Misurazione dei cambiamenti nell'integrità della barriera endoteliale cerebrale con due biosensori basati sull'impedenza in risposta alle cellule tumorali e alle citochine

Riepilogo

Qui dimostriamo la tecnica di utilizzo di biosensori basati sull'impedenza: ECIS e cellZscope, per misurare la forza della barriera endoteliale cerebrale. Descriviamo in dettaglio la preparazione e la tecnica per aggiungere vari stimoli a un modello in vitro dell'endotelio cerebrale. Misuriamo, registriamo e forniamo un'analisi rappresentativa dei risultati.

Abstract

La barriera emato-encefalica (BEE) protegge il parenchima cerebrale dagli agenti patogeni dannosi nel sangue. La BBB è costituita dall'unità neurovascolare, che comprende periciti, processi astrocitici del piede e cellule endoteliali strettamente aderenti. Qui, le cellule endoteliali cerebrali formano la prima linea di barriera contro gli agenti patogeni trasmessi per via ematica. In condizioni come il cancro e la neuroinfiammazione, i fattori circolanti nel sangue possono interrompere questa barriera. La progressione della malattia peggiora significativamente dopo l'interruzione della barriera, che consente l'accesso o la compromissione delle regioni del cervello. Ciò peggiora significativamente la prognosi, in particolare a causa delle limitate opzioni di trattamento disponibili a livello cerebrale. Pertanto, gli studi emergenti mirano a studiare potenziali terapie che possono impedire a questi fattori dannosi nel sangue di interagire con le cellule endoteliali cerebrali.

Gli strumenti ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) e cellZscope, disponibili in commercio, misurano l'impedenza attraverso i monostrati cellulari, come l'endotelio BBB, per determinarne la forza di barriera. Qui descriviamo in dettaglio l'uso di entrambi i biosensori nella valutazione dell'integrità della barriera endoteliale cerebrale dopo l'aggiunta di vari stimoli. Fondamentalmente, sottolineiamo l'importanza della loro capacità ad alto rendimento per lo studio simultaneo di più variabili e trattamenti biologici.

Introduzione

Questo articolo discute le tendenze attuali nella valutazione delle cellule microvascolari. In particolare, descriviamo in dettaglio l'uso di due piattaforme disponibili in commercio per misurare le proprietà di barriera delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali. Le cellule endoteliali sono cellule rivolte verso il sangue, che rivestono la parete del vaso. Tuttavia, i microvasi cerebrali sono unici in quanto aiutano a formare la barriera emato-encefalica protettiva (BBB)^1,2,3. La BBB funziona per regolare il trasporto delle molecole dal sangue al cervello. Le malatti....

Protocollo

1. Utilizzo dell'ECIS per monitorare i cambiamenti nell'integrità della barriera endoteliale cerebrale in risposta a vari trattamenti

1. Configurazione del software, della stazione array e della macchina
   1. Collegare la stazione array a 96 pozzetti alla macchina. Posizionare la stazione di array in un sacchetto di plastica e posizionarla nell'incubatore almeno 1 ora prima del test per consentirne il riscaldamento. Rimuovere il sacchetto di plastica immediatamente prima dell'esperimento.
   2. Una volta pronta, accendi la macchina e apri il software corrispondente sul computer. Premere il pulsante Configurazione ....

Discussione

Gli studi terapeutici sulle malattie che colpiscono la BBB devono considerare l'importanza dell'integrità e della regolazione della barriera endoteliale cerebrale. Ad esempio, la rottura della barriera endoteliale cerebrale è studiata in modo critico nelle metastasi del cancro al cervello da altri siti anatomici. Questo perché l'endotelio cerebrale costituisce la prima barriera contro le cellule tumorali circolanti. Come accennato in precedenza nell'introduzione, gli studi in vitro sull'integrità della barri.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
aMEM	Gibco	12561072	Melanoma cell base media
cellZscope array	nanoAnalytics	cellZscope2; software v4.3.1	TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tail	Gibco	A1048301	ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Brain endothelial media supplement
ECIS array	Applied Biophysics	ECIS ZΘ; software v1.2.163.0	Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate	Applied Biophysics	96W20idf	96-well biosensor plate
FBS	Sigma-Aldrich	12203C-500ML
GlutaMAX	Gibco	305050-061	Brain endothelial media supplement
hCMVEC	Applied Biological Materials	T0259	Brain endothelial cell line
hEGF	PeproTech	PTAF10015100	Brain endothelial media supplement
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3393	Brain endothelial media supplement
hFGF	PeproTech	PTAF10018B50	Brain endothelial media supplement
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Brain endothelial media supplement
IL-1β	PeproTech	200-01B	Cytokine
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	11074547001	Melanoma cell media supplement
M199	Gibco	11150-067	Brain endothelial cell base media
MilliQ water			Deionized water
PBS 1x	Gibco	10010-023
TNFα	PeproTech	300-01A	Cytokine
Transwell insert	Corning	CLS3464	Porous membrane insert
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Dissociation reagent