל21, אשר מקטב באופן פונקציונלי את תאי האנדותל כדי ליצור את המחסום המבני בצד אפיקלי או "פונה לדם" זה. באזור הבזולטרלי של האנדותל, צמתים נצמדים מיוחדים מאוד (AJs) ממלאים תפקיד רגולטורי בשמירה על המורפולוגיה של התא. AJs מורכבים מקדהרינים תלויי סידן, המקשרים את השלד הציטו-שלד של תאי אנדותל שכנים דרך קומפלקס משפחת הקטנין20,22. קדהרין אנדותל כלי דם (VE-Cadherin) הוא קאדרין כזה, המווסת את הביטוי של חלבוני TJ ואת תפקוד מחסום האנדותל הכולל כדי לשמור על שלמות חד-שכבתית של האנדותל 23,24,25,26,27. אפנון דלקתי, כגון גורם נמק גידולי-אלפא (TNFα), מאותת על הפנמת VE-cadherin הרחק מצמתי התא, מה שמוביל לערעור היציבות של מחסום האנדותל 28,29,30. מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות (PECAM)31 היא קאדרין AJ נוסף המייצב ומעצב מחדש צמתי אנדותל32,33. צפיפותם של חלבונים צמתים אלה מגבילה את זרימת האלקטרונים דרך החלל הפארא-תאי שבין תאי אנדותל. תכונה זו משמשת למדידת חוזק מחסום האנדותל או התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל (TER) על פני חד-שכבות תאים קונפלואנטיות כמו אנדותל המוח.

מחקרים טיפוליים מתמקדים באנדותל המוח בשל תפקידו החיוני בממשק דם-מוח. מספר מחלות משפיעות לרעה על אנדותל המוח, כולל מצבים נוירו-דלקתיים כמו טרשת נפוצה, שבץ, מחלות נוירודגנרטיביות וסרטן 34,35,36,37. ברגע שמחסום האנדותל במוח משתבש, התקדמות המחלה מחמירה באופן משמעותי מכיוון שהמוח נחשף ביעילות לגירויים המזיקים בדם38. הראינו בעבר כי מתווכי דלקת ותאי מלנומה גרורתית משבשים את מחסום האנדותל במוח באמצעות שתי טכנולוגיות המודדות את חוזק מחסום האנדותל 39,40,41.

ECIS (ראשי תיבות של Electric Cell-Substrate Impedance Sening) הוא חיישן ביולוגי מבוסס עכבה המאפשר הערכה בזמן אמת וללא תוויות של שלמות מחסום תאי האנדותל. כאן, בארות הבדיקה מרופדות באלקטרודות מצופות זהב, אשר מכניס זרם חילופין (AC) למערכת הבדיקה. תאי אנדותל במוח נזרעים לתוך הבארות האלה, מה שאומר שניתן ליישם AC דרך התאים. (איור 1A-באר; מבט מהצד). זה יוצר את המעגל החשמלי, המשמש לחישוב העכבה (תרשים מעגל איור 1A). העכבה גדלה כאשר תאי האנדותל במוח נצמדים לצלחת ומתחילים ליצור את הצמתים הפארא-תאיים שלהם. העכבה מתיישבת כאשר תאי האנדותל מתמזגים, יוצרים חד-שכבה ומגבילים את זרימת הזרם. יישום AC בתדרים שונים משפיע על מסלול זרימת הזרם דרך תאי האנדותל. זרם זורם דרך גוף תא האנדותל כאשר הוא מופעל בתדר גבוה יותר (>104 הרץ). זה מספק מידע על הקיבול של monolayer התא, המשמש להערכת התקשרות התא והתפשטות. בתדרים נמוכים (10,2-10,4 הרץ) עכבת הממברנה גבוהה, ומגבילה את זרימת הזרם דרך התאים. במקרה זה, רוב הזרם מנווט בין התאים. בסביבות 4,000 הרץ, ההתנגדות לזרימת זרם מיוחסת בעיקר לצמתים של תאי אנדותל, דרך החלל הבין-תאי . לכן, כל שינוי בהתנגדות בתדירות זו מספק מידע לגבי שלמות מחסום האנדותל.

בעוד שמדידות עכבה גולמיות יכולות לספק תובנה לגבי תכונות המחסום, תוכנת ECIS יכולה למדל באופן מתמטי את ההתנגדות הכוללת הנמדדת על פני תדרי AC מרובים וליתר דיוק, להפריד אותה לשני פרמטרים מרכזיים של שלמות המחסום. פרמטרים אלה הם ההתנגדות הפארא-תאית בין הממברנות הצידיות של תאים שכנים (התנגדות בטא-Rb; מחסום פארא-תאי; איור 1A-חיצים ירוקים), וההתנגדות הבזולטרלית בין שכבת תאי הבסיס לבין האלקטרודה (התנגדות אלפא-אלפא; מחסום בזולטרלי; איור 1A-חיצים כחולים). פרמטר מודל שלישי נמדד גם כקיבוליות קרום התא (Cm; איור 1A-חיצים אדומים). Cm מציג את הזרימה הקיבולית של הזרם דרך התאים, המציין את הרכב קרום התא. לפיכך, שינויים במחסום Rb או במחסום הפארא-תאי מצביעים על שינויים ב-TJs וב-AJs, החיוניים לשמירה על שלמות מחסום האנדותל. כדי לפרש באופן אמין את ה-Rb, ארבע הנחות מפתח מועלות, כפי שפותחו על ידי Giaever ו-Keese42 ונדונו באופן ביקורתי על ידי Stolwijk et al.43. למרות שהנחות אלה חשובות להבטחת תוקפו של מודל ECIS, הן נפגשות בקלות על ידי חד-שכבה אנדותל קונפלואנטית.

בדומה ל-ECIS, ה-cellZscope מאפשר למדוד שינויים בעמידות מחסום האנדותל; עם זאת, התאים מתורבתים על קרום נקבובי. במערכת זו, המעגל החשמלי נמצא בין שתי אלקטרודות משני צדי החדרת הממברנה. חד-שכבות האנדותל מתורבתות על גבי ממברנה זו, מה שמאפשר מדידה של התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל (TER) (איור 1B-well; מבט מהצד). כמו עם ECIS, במערכת זו, ניתן לייחס את העכבה הכוללת למספר רכיבי מחסום, תלוי בתדירות הזרם המופעל44. בתדרים נמוכים, קיבול האלקטרודות (CEl) שולט בעכבה הכוללת של המערכת. לחלופין, בתדרים גבוהים, התנגדות המדיה (מדיום R) שולטת בעכבה הכוללת. לפיכך, המדידות השימושיות ביותר נמצאות בטווח התדרים הבינוניים (102-10 4 הרץ), אשר מספק מידע לגבי שני מרכיבים עיקריים של מחסום האנדותל (תרשים מעגל איור 1B). ראשית, ב- 103-10 4 הרץ, קיבול שכבת התא (CCl) שולט בעכבה הכוללת מכיוון שהתנגדות הממברנה (קרום R) גבוהה מספיק כדי להיות מוזנחת, והזרם זורם בעיקר על פני הקבל. לפיכך, CCl מציין שינויים בהתנגדות דרך קרום התא. לחלופין, TER מקנה בעיקר את העכבה הכוללת ב 102-10 3 הרץ, כאשר זרימת הזרם מנותבת דרך רווחי צומת בין תאים שכנים, המוחזקים יחד על ידי חלבונים צומתיים. לפיכך, זה מספק מידע על המרכיב הפארא-תאי של מחסום האנדותל, כפי שנראה בעבר עם Rb על ECIS.

איור 1C מפרט כיצד אזורים מסוימים באנדותל המוח מופרעים על-ידי טיפול בתאי מלנומה. הפרעה זו מזוהה על ידי החיישנים הביולוגיים על ידי שינוי בזרימת הזרם דרך החלל הפארא-תאי (נמדד כ-Rb או TER); המרחב הבזולטרלי (נמדד כאלפא); וקרום התא (נמדד כ-Cm או CCl). השתמשנו בשני הביו-חיישנים המפורטים במבוא זה כדי למדוד את השינוי במחסום האנדותל במוח בעקבות טיפול בגירויים שונים כגון ציטוקינים או תאי מלנומה פולשניים. ההתנגדות הנמדדת פוחתת אם גירוי נתון משבש את מחסום האנדותל, ויוצר נתיב בעל התנגדות נמוכה ביותר המאפשר זרימת זרם. לפיכך, ירידה ב"התנגדות המחסום" מצביעה על אובדן שלמות המחסום או הפרעה במחסום אנדותל המוח. בבדיקות אלה חקרנו את השיבוש הזה על ידי פירוש התנגדות ומודלים של פרמטרים בזמן אמת. היישום של ECIS ו- cellZscope בהתייחסות לשאלות מחקר כאלה מפורט במקום אחר 39,41,45,46.

מחקר במבחנה מאפשר גילוי מנגנוני מחלה חיוניים על ידי חשיפת מולקולות ומסלולים תפקודיים, המקדמים את המחלה. עם זאת, זה דורש שכפול אמין של המחלה במבחנה, אשר שונה באופן משמעותי מגוף מתפקד. בתרחיש אידיאלי, מחקר במבחנה צריך להיות ניתן לשחזור, לא פולשני, ללא תוויות, כמותי ומחקה השפעות מבניות שנמצאו in vivo. במאמר זה נפרט את המתודולוגיה לשימוש בשתי הטכנולוגיות המתמודדות הללו כדי למדוד שינויים הנגרמים על ידי הטיפול בשלמות מחסום האנדותל במוח. אנו דנים ביתרונות של שילוב התוצאות שלהם כדי לספק תמונה מקיפה יותר של שיבוש חסמים ולשתף במגבלות שעדיין יש להתגבר עליהן.

Protocol

1. שימוש ב-ECIS לניטור שינויים בשלמות מחסום האנדותל במוח בתגובה לטיפולים שונים

  1. הגדרת התוכנה, תחנת המערך והמכונה
    1. חבר את תחנת מערך 96 הקידוחים למכשיר. הניחו את עמדת המערך בשקית ניילון והניחו אותה באינקובטור לפחות שעה לפני הבדיקה כדי לאפשר לה להתחמם. הסירו את שקית הניילון מיד לפני הניסוי.
    2. לאחר שמוכן, הפעל את המכונה ופתח את התוכנה המתאימה במחשב. לחץ על לחצן הגדרה תחת הכרטיסיה אסוף נתונים . התוכנה תשלים בדיקת חיבור, אשר תזהה את סוג המתאם המחובר (למשל, תחנת מערך 96 בארות) ותציג בארות אדומות במפת הלוחות המתוארת. פעולה זו קובעת שהתוכנה מזהה את המתאם, אך אינה יכולה לחוש לוחית מחוברת. המערכת מוכנה כעת לצלחת 96 בארות.
  2. הכנת צלחת biosensor 96-well
    הערה: נעשה שימוש בסידור לוחות 96 בארות. הבסיס של כל באר מעוטר באצבעות משולבות של אלקטרודות מצופות זהב. הצלחות מגיעות באריזות סטריליות שיש לפתוח רק במכסה מנוע סטרילי/ארון בטיחות ביולוגי. אלקטרודות הזהב חייבות תחילה להיות מיוצבות כימית על ידי הוספת ציסטאין 10 mM כדי לשמור על קיבול האלקטרודה.
    1. מכינים את 10 mM ציסטאין בשוקת סטרילית באמצעות רב ערוצי, בזהירות פיפטה 100 μL לתוך כל באר. לדגור על ציסטאין במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן בזהירות לשאוף, pipeting בשולי הבאר בלבד, כדי למנוע שריטות האלקטרודה. שטפו את הציסטאין לפחות פי 2 עם מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (לא PBS) באותה טכניקת צנרת.
      הערה: ניתן לייצב את אלקטרודות הצלחת גם באופן חשמלי באמצעות מדיה חמה על מכשיר ECIS, במקום להשתמש בציפוי ציסטאין, כמפורט בפרוטוקול היצרן.
    2. הכינו את מצע ECM כך שישמש כקרום מרתף בתחתית הבאר.
      הערה: ניתן לבחור מצעי ECM כמו קולגן, או למינין בהתאם לדרישה של קו תאי האנדותל במוח. כאן אנו משתמשים בקולגן עבור קו תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח אנושי (hCMVEC).
    3. הכינו 1 מק"ג/ס"מ2 קולגן זנב-חולדה שהמסתי בחומצה אצטית 0.02 מ' בשוקת טרייה וסטרילית (100 מיקרוליטר לבאר). השאירו את הקולגן למשך שעה באור חלש במכסה המנוע הסטרילי, ולאחר מכן שטפו 2x בזהירות עם מים נטולי יונים, ופיפטינג זהיר.
      הערה: ודאו שכמה שיותר מהמים שעברו דה-יוניזציה מוסרים בזהירות האפשרית לאחר השטיפה האחרונה ותנו לצלחת להתייבש במכסה המנוע. מומלץ להשתמש בצלחת מיד לאחר הציפוי; עם זאת, ניתן לאחסן אותו במים ב 4 °C (75 °F) באופן זמני (פחות משבוע). הצלחת מוכנה כעת לשימוש.
  3. הכנת תאי האנדותל במוח לזריעה על צלחת הביו-סנסור בת 96 הבארות
    הערה: מומלץ למטב תחילה את שלב הגידול ואת צפיפות הזריעה של קו תאי האנדותל לשימוש. קו hCMVEC שימש בפרוטוקול זה, אשר לוקח 48 שעות להגיע למפגש לאחר זריעה של 20,000 תאים לבאר בצלחת של 96 בארות.
    1. קצרו את תאי האנדותל במוח במכסה מנוע סטרילי באמצעות מגיב דיסוציאציה עדין ובצעו ספירת תאים מדויקת. השתמש 20,000 hCMVECs ב 100 μL של מדיה לכל באר לשלב צמיחה יציב במשך 48 שעות. הכינו עודפי תאי אנדותל במוח כדי להבטיח ציפה אופטימלית של כל 96 הבארות.
      הערה: לפיכך, עבור צלחת 96 בארות, כ -2,000,000 תאים ב -10 מ"ל של מדיה מחוממת מראש נדרשים.
    2. מעבירים את תאי האנדותל במוח לשוקת סטרילית טרייה ובעזרת פיפטה רב ערוצית מוסיפים בזהירות 100 μL (20,000 תאים) של תרחיף התא לכל באר. השהה מחדש את התאים בעדינות בשוקת באופן קבוע כדי למנוע מתאי האנדותל להתיישב לאורך זמן. ודא שלבאר 1 יש מדיה בלבד וללא תאים המאפשרים מידול מתמטי (באר נטולת תאים) ושהצלחת כולה נזרעת תוך 30 שניות.
  4. התחלת הניסוי
    1. חבר בזהירות את הצלחת למתאם באינקובטור על ידי הזזת האטבים האדומים משני צדי מתאם הצלחת כלפי חוץ. ישר את באר A1 של הצלחת עם אזור A1 של המתאם. החזיקו בעדינות את הצלחת במקומה ביד אחת למעלה ולחצו על האטבים האדומים בחזרה למקומם ביד השנייה.
      הערה: ודא שהצלחת יציבה במתאם.
    2. סגור את האינקובטור ולחץ שוב על Setup . חפש בארות ירוקות במפת הלוחות המציינת בארות שזוהו כראוי. לכל בארות המציגות אדום יש שגיאת חיבור. כדי לתקן זאת, חבר מחדש את הצלחת במהירות,
      הערה: זמן מופרז המושקע בניסיון לתקן בארות עם חיבורים גרועים עלול לסכן את בריאות התא.
    3. הקש Check כדי לבדוק מחדש את הקבצים המצורפים כקריאות עכבה מוחלטת. פעולה זו תארך מספר דקות.
    4. לחץ על החץ מתחת למפת הלוחות כדי לוודא שנבחר קטלוג הלוחות הנכון. במקרה זה, זה 96w20צה"ל.
    5. לחץ על לחצן הרב-תדרים כדי להבטיח שהעכבה נמדדת בתדרי AC מרובים כדי לאפשר מידול מתמטי עתידי.
    6. לחץ על התחל כדי להתחיל את הניסוי. אפשרו לתאים להתרבות במשך ~48 שעות וליצור את השכבה החד-שכבתית האופיינית שלהם בעלת עמידות גבוהה, כפי שנמדד על ידי עלייה באוהם.
  5. טיפול בתאי אנדותל במוח עם תאים סרטניים או ציטוקינים על צלחת 96 באר
    הערה: מכיוון שצלחת 96 בארות מאפשרת בדיקה בו זמנית של גירויים מרובים, הכינו מפת צלחת ברורה עם אפשרויות הטיפול הרצויות (איור משלים S1- למטה). כל טיפול יכול וצריך להתבצע לפחות בטריפליקט (שלוש בארות משוכפלות) כדי לאפשר ניתוחים סטטיסטיים; עם זאת, ארבעה עותקים משוכפלים מוצגים ב איור משלים S1.
    1. ב 48 שעות, לבדוק את הצמיחה של תאי אנדותל המוח. יש לוודא שמגיעים לרמה לפני הכנת פתרונות טיפול.
      הערה: לקווי תאי אנדותל שונים עשויים לקחת אורכי זמן שונים כדי להגיע לרמה. לפיכך, שלב הצמיחה שלהם וצפיפות הזריעה חייבים להיות אופטימליים לפני ביצוע ניסוי זה. בארות אמורות בדרך כלל להתייצב באותה שעה. אם לא, הם עלולים להיפגע או להיפגע באופן לא מדויק ואין לכלול אותם.
    2. לטיפול בציטוקינים, הכינו ריכוזים מתאימים של הציטוקינים במדיה מלאה שחוממה מראש יחד עם אמצעי הבקרה הרלוונטיים לרכב ולאמצעי התקשורת.
      1. הכינו את הציטוקינים בריכוז הרצוי פי 2 מכיוון שהם ידוללו ביחס של 1:1 כאשר יתווספו לכל באר המכילה תאי אנדותל במוח.
      2. כדי לאפשר לכל טיפול להתבצע בטריפליקט, הכינו את כל הציטוקינים ביותר מ-300 מיקרוליטר בנפח כולל (כלומר, לפחות 350 מיקרוליטר בסך הכל), לתוספת טיפול של 100 מיקרוליטר לבאר.
    3. לטיפול בתאים, קצרו את התאים (שלושה קווי תאי מלנומה שונים שמקורם במטופל המשמשים בפרוטוקול זה) עם מגיב דיסוציאציה עדין ובצעו ספירת תאים מדויקת. בצע טיפולים מבוססי תאים ביחסי יעד (יחסי E:T) של 1:1 כאשר תאי הטיפול הם תאי ההשפעה (למשל, תאי מלנומה) ותאי האנדותל במוח הם תאי המטרה, כלומר הוסף 20,000 תאי מלנומה ל -20,000 תאי אנדותל במוח לכל באר.
      1. דילול סדרתי לקבלת יחסי E:T קטנים יותר של 1:10 או 1:100 במידת הצורך. כדי לאפשר טיפול בבארות משולשות, ספרו את התאים והכינו אותם ביותר מ-300 מיקרוליטר של נפח כולל (כלומר, לפחות 350 מיקרוליטר בסך הכל) לתוספת טיפול של 100 מיקרוליטר לבאר.
    4. תווית 1.1 מ"ל צינורות אשכול פוליפרופילן, המגיעים בפורמט רצועת 8 צינורות (כלומר, צינורות רצועה 1 מ"ל), על פי מפת לוחות 96 בארות (איור משלים S1-Top). הכנס את צינורות הרצועה ללוחות צינור הרצועה ובצע אותם אוטומטית לפני הניסוי. הוסף את הנפח הכולל של ציטוקינים או תאים לטיפול (כלומר 350 מיקרוליטר מלא של טיפול) לצינורות הרצועה הסטרילית והשאר אותם באינקובטור כדי להתחמם.
    5. בתוכנה, לחץ על Pause כדי להשהות את הניסוי. פעולה זו עשויה להימשך מספר שניות. לאחר ההשהיה, פתחו את האינקובטור ופתחו בזהירות את שני האטבים האדומים ביד אחת תוך ייצוב הצלחת ביד השנייה. השאירו את הניסוי מושהה והביאו את הצלחת למכסה המנוע הסטרילי.
    6. הסר את צינורות רצועת הטיפול מהאינקובטור. באמצעות פיפטה רב ערוצית, בזהירות להשהות מחדש את התוכן של צינורות רצועת הטיפול ולאחר מכן להוסיף 100 μL של טיפול מן צינורות הרצועה לבארות הנכון על צלחת 96 באר מבלי לגעת בתחתית הבאר. הוסף בזהירות טיפול לכל הבארות והמדיה רק לבאר נטולת התאים והשלם שלב זה תוך פחות מ -5 דקות לקבלת צלחת מלאה של 96 בארות, מכיוון שקירור מוגזם ישפיע על ההתנגדות של חד-שכבה אנדותלית.
    7. החזר את הצלחת המטופלת למכשיר, חבר אותה כפי שנעשה קודם לכן ולאחר מכן בדוק שוב את חיבורי האלקטרודות למתאם על-ידי לחיצה על Setup | יש.
    8. ודא שנבחרו ההגדרות הנכונות של קטלוג הלוחות ושל רכישת תדרים מרובים, והקש Resume כדי לחדש את הניסוי. אפשר לניסוי להתקדם והפעל אותו עד לנקודת הסיום הרצויה.
    9. הקש Finish כדי להשלים את הניסוי, פעולה שתשמור אוטומטית את קובץ abp שהוקלט. נווט אל קובץ | יצא נתונים כדי לאחזר קובץ זה כקובץ xls. או CSV. קובץ לניתוחים נוספים.

2. שימוש ב-cellZscope לניטור שינויים בשלמות מחסום האנדותל במוח בתגובה לטיפולים שונים

  1. הכנת רכיבי המתכת של המנגנון, המתאם ותוספת הקרום הנקבובי
    1. נקו את רכיבי המתכת ברצף עם מים שעברו דה-יוניזציה, לאחר מכן 70% אתנול, ולאחר מכן שוב מים שעברו דה-יוניזציה.
    2. בצע Autoclave את האלקטרודה התחתונה או "סירים" ואלקטרודות טבילה עליונה ולעקר את כל שאר הרכיבים של מודול התא עם 70% אתנול.
    3. במכסה מנוע סטרילי, התקינו את כל 24 האלקטרודות/"סירים" התחתונים על ידי הברגתם למודול התא, תוך הקפדה על סטריליות לאורך כל הדרך.
    4. הוסף 900 μL של מדיה בסיסית לבארות.
      הערה: מדיית הבסיס מתווספת לבאר התחתונה, הפועלת כתא הבסיס של האנדותל. מומלץ לא להשתמש בסרום בתא זה כדי לשכפל בצורה אמינה יותר את הסביבה הבסיסית של אנדותל המוח.
    5. חבר את אלקטרודות הטבילה באופן מגנטי למכסה מודול התא וסגור את המכסה מעל הבארות כך שהאלקטרודות הטובלות ייכנסו לתוך סירי האלקטרודות התחתונים.
    6. חבר את מודול התא למתאם באינקובטור והשאר אותו לפחות שעה אחת כדי להתאזן. בשלב זה, פתח את התוכנה כדי לטעון את מפת צלחת הניסוי תחת הכרטיסייה פריסה , ובכך להטמיע את מפת צלחת הטיפול לתוך הקבצים, אשר בסופו של דבר יכיל את הנתונים.
    7. כאשר נדרש ציפוי, צפו את תוספות הממברנה במכסה מנוע סטרילי על ידי שימוש בפלטת תרבית סטרילית בת 24 בארות כדי להחזיק את התוספות והוספת מצע ECM (למשל, קולגן) לחלק הפנימי של הבאר, כמפורט בסעיף 1.2.3 השתמשו בפיפטה חד-ערוצית כדי לטעון את מצע ה-ECM לכל באר בזהירות.
  2. הכנת תאי האנדותל במוח לזריעה על עלון הממברנה והתחלת הניסוי
    1. קצרו וספרו את תאי האנדותל במוח לפי סעיף 1.3, אך הכינו את הטיטרציה הסופית הנדרשת בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. ודא שהתאים שנקטפו נמצאים במדיה מלאה וחמימה, כולל כל גורמי הגדילה והסרום הנדרשים.
    2. באמצעות פיפטה חד-ערוצית, זרעו בזהירות את תאי האנדותל במוח (80,000 בפרוטוקול זה) לתוך התא האפי של באר המוחדרת ב-350 מיקרוליטר של מדיה שלמה.
    3. כלול באר ללא תאים על ידי צפירת מדיה שלמה רק לתוך אחת התוספות.
    4. הסר את מודול התא מהאינקובטור ומקם אותו במכסה המנוע הסטרילי. מעבירים את התוספות המוכנות לסירי האלקטרודות התחתונים באמצעות זוג פינצטות כדי לטפל רק בתמיכות העליונות של האינווסט. הימנעו מבועות הנוצרות מתחת לממברנה.
    5. החזירו את מודול התא לאינקובטור מעל המתאם.
    6. בתוכנה, בכרטיסייה ניסוי , תחת המקטע ספקטרום , בחר התחל ב- 1 הרץ ועצור ב- 100 קילוהרץ כדי לקבל נתונים על פני כל טווח התדרים; בחר שלבים עדינים .
    7. תחת זמן המתנה, בחר 15 דקות כדי לאפשר מדידות רציפות בקצב המהיר ביותר המבוצע על-ידי התוכנה.
    8. לחץ על התחל כדי להתחיל את הניסוי ולאפשר לתאי אנדותל במוח להתרבות וליצור שכבה אחת עם עמידות גבוהה. שלב זה אורך כ-48 שעות.
  3. טיפול בתאי אנדותל במוח באמצעות תאים סרטניים וציטוקינים על תוספות הממברנה
    1. ב 48 שעות, להכין את הציטוקינים או התאים לטיפול (למשל, תאי מלנומה) לפי סעיף 1.5, כולל ביצוע ספירת תאים במידת הצורך, ולאסוף בצינורות רצועה 1 מ"ל או שווה ערך.
    2. הכינו טיפול בריכוזים נכונים להוספת 70 מיקרוליטר לכל באר (הכנסה). מניחים טיפולים באינקובטור כדי להתחמם.
    3. מכיוון שהמכשיר כאן מבצע מדידות כל 15 דקות, בחר זמן טיפול שמתחיל מיד לאחר השלמת המדידה. בשלב זה, הסר את מודול התא מהאינקובטור ונגב אותו בעדינות עם 70% אתנול באמצעות מגבונים ללא מוך.
    4. במכסה מנוע סטרילי, לפתוח את מודול התא בזהירות פיפטה 70 μL של הטיפול לתוך החדר apical של הכנס המתאים. עשו זאת באמצעות פיפטה חד-ערוצית והוסיפו בתנועה מעגלית, תוך הימנעות מבועות. השלם שלב זה תוך פחות מ- 10 דקות כדי להחזיר את מודול התא למתאם לפני תחילת המדידה הבאה.
    5. לחץ על עצור כדי לסיים את הניסוי. ייצא את הנתונים ישירות ל- xls. קובץ תחת הקובץ | Export Tab. תן שם לקובץ זה ושמור אותו כראוי לאחר פתיחתו.

תוצאות

פירוש נתוני עכבת ECIS

הבנת תנאי ניסוי אופטימליים
כאן ניתן לצפות בנתונים ישירות באמצעות התוכנה (איור 2A) או לייצא אותם לצורך ניתוח והתוויית גרפים (איור 2B). איור 2A מציג דוגמה לנתונים המוצגים בממשק התוכנה בפ?...

Discussion

מחקרים טיפוליים על מחלות המשפיעות על BBB חייבים לקחת בחשבון את החשיבות של מחסום אנדותל במוח, שלמות וויסות. לדוגמה, הפרעה במחסום האנדותל במוח נחקרת באופן קריטי בגרורות של סרטן למוח מאתרים אנטומיים אחרים. הסיבה לכך היא שהאנדותל במוח מהווה את המחסום הראשון נגד תאי הגידול במחזור. כפי שהוזכר קוד...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

Akshata Anchan מומן על ידי הקרן הנוירולוגית של ניו זילנד עבור מלגת גילספי (סימוכין למענק: 1628-GS) ומלגה ראשונה (סימוכין למענק: 2021 FFE). עלות המחקר מומנה חלקית גם על ידי מלגת הקרן הנוירולוגית לשנת 2021 FFE וקרן פיתוח המחקר של הפקולטה באוניברסיטת אוקלנד. ג'יימס האקלסבי מומן על ידי מלגה מקרן המחקר הרפואי של אוקלנד. תודה לצוות Baguley ולמרכז המחקר של אגודת הסרטן של אוקלנד עבור קווי תאי המלנומה NZM בניו זילנד שמקורם בחולה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
aMEMGibco12561072Melanoma cell base media
cellZscope arraynanoAnalyticscellZscope2; software v4.3.1TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tailGibcoA1048301ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMPSigma-AldrichD0627Brain endothelial media supplement
ECIS array Applied BiophysicsECIS ZΘ; software v1.2.163.0Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate Applied Biophysics96W20idf 96-well biosensor plate
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Brain endothelial media supplement
hCMVECApplied Biological MaterialsT0259Brain endothelial cell line
hEGFPeproTechPTAF10015100Brain endothelial media supplement
HeparinSigma-AldrichH-3393Brain endothelial media supplement
hFGFPeproTechPTAF10018B50Brain endothelial media supplement
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Brain endothelial media supplement
IL-1βPeproTech200-01BCytokine
Insulin-Transferrin-Sodium SeleniteSigma-Aldrich11074547001Melanoma cell media supplement
M199Gibco11150-067Brain endothelial cell base media
MilliQ waterDeionized water
PBS 1xGibco10010-023
TNFαPeproTech300-01ACytokine
Transwell insertCorningCLS3464Porous membrane insert
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Dissociation reagent

References

  1. Fidler, I. J., Schackert, G., Zhang, R. D., Radinsky, R., Fujimaki, T. The biology of melanoma brain metastasis. Cancer Metastasis Reviews. 18 (3), 387-400 (1999).
  2. Tomlinson, E. Theory and practice of site-specific drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 1 (2), 87-198 (1987).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Neuwelt, E., et al. Strategies to advance translational research into brain barriers. The Lancet. Neurology. 7 (1), 84-96 (2008).
  5. Stolp, H. B., Dziegielewska, K. M. Review: Role of developmental inflammation and blood-brain barrier dysfunction in neurodevelopmental and neurodegenerative diseases. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (2), 132-146 (2009).
  6. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: Beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  7. Kacem, K., Lacombe, P., Seylaz, J., Bonvento, G. Structural organization of the perivascular astrocyte endfeet and their relationship with the endothelial glucose transporter: A confocal microscopy study. Glia. 23 (1), 1-10 (1998).
  8. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  9. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the cns are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science. 239 (4837), 290-292 (1988).
  10. Smith, J. A., Das, A., Ray, S. K., Banik, N. L. Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases. Brain Research Bulletin. 87 (1), 10-20 (2012).
  11. Denes, A., et al. Proliferating resident microglia after focal cerebral ischaemia in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (12), 1941-1953 (2007).
  12. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Celular andl Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
  13. Felgenhauer, K. The blood-brain barrier redefined. Journal of Neurology. 233 (4), 193-194 (1986).
  14. Scheinberg, L. C., Edelman, F. L., Levy, W. A. Is the brain "an immunologically privileged site"?I. Studies based on intracerebral tumor homotransplantation and isotransplantation to sensitized hosts. Archives of Neurology. 11, 248-264 (1964).
  15. Carbonell, W. S., Ansorge, O., Sibson, N., Muschel, R. The vascular basement membrane as "soil" in brain metastasis. PLoS One. 4 (6), e5857 (2009).
  16. Nag, S. Morphology and molecular properties of cellular components of normal cerebral vessels. Methods in Molecular Medicine. 89, 3-36 (2003).
  17. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 71 (1), 113-128 (2011).
  18. Bauer, H. C., et al. New aspects of the molecular constituents of tissue barriers. Journal of Neural Transmission (Vienna). 118 (1), 7-21 (2011).
  19. Balda, M. S., Matter, K. Tight junctions as regulators of tissue remodelling. Current Opinion in Cell Biology. 42, 94-101 (2016).
  20. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
  21. Van Itallie, C. M., Tietgens, A. J., Anderson, J. M. Visualizing the dynamic coupling of claudin strands to the actin cytoskeleton through zo-1. Molecular Biology of the Cell. 28 (4), 524-534 (2017).
  22. Takeichi, M. Historical review of the discovery of cadherin, in memory of tokindo okada. Development, Growth & Differentiation. 60 (1), 3-13 (2018).
  23. Vincent, P. A., Xiao, K., Buckley, K. M., Kowalczyk, A. P. Ve-cadherin: Adhesion at arm's length. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286 (5), C987-C997 (2004).
  24. Brasch, J., et al. Structure and binding mechanism of vascular endothelial cadherin: A divergent classical cadherin. Journal of Molecular Biology. 408 (1), 57-73 (2011).
  25. Gavard, J., Patel, V., Gutkind, J. S. Angiopoietin-1 prevents vegf-induced endothelial permeability by sequestering src through mdia. Developmental Cell. 14 (1), 25-36 (2008).
  26. Romero, I. A., et al. Changes in cytoskeletal and tight junctional proteins correlate with decreased permeability induced by dexamethasone in cultured rat brain endothelial cells. Neuroscience Letters. 344 (2), 112-116 (2003).
  27. Aragon-Sanabria, V., et al. Ve-cadherin disassembly and cell contractility in the endothelium are necessary for barrier disruption induced by tumor cells. Scientific Reports. 7, 45835 (2017).
  28. Angelini, D. J., et al. Tnf-alpha increases tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and opens the paracellular pathway through fyn activation in human lung endothelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (6), L1232-L1245 (2006).
  29. Nwariaku, F. E., et al. Tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and the regulation of microvascular permeability. Surgery. 132 (2), 180-185 (2002).
  30. Orsenigo, F., et al. Phosphorylation of ve-cadherin is modulated by haemodynamic forces and contributes to the regulation of vascular permeability in vivo. Nature Communications. 3, 1208 (2012).
  31. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  32. Chen, Z., Tzima, E. Pecam-1 is necessary for flow-induced vascular remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1067-1073 (2009).
  33. Privratsky, J. R., Newman, P. J. Pecam-1: Regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  34. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: Targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 315 (3), C343-C356 (2018).
  35. Bernardo-Castro, S., et al. Pathophysiology of blood-brain barrier permeability throughout the different stages of ischemic stroke and its implication on hemorrhagic transformation and recovery. Frontiers in Neurology. 11, 594672 (2020).
  36. Wilhelm, I., Molnár, J., Fazakas, C., Haskó, J., Krizbai, I. A. Role of the blood-brain barrier in the formation of brain metastases. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1383-1411 (2013).
  37. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier". Frontiers in Neuroscience. 17, 1047778 (2023).
  38. Abate-Daga, D., Ramello, M. C., Smalley, I., Forsyth, P. A., Smalley, K. S. M. The biology and therapeutic management of melanoma brain metastases. Biochemistry & Pharmacology. 153, 35-45 (2018).
  39. Anchan, A., et al. Real-time measurement of melanoma cell-mediated human brain endothelial barrier disruption using electric cell-substrate impedance sensing technology. Biosensors (Basel). 9 (2), (2019).
  40. Anchan, A., et al. Analysis of melanoma secretome for factors that directly disrupt the barrier integrity of brain endothelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8193 (2020).
  41. Hucklesby, J. J. W., et al. Comparison of leading biosensor technologies to detect changes in human endothelial barrier properties in response to pro-inflammatory tnfα and il1β in real-time. Biosensors (Basel). 11 (5), 159 (2021).
  42. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (17), 7896 (1991).
  43. Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of gpcr-mediated changes in endothelial barrier function: Overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 467 (10), 2193-2218 (2015).
  44. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -. J. Impedance-based cell monitoring: Barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 5 (2013).
  45. Anchan, A., Finlay, G., Angel, C. E., Hucklesby, J. J. W., Graham, S. E. Melanoma mediated disruption of brain endothelial barrier integrity is not prevented by the inhibition of matrix metalloproteinases and proteases. Biosensors (Basel). 12 (8), 660 (2022).
  46. Robilliard, L. D., et al. The importance of multifrequency impedance sensing of endothelial barrier formation using ecis technology for the generation of a strong and durable paracellular barrier. Biosensors. 8 (3), 64 (2018).
  47. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. The Journal of Clinical Investigation. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  48. Qi, J., Chen, N., Wang, J., Siu, C. H. Transendothelial migration of melanoma cells involves n-cadherin-mediated adhesion and activation of the beta-catenin signaling pathway. Molecular Biology of the Cell. 16 (9), 4386-4397 (2005).
  49. Brayton, J., Qing, Z., Hart, M. N., Vangilder, J. C., Fabry, Z. Influence of adhesion molecule expression by human brain microvessel endothelium on cancer cell adhesion. Journal of Neuroimmunology. 89 (1-2), 104-112 (1998).
  50. Soto, M. S., Serres, S., Anthony, D. C., Sibson, N. R. Functional role of endothelial adhesion molecules in the early stages of brain metastasis. Neuro-oncology. 16 (4), 540-551 (2014).
  51. García-Martín, A. B., et al. Vla-4 mediated adhesion of melanoma cells on the blood-brain barrier is the critical cue for melanoma cell intercalation and barrier disruption. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (10), 1995-2010 (2018).
  52. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  53. Stone, N. L., England, T. J., O'sulli, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
  54. . Abstracts from the international symposium "signal transduction at the blood-brain barriers" 2022. Fluids and Barriers of the CNS. 20 (1), 26 (2023).
  55. Srinivasan, B., et al. Teer measurement techniques for in vitro barrier model systems. SLAS Technology. 20 (2), 107-126 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BBBECISCellZscope

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved