がん細胞とサイトカインに応答した2つのインピーダンスベースバイオセンサーによる脳内皮バリア完全性の変化の測定

要約

ここでは、インピーダンスベースのバイオセンサーであるECISとcellZscopeを使用して、脳内皮バリア強度を測定する手法を示します。脳内皮の in vitro モデルにさまざまな刺激を追加する準備と技術について詳しく説明します。私たちは、調査結果を測定し、記録し、代表的な分析を行います。

要約

血液脳関門(BBB)は、血液中の有害な病原体から脳実質を保護します。BBBは、周皮細胞、星状細胞性足突起、および密接に付着した内皮細胞からなる神経血管ユニットで構成されています。ここでは、脳内皮細胞が血液媒介性病原体に対する最初のバリアラインを形成しています。がんや神経炎症などの状態では、血液中の循環因子がこのバリアを破壊する可能性があります。疾患の進行は、バリアの破壊後に著しく悪化し、脳の領域へのアクセスまたは障害を可能にします。これは、特に脳のレベルで利用可能な治療オプションが限られているため、予後を著しく悪化させます。したがって、新たな研究は、血液中のこれらの有害な因子が脳内皮細胞と相互作用するのを防ぐことができる潜在的な治療法を調査することを目的としています。

市販のElectric Cell-Substrate Impedance Sensing(ECIS)およびcellZscope機器は、BBB内皮などの細胞単層全体のインピーダンスを測定して、それらのバリア強度を決定します。ここでは、さまざまな刺激が加えられたときの脳内皮バリアの完全性を評価するための両方のバイオセンサーの使用について詳しく説明します。重要なのは、複数の変数と生物学的処理の同時研究のためのハイスループット能力の重要性を強調することです。

概要

この記事では、微小血管細胞の評価における現在の傾向について説明します。具体的には、脳微小血管内皮細胞のバリア特性を測定するための2つの市販のプラットフォームの使用について詳しく説明します。内皮細胞は血液に面した細胞で、血管壁の内側を覆っています。しかし、脳微小血管は、保護血液脳関門(BBB)^1,2,3の形成を助けるという点で独特です。BBBは、血液から脳への分子の輸送を調節する働きをします。中枢神経系 (CNS) に影響を与える末梢疾患は、一般的に BBB の機能不全に関連しています ^4,5。BBBを形成する解剖学的構造は、体の他の場所にある血液-組織界面には存在しません⁶。これらの解剖学的構造は、脳内皮細胞の近くに位置する周皮細胞を含み、それらの増殖と透過性を調節します。星状細胞の足のプロセスは、栄養素のシャッフルと解剖学的サポートに関与しています^7,8;脳内に常在するマクロファージである

プロトコル

1. ECIS を使用して、さまざまな治療に応じた脳内皮バリアの完全性の変化を監視する

1. ソフトウェア、アレイ・ステーション、マシンのセットアップ
   1. 96ウェルアレイステーションをマシンに接続します。アレイステーションをビニール袋に入れ、アッセイの少なくとも1時間前にインキュベーターに入れてウォームアップさせます。実験の直前にビニール袋を取り出してください。
   2. 準備ができたら、マシンの電源を入れ、コンピューター上で対応するソフトウェアを開きます。「データの収集」タブの下にある「設定」ボタンを押します。ソフトウェアは接続チェックを完了し、接続されているアダプターのタイプ(例:96ウェルアレイステーション)を検出し、図のプレートマップに赤いウェルを表示します。これは、ソフトウェアがアダプターを検出したが、プレートが取り付けられたことを検出できないことを示しています。これで、システムは96ウェルプレートの準備が整いました。
2. 96ウェルバイオセンサープレートの準備
   注:96ウェルプレートの配置が使用されます。各ウェルの基部は、金メッキ電極の指を間立ててパターン化されています。プレートは滅菌パックに入っており、滅菌フード/生物学的安全キャビネットでのみ開封する必要があります。金電極は、電極容量を維持するために、まず10 mMシス....

ディスカッション

BBBに影響を与える疾患の治療研究では、脳内皮バリアの完全性と調節の重要性を考慮する必要があります。例えば、脳内皮関門の破壊は、他の解剖学的部位から脳へのがんの転移において批判的に研究されています。これは、脳内皮が循環腫瘍細胞に対する最初のバリアを形成するためです。冒頭で述べたように、内皮バリアの完全性に関する in vitro 研究は、再現性があり、非侵襲的.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
aMEM	Gibco	12561072	Melanoma cell base media
cellZscope array	nanoAnalytics	cellZscope2; software v4.3.1	TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tail	Gibco	A1048301	ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Brain endothelial media supplement
ECIS array	Applied Biophysics	ECIS ZΘ; software v1.2.163.0	Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate	Applied Biophysics	96W20idf	96-well biosensor plate
FBS	Sigma-Aldrich	12203C-500ML
GlutaMAX	Gibco	305050-061	Brain endothelial media supplement
hCMVEC	Applied Biological Materials	T0259	Brain endothelial cell line
hEGF	PeproTech	PTAF10015100	Brain endothelial media supplement
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3393	Brain endothelial media supplement
hFGF	PeproTech	PTAF10018B50	Brain endothelial media supplement
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Brain endothelial media supplement
IL-1β	PeproTech	200-01B	Cytokine
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	11074547001	Melanoma cell media supplement
M199	Gibco	11150-067	Brain endothelial cell base media
MilliQ water			Deionized water
PBS 1x	Gibco	10010-023
TNFα	PeproTech	300-01A	Cytokine
Transwell insert	Corning	CLS3464	Porous membrane insert
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Dissociation reagent