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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui dimostriamo la tecnica di utilizzo di biosensori basati sull'impedenza: ECIS e cellZscope, per misurare la forza della barriera endoteliale cerebrale. Descriviamo in dettaglio la preparazione e la tecnica per aggiungere vari stimoli a un modello in vitro dell'endotelio cerebrale. Misuriamo, registriamo e forniamo un'analisi rappresentativa dei risultati.

Abstract

La barriera emato-encefalica (BEE) protegge il parenchima cerebrale dagli agenti patogeni dannosi nel sangue. La BBB è costituita dall'unità neurovascolare, che comprende periciti, processi astrocitici del piede e cellule endoteliali strettamente aderenti. Qui, le cellule endoteliali cerebrali formano la prima linea di barriera contro gli agenti patogeni trasmessi per via ematica. In condizioni come il cancro e la neuroinfiammazione, i fattori circolanti nel sangue possono interrompere questa barriera. La progressione della malattia peggiora significativamente dopo l'interruzione della barriera, che consente l'accesso o la compromissione delle regioni del cervello. Ciò peggiora significativamente la prognosi, in particolare a causa delle limitate opzioni di trattamento disponibili a livello cerebrale. Pertanto, gli studi emergenti mirano a studiare potenziali terapie che possono impedire a questi fattori dannosi nel sangue di interagire con le cellule endoteliali cerebrali.

Gli strumenti ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) e cellZscope, disponibili in commercio, misurano l'impedenza attraverso i monostrati cellulari, come l'endotelio BBB, per determinarne la forza di barriera. Qui descriviamo in dettaglio l'uso di entrambi i biosensori nella valutazione dell'integrità della barriera endoteliale cerebrale dopo l'aggiunta di vari stimoli. Fondamentalmente, sottolineiamo l'importanza della loro capacità ad alto rendimento per lo studio simultaneo di più variabili e trattamenti biologici.

Introduzione

Questo articolo discute le tendenze attuali nella valutazione delle cellule microvascolari. In particolare, descriviamo in dettaglio l'uso di due piattaforme disponibili in commercio per misurare le proprietà di barriera delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali. Le cellule endoteliali sono cellule rivolte verso il sangue, che rivestono la parete del vaso. Tuttavia, i microvasi cerebrali sono unici in quanto aiutano a formare la barriera emato-encefalica protettiva (BBB)1,2,3. La BBB funziona per regolare il trasporto delle molecole dal sangue al cervello. Le malattie periferiche che colpiscono il sistema nervoso centrale (SNC) sono comunemente collegate a un fallimento funzionale della BBB 4,5. Le strutture anatomiche che formano la BBB non sono presenti all'interfaccia sangue-tessuto in altre parti del corpo6. Queste strutture anatomiche comprendono periciti, che si trovano vicino alle cellule endoteliali cerebrali, e ne regolano la proliferazione e la permeabilità; processi astrocitici del piede, che sono coinvolti nel rimescolamento dei nutrienti e nel supporto anatomico 7,8; le microglia, che sono i macrofagi residenti nel cervello, spesso implicati nella neuroinfiammazione e nell'ischemia 9,10,11,12, e l'endotelio cerebrale, che forma un monostrato di cellule strettamente aderenti senza fenestrazioni13,14. L'endotelio cerebrale è tipicamente noto come "barriera endoteliale cerebrale" e forma una barriera strutturale e funzionale in cinque modi distinti. In primo luogo, il componente della barriera paracellulare è formato dall'adesione alle giunzioni laterali cellula-cellula. In secondo luogo, la componente della barriera transcellulare è sostenuta dalla regolazione dell'endocitosi. In terzo luogo, una membrana basale specializzata ancora e sostiene l'endotelio attraverso una ricca matrice extracellulare composta in gran parte da collagene15,16. Gli ultimi due meccanismi sono attraverso enzimi e trasportatori che aiutano a regolare il metabolismo dei farmaci e l'assorbimento di grandi molecole, rispettivamente17.

Le interazioni paracellulari costituiscono il componente principale della barriera endoteliale cerebrale, facilitata da giunzioni strette (TJ), che comprendono le proteine di membrana claudine, l'occludina e le molecole di adesione giunzionale (JAM)18. Il forte legame omotipico delle proteine di membrana costituisce la prima barriera strutturale, sebbene le JAM si leghino anche alle proteine accessorie zonula occludens, legando così le TJ al citoscheletro di actina19,20. I legami di actina posizionano i TJ nella regione apicale dell'endotelio21, che polarizza funzionalmente le cellule endoteliali per formare la barriera strutturale su questo lato apicale o "rivolto verso il sangue". Nella regione basolaterale dell'endotelio, giunzioni aderenti altamente specializzate (AJ) svolgono un ruolo regolatore nel mantenimento della morfologia cellulare. Le AJ comprendono caderine calcio-dipendenti, che collegano il citoscheletro delle cellule endoteliali vicine attraverso il complesso della famiglia delle catenine 20,22. La caderina endoteliale vascolare (VE-caderina) è una di queste caderine, che regola l'espressione delle proteine TJ e la funzione complessiva della barriera endoteliale per mantenere l'integrità del monostrato endoteliale 23,24,25,26,27. I modulatori infiammatori, come il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNFα), segnalano l'internalizzazione della VE-caderina lontano dalle giunzioni cellulari, portando alla destabilizzazione della barriera endoteliale 28,29,30. La molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche (PECAM)31 è un'altra caderina AJ che stabilizza e rimodella le giunzioni endoteliali32,33. La densità di queste proteine giunzionali limita il flusso di elettroni attraverso lo spazio paracellulare tra le cellule endoteliali. Questo attributo viene utilizzato per misurare la forza della barriera endoteliale o la resistenza elettrica trans-endoteliale (TER) attraverso monostrati cellulari confluenti come l'endotelio cerebrale.

Gli studi terapeutici si concentrano sull'endotelio cerebrale a causa del suo ruolo vitale nell'interfaccia sangue-cervello. Diverse malattie influenzano negativamente l'endotelio cerebrale, comprese le condizioni neuroinfiammatorie come la sclerosi multipla, l'ictus, le malattie neurodegenerative e il cancro 34,35,36,37. Una volta che la barriera endoteliale cerebrale viene interrotta, la progressione della malattia peggiora significativamente poiché il cervello è effettivamente esposto agli stimoli dannosi nel sangue38. Abbiamo precedentemente dimostrato che i mediatori infiammatori e le cellule di melanoma metastatico interrompono la barriera endoteliale cerebrale utilizzando due tecnologie che misurano la forza della barriera endoteliale 39,40,41.

Il rilevamento dell'impedenza cellula-substrato elettrico (ECIS) è un biosensore basato sull'impedenza che consente la valutazione in tempo reale e senza marcatura dell'integrità della barriera cellulare endoteliale. In questo caso, i pozzetti del saggio sono rivestiti con elettrodi placcati in oro, che introducono corrente alternata (CA) nel sistema di analisi. Le cellule endoteliali cerebrali vengono seminate in questi pozzetti, il che significa che l'AC può essere applicato attraverso le cellule. (Figura 1A-pozzetto; vista laterale). Questo stabilisce il circuito elettrico, che viene utilizzato per calcolare l'impedenza (Figura 1A-schema elettrico). L'impedenza aumenta quando le cellule endoteliali cerebrali aderiscono alla placca e iniziano a formare le loro giunzioni paracellulari. L'impedenza si stabilizza quando le cellule endoteliali diventano confluenti, formando un monostrato e limitando il flusso di corrente. L'applicazione della corrente alternata a diverse frequenze influenza il percorso del flusso di corrente attraverso le cellule endoteliali. La corrente scorre attraverso il corpo cellulare endoteliale quando viene applicata a una frequenza più alta (>104 Hz). Ciò fornisce informazioni sulla capacità del monostrato di celle, utilizzato per valutare l'adesione e la diffusione delle cellule. Alle basse frequenze (102-10 4 Hz) l'impedenza della membrana è elevata, limitando il flusso di corrente attraverso le celle. In questo caso, la maggior parte della corrente naviga tra le celle. A circa 4.000 Hz, la resistenza al flusso di corrente è attribuita principalmente alle giunzioni cellula-cellula endoteliale, attraverso lo spazio intercellulare . Pertanto, qualsiasi variazione di resistenza a questa frequenza fornisce informazioni sull'integrità della barriera endoteliale.

Mentre le misure di impedenza grezza possono fornire informazioni sulle proprietà della barriera, il software ECIS può quindi modellare matematicamente la resistenza totale misurata su più frequenze CA e, più precisamente, separarla in due parametri chiave dell'integrità della barriera. Questi parametri sono la resistenza paracellulare tra le membrane laterali delle cellule vicine (resistenza beta-Rb; barriera paracellulare; Figura 1A-frecce verdi), e la resistenza basolaterale tra lo strato di cellule basali e l'elettrodo (resistenza alfa-Alfa; barriera basolaterale; Figura 1A-frecce blu). Un terzo parametro modellato viene anche misurato come la capacità della membrana cellulare (Cm; Figura 1A-frecce rosse). Il Cm mostra il flusso capacitivo di corrente attraverso le celle, indicativo della composizione della membrana cellulare. In questo caso, i cambiamenti nella Rb o barriera paracellulare indicano alterazioni nei TJ e negli AJ, cruciali per mantenere l'integrità della barriera endoteliale. Per interpretare in modo affidabile l'Rb, vengono fatte quattro ipotesi chiave, come sviluppate da Giaever e Keese42 e discusse criticamente da Stolwijk et al.43. Sebbene queste ipotesi siano importanti per garantire la validità della modellazione ECIS, sono prontamente soddisfatte da un monostrato endoteliale confluente.

Come l'ECIS, il cellZscope consente di misurare le variazioni della resistenza della barriera endoteliale; tuttavia, le cellule vengono coltivate su un inserto di membrana poroso. In questo sistema, il circuito elettrico si trova tra due elettrodi su entrambi i lati di un inserto a membrana. Il monostrato endoteliale viene coltivato sopra questo inserto di membrana, consentendo la misurazione della resistenza elettrica trans-endoteliale (TER) (Figura 1B-pozzetto; vista laterale). Come per l'ECIS, in questo sistema, l'impedenza totale può essere attribuita a diversi componenti di barriera, dipendenti dalla frequenza della corrente applicata44. Alle basse frequenze, la capacità dell'elettrodo (CEl) domina l'impedenza totale del sistema. In alternativa, alle alte frequenze, la resistenza del mezzo (mezzo R) domina l'impedenza totale. Pertanto, le misure più utili rientrano nell'intervallo delle medie frequenze (102-10 4 Hz), che fornisce informazioni su due componenti chiave della barriera endoteliale (Figura 1B-schema circuitale). In primo luogo, a 10 3-104 Hz, la capacità dello strato di cella (CCl) domina l'impedenza complessiva poiché la resistenza della membrana (membrana R) è abbastanza alta da essere trascurata e la corrente scorre prevalentemente attraverso il condensatore. Quindi, il CCl indica le variazioni della resistenza attraverso la membrana cellulare. In alternativa, la TER impartisce prevalentemente l'impedenza complessiva a 102-10 3 Hz, dove il flusso di corrente viene incanalato attraverso spazi giunzionali tra cellule vicine, tenute insieme da proteine giunzionali. Quindi, questo fornisce informazioni sulla componente paracellulare della barriera endoteliale, come visto in precedenza con Rb su ECIS.

La Figura 1C descrive in dettaglio come specifiche regioni dell'endotelio cerebrale vengono interrotte dal trattamento con cellule di melanoma. Questa interruzione viene rilevata dai biosensori da una variazione del flusso di corrente attraverso lo spazio paracellulare (misurata come Rb o TER); lo spazio basolaterale (misurato come Alfa); e la membrana cellulare (misurata come Cm o CCl). Abbiamo utilizzato entrambi i biosensori descritti in questa introduzione per misurare il cambiamento della barriera endoteliale cerebrale dopo il trattamento con vari stimoli come citochine o cellule di melanoma invasive. La resistenza misurata diminuisce se un dato stimolo interrompe la barriera endoteliale, creando un percorso di minor resistenza per consentire il flusso di corrente. Quindi, una diminuzione della "resistenza alla barriera" suggerisce la perdita dell'integrità della barriera o la rottura della barriera endoteliale cerebrale. In questi saggi, abbiamo studiato questa interruzione interpretando la resistenza e i parametri modellati in tempo reale. L'applicazione di ECIS e cellZscope nell'affrontare tali questioni di ricerca è descritta in dettaglio altrove 39,41,45,46.

La ricerca in vitro consente la scoperta di meccanismi cruciali della malattia rivelando molecole e percorsi funzionali che fanno progredire la malattia. Tuttavia, ciò richiede una replicazione affidabile della malattia in vitro, che differisce sostanzialmente da un corpo funzionante. In uno scenario ideale, la ricerca in vitro dovrebbe essere riproducibile, non invasiva, priva di marcature, quantitativa e imitare le influenze strutturali presenti in vivo. In questo articolo, descriviamo in dettaglio la metodologia per l'utilizzo di queste due tecnologie concorrenti per misurare i cambiamenti indotti dal trattamento nell'integrità della barriera endoteliale cerebrale. Discutiamo i vantaggi della combinazione dei loro risultati per fornire un quadro più completo dell'interruzione delle barriere e condividere i limiti che devono ancora essere superati.

Protocollo

1. Utilizzo dell'ECIS per monitorare i cambiamenti nell'integrità della barriera endoteliale cerebrale in risposta a vari trattamenti

  1. Configurazione del software, della stazione array e della macchina
    1. Collegare la stazione array a 96 pozzetti alla macchina. Posizionare la stazione di array in un sacchetto di plastica e posizionarla nell'incubatore almeno 1 ora prima del test per consentirne il riscaldamento. Rimuovere il sacchetto di plastica immediatamente prima dell'esperimento.
    2. Una volta pronta, accendi la macchina e apri il software corrispondente sul computer. Premere il pulsante Configurazione nella scheda Raccogli dati . Il software completerà un controllo della connessione, che rileverà il tipo di adattatore collegato (ad esempio, una stazione array a 96 pozzetti) e visualizzerà i pozzetti rossi nella mappa della piastra raffigurata. Questo indica che il software rileva l'adattatore ma non è in grado di rilevare una piastra collegata. Il sistema è ora pronto per la piastra a 96 pozzetti.
  2. Preparazione della piastra del biosensore a 96 pozzetti
    NOTA: Viene utilizzata la disposizione delle piastre a 96 pozzetti. La base di ogni pozzetto è modellata con dita interdigitate di elettrodi placcati in oro. Le piastre sono fornite in confezioni sterili che devono essere aperte solo in un cappuccio sterile/armadio di sicurezza biologica. Gli elettrodi d'oro devono prima essere stabilizzati chimicamente aggiungendo 10 mM di cisteina per mantenere la capacità dell'elettrodo.
    1. Preparare i 10 mM di cisteina in un trogolo sterile e, utilizzando un multicanale, pipettare con cura 100 μl in ciascun pozzetto. Incubare la cisteina per 15 minuti a temperatura ambiente e poi aspirare accuratamente, pipettando solo ai bordi del pozzetto, per evitare di graffiare l'elettrodo. Lavare via la cisteina almeno 2 volte con acqua deionizzata sterile (non PBS) utilizzando la stessa tecnica di pipettaggio.
      NOTA: Gli elettrodi a piastra possono anche essere stabilizzati elettricamente utilizzando mezzi caldi sull'apparecchiatura ECIS, invece di utilizzare il rivestimento di cisteina, come descritto nel protocollo del produttore.
    2. Preparare il substrato ECM in modo che funga da membrana basale sul fondo del pozzetto.
      NOTA: I substrati della ECM come il collagene o la laminina possono essere scelti a seconda delle esigenze della linea cellulare endoteliale cerebrale. Qui utilizziamo il collagene per una linea cellulare endoteliale microvascolare cerebrale umana (hCMVEC).
    3. Preparare 1 μg/cm2 di collagene a coda di topo I disciolto in acido acetico 0,02 M in un trogolo fresco e sterile (100 μl per pozzetto). Lasciare il collagene per 1 ora a bassa luminosità nella cappa sterile, quindi lavare accuratamente 2 volte con acqua deionizzata e un accurato pipettaggio.
      NOTA: Assicurarsi che la maggior parte dell'acqua deionizzata venga rimossa con la massima attenzione possibile dopo l'ultimo lavaggio e lasciare asciugare la piastra nella cappa. Si consiglia di utilizzare la piastra subito dopo il rivestimento; tuttavia, può essere conservato temporaneamente in acqua a 4 °C (meno di una settimana). La piastra è ora pronta per l'uso.
  3. Preparazione delle cellule endoteliali cerebrali per la semina sulla piastra del biosensore a 96 pozzetti
    NOTA: Si consiglia di ottimizzare prima la fase di crescita e la densità di semina della linea cellulare endoteliale da utilizzare. In questo protocollo è stata utilizzata la linea hCMVEC, che impiega 48 ore per raggiungere la confluenza dopo la semina a 20.000 cellule per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti.
    1. Raccogliere le cellule endoteliali cerebrali in una cappa sterile utilizzando un reagente di dissociazione delicato ed eseguire un conteggio accurato delle cellule. Utilizzare 20.000 hCMVEC in 100 μL di terreno per pozzetto per una fase di crescita costante per 48 ore. Preparare le cellule endoteliali cerebrali in eccesso per garantire un pipettaggio ottimale di tutti i 96 pozzetti.
      NOTA: Pertanto, per una piastra a 96 pozzetti, sono necessarie circa 2.000.000 di cellule in 10 mL di terreno preriscaldato.
    2. Trasferire le cellule endoteliali cerebrali in un nuovo trogolo sterile e, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere con cura 100 μl (20.000 cellule) di sospensione cellulare per pozzetto. Risospendere delicatamente le cellule nella depressione regolarmente per evitare che le cellule endoteliali si depositino nel tempo. Assicurarsi che 1 pozzetto contenga solo terreni e nessuna cella per consentire la modellazione matematica (pozzetto senza cellule) e che l'intera piastra venga seminata entro 30 s.
  4. Avvio dell'esperimento
    1. Fissare con cautela la piastra all'adattatore nell'incubatrice spostando verso l'esterno le clip rosse su entrambi i lati dell'adattatore della piastra. Allineare il pozzetto A1 della piastra con la regione A1 dell'adattatore. Tenere delicatamente la piastra in posizione con una mano sulla parte superiore e riposizionare le clip rosse con l'altra mano.
      NOTA: Assicurarsi che la piastra sia stabile nell'adattatore.
    2. Chiudere l'incubatrice e premere nuovamente Setup . Cerca i pozzetti verdi nella mappa delle piastre che indicano i pozzetti rilevati correttamente. Tutti i pozzetti che mostrano il rosso hanno un errore di connessione. Per risolvere questo problema, riattaccare rapidamente la piastra,
      NOTA: Il tempo eccessivo speso a cercare di riparare pozzetti con connessioni scadenti può compromettere la salute delle celle.
    3. Premere Check per ricontrollare gli allegati come letture di impedenza assoluta. L'operazione richiederà diversi minuti.
    4. Premere la freccia sotto la mappa delle lastre per assicurarsi che sia selezionato il catalogo delle lastre corretto. In questo caso, è 96w20idf.
    5. Premere il pulsante multifrequenza per assicurarsi che l'impedenza venga misurata a più frequenze CA per consentire la modellazione matematica futura.
    6. Premere Start per iniziare l'esperimento. Lasciare che le celle proliferino per ~48 ore e formino il loro tipico monostrato di alta resistenza, misurata da un aumento degli ohm.
  5. Trattamento delle cellule endoteliali cerebrali con cellule tumorali o citochine sulla piastra a 96 pozzetti
    NOTA: Poiché la piastra a 96 pozzetti consente di eseguire test simultanei di più stimoli, preparare una mappa chiara della piastra con le opzioni di trattamento desiderate (Figura supplementare S1-in basso). Ogni trattamento può e deve essere condotto almeno in triplice copia (tre pozzetti replicati) per consentire analisi statistiche; Tuttavia, quattro repliche sono mostrate in Figura supplementare S1.
    1. A 48 ore, controllare la crescita delle cellule endoteliali cerebrali. Assicurarsi che venga raggiunto un plateau prima di preparare le soluzioni di trattamento.
      NOTA: Diverse linee cellulari endoteliali possono impiegare tempi diversi per raggiungere un plateau. Pertanto, la loro fase di crescita e la densità di semina devono essere ottimizzate prima di condurre questo esperimento. I pozzi dovrebbero in genere stabilizzarsi entro la stessa ora. In caso contrario, potrebbero essere compromessi o pipettati in modo impreciso e non devono essere inclusi.
    2. Per il trattamento con citochine, preparare concentrazioni appropriate delle citochine in terreni completi preriscaldati insieme ai relativi veicoli e controlli dei terreni.
      1. Preparare le citochine a 2 volte la concentrazione finale desiderata poiché verranno diluite 1:1 quando aggiunte a ciascun pozzetto contenente cellule endoteliali cerebrali.
      2. Per consentire a ciascun trattamento di essere condotto in triplicato, preparare tutte le citochine in oltre 300 μL di volume totale (cioè almeno 350 μL totali), per l'aggiunta del trattamento di 100 μL per pozzetto.
    3. Per il trattamento con le cellule, prelevare le cellule (tre diverse linee cellulari di melanoma derivate da pazienti utilizzate in questo protocollo) con un reagente di dissociazione delicato ed eseguire una conta cellulare accurata. Eseguire trattamenti basati su cellule con rapporti effettore/bersaglio (rapporti E:T) superiori di 1:1, dove le cellule di trattamento sono le cellule effettrici (ad esempio, le cellule del melanoma) e le cellule endoteliali cerebrali sono le cellule bersaglio, ovvero aggiungere 20.000 cellule di melanoma a 20.000 cellule endoteliali cerebrali per pozzetto.
      1. Diluire in serie per rapporti E:T più piccoli di 1:10 o 1:100 dove richiesto. Per consentire il trattamento in pozzetti triplicati, contare le cellule e prepararle in oltre 300 μL di volume totale (cioè almeno 350 μL totali) per l'aggiunta di 100 μL per pozzetto.
    4. Etichettare le provette cluster in polipropilene da 1,1 mL, disponibili in formato strip da 8 provette (cioè provette strip da 1 mL), secondo la mappa delle piastre a 96 pozzetti (Figura supplementare S1-Top). Inserire i tubi di striscia nelle piastre di tubi di striscia e sterilizzarli in autoclave prima dell'esperimento. Aggiungere il volume totale di citochine o cellule di trattamento (cioè 350 μL di trattamento) alle provette sterili e lasciarle nell'incubatore per mantenerle calde.
    5. Sul software, premere Pausa per mettere in pausa l'esperimento. Il completamento dell'operazione potrebbe richiedere alcuni secondi. Una volta messa in pausa, aprire l'incubatrice e sganciare con cautela entrambe le clip rosse con una mano mentre si stabilizza la piastra con l'altra mano. Tenere l'esperimento in pausa e portare la piastra sulla cappa sterile.
    6. Rimuovere i tubi della striscia di trattamento dall'incubatrice. Utilizzando una pipetta multicanale, risospendere con cura il contenuto delle provette della striscia di trattamento e quindi aggiungere 100 μl di trattamento dalle provette della striscia ai pozzetti corretti sulla piastra a 96 pozzetti senza toccare il fondo del pozzetto. Aggiungere con cautela il trattamento a tutti i pozzetti e ai terreni solo al pozzetto privo di cellule e completare questo passaggio in meno di 5 minuti per una piastra completa da 96 pozzetti, poiché un raffreddamento eccessivo influirà sulla resistenza del monostrato endoteliale.
    7. Rimettere la piastra trattata nella macchina, fissarla come fatto in precedenza, quindi controllare nuovamente i collegamenti degli elettrodi all'adattatore premendo Setup | Dai un'occhiata.
    8. Assicurarsi che siano selezionate le impostazioni corrette del catalogo delle lastre e dell'acquisizione multifrequenza e premere Riprendi per riprendere l'esperimento. Consentire l'avanzamento dell'esperimento ed eseguirlo fino al punto finale desiderato.
    9. Premere Fine per completare l'esperimento, che salva automaticamente il file abp registrato. Passare a File | Esporta dati per recuperare questo file come xls. o csv. per ulteriori analisi.

2. Utilizzo di cellZscope per monitorare i cambiamenti nell'integrità della barriera endoteliale cerebrale in risposta a vari trattamenti

  1. Preparazione dei componenti metallici dell'apparato, dell'adattatore e dell'inserto a membrana porosa
    1. Pulire i componenti metallici in sequenza con acqua deionizzata, quindi etanolo al 70% e infine nuovamente acqua deionizzata.
    2. Autoclavare l'elettrodo inferiore o "pentole" e gli elettrodi di immersione superiori e sterilizzare tutti gli altri componenti del modulo cella con etanolo al 70%.
    3. In una cappa sterile, installare tutti i 24 elettrodi/"vasi" inferiori avvitandoli nel modulo cella, facendo attenzione a mantenere la sterilità per tutto il tempo.
    4. Aggiungere 900 μl di terreno di base ai pozzetti.
      NOTA: Il terreno di base viene aggiunto al pozzetto inferiore, che funge da compartimento basale dell'endotelio. Si raccomanda di non utilizzare il siero in questo compartimento per replicare in modo più affidabile l'ambiente basale dell'endotelio cerebrale.
    5. Collegare magneticamente gli elettrodi a immersione al coperchio del modulo cella e chiudere il coperchio sopra i pozzetti in modo che gli elettrodi a immersione si inseriscano nei contenitori inferiori degli elettrodi.
    6. Collegare il modulo cella all'adattatore in un'incubatrice e lasciarlo per almeno 1 ora per equilibrare. A questo punto, aprire il software per caricare la mappa sperimentale della piastra nella scheda Layout , incorporando così la mappa della piastra di trattamento nei file, che alla fine conterranno i dati.
    7. Se è richiesto il rivestimento, rivestire gli inserti della membrana in una cappa sterile utilizzando una piastra di coltura sterile a 24 pozzetti per trattenere gli inserti e aggiungendo il substrato ECM (ad es. collagene) alla sezione interna del pozzetto, come descritto nella sezione 1.2.3 Utilizzare una pipetta monocanale per caricare con cura il substrato ECM in ciascun pozzetto.
  2. Preparazione delle cellule endoteliali cerebrali per la semina sull'inserto della membrana e avvio dell'esperimento
    1. Raccogliere e contare le cellule endoteliali cerebrali come indicato nella sezione 1.3, ma preparare la titolazione cellulare finale richiesta in una provetta da centrifuga da 50 mL. Assicurarsi che le cellule raccolte siano in un terreno caldo e completo, compresi tutti i fattori di crescita e il siero necessari.
    2. Utilizzando una pipetta a canale singolo, seminare con cura le cellule endoteliali cerebrali (80.000 in questo protocollo) nella camera apicale di un pozzetto inserito in 350 μL di terreno completo.
    3. Includere un pozzetto privo di cellule pipettando il terreno completo solo in uno degli inserti.
    4. Rimuovere il modulo cella dall'incubatrice e posizionarlo nella cappa sterile. Trasferire gli inserti preparati nei vasi degli elettrodi inferiori utilizzando un paio di pinzette per maneggiare solo i supporti superiori dell'inserto. Evitare la formazione di bolle sotto la membrana.
    5. Riposizionare il modulo cella nell'incubatrice sopra l'adattatore.
    6. Nel software, nella scheda dell'esperimento , nella sezione Spectrum , selezionare Start a 1 Hz e Stop a 100 kHz per acquisire dati su tutta la gamma di frequenze; Seleziona Passaggi fini .
    7. In Tempo di attesa, selezionare 15 minuti per consentire misurazioni continue alla velocità massima condotta dal software.
    8. Premere Start per iniziare l'esperimento e consentire alle cellule endoteliali cerebrali di proliferare e formare un monostrato ad alta resistenza. Questo passaggio dura circa 48 ore.
  3. Trattamento delle cellule endoteliali cerebrali con cellule tumorali e citochine sugli inserti della membrana
    1. A 48 ore, preparare le citochine o le cellule di trattamento (ad es. cellule di melanoma) come indicato nella sezione 1.5, compresa l'esecuzione della conta cellulare, ove applicabile, e raccogliere in provette da 1 mL o equivalente.
    2. Preparare il trattamento alle concentrazioni corrette per l'aggiunta di 70 μl a ciascun pozzetto (inserto). Metti i trattamenti nell'incubatrice per tenerli al caldo.
    3. Poiché lo strumento in questo articolo esegue misurazioni ogni 15 minuti, scegliere un tempo di trattamento che inizi immediatamente dopo il completamento di una misurazione. A questo punto, rimuovere il modulo cella dall'incubatrice e pulirlo delicatamente con etanolo al 70% utilizzando salviette prive di lanugine.
    4. In una cappa sterile, aprire il modulo cellulare e pipettare con cura 70 μl di trattamento nella camera apicale del rispettivo inserto. A tale scopo, utilizzare una pipetta monocanale e aggiungere con un movimento circolare, evitando la formazione di bolle. Completare questo passaggio in meno di 10 minuti per rimettere il modulo cella nell'adattatore prima dell'inizio della misurazione successiva.
    5. Premere Stop per terminare l'esperimento. Esporta i dati direttamente in un xls. nella casella File | Assegna un nome e salva questo file in modo appropriato dopo averlo aperto.

Risultati

Interpretazione dei dati di impedenza ECIS

Comprendere le condizioni sperimentali ottimali
Qui i dati possono essere visualizzati direttamente utilizzando il software (Figura 2A) o esportati per l'analisi e la rappresentazione grafica (Figura 2B). La Figura 2A mostra un esempio di dati visualizzati sull'interfaccia software effettiva. Il grafico a sinistra mostr...

Discussione

Gli studi terapeutici sulle malattie che colpiscono la BBB devono considerare l'importanza dell'integrità e della regolazione della barriera endoteliale cerebrale. Ad esempio, la rottura della barriera endoteliale cerebrale è studiata in modo critico nelle metastasi del cancro al cervello da altri siti anatomici. Questo perché l'endotelio cerebrale costituisce la prima barriera contro le cellule tumorali circolanti. Come accennato in precedenza nell'introduzione, gli studi in vitro sull'integrità della barri...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Riconoscimenti

Akshata Anchan è stato finanziato dalla Neurological Foundation of New Zealand per la borsa di studio Gillespie (riferimento sovvenzione: 1628-GS) e la First Fellowship (riferimento sovvenzione: 2021 FFE). Il costo della ricerca è stato anche parzialmente finanziato dalla Neurological Foundation Fellowship-2021 FFE e dal Fondo per lo sviluppo della ricerca della facoltà dell'Università di Auckland. James Hucklesby è stato finanziato da una borsa di studio della Auckland Medical Research Foundation. Grazie al team di Baguley e all'Auckland Cancer Society Research Centre per le linee cellulari NZM del melanoma neozelandese derivate da pazienti.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
aMEMGibco12561072Melanoma cell base media
cellZscope arraynanoAnalyticscellZscope2; software v4.3.1TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tailGibcoA1048301ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMPSigma-AldrichD0627Brain endothelial media supplement
ECIS array Applied BiophysicsECIS ZΘ; software v1.2.163.0Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate Applied Biophysics96W20idf 96-well biosensor plate
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Brain endothelial media supplement
hCMVECApplied Biological MaterialsT0259Brain endothelial cell line
hEGFPeproTechPTAF10015100Brain endothelial media supplement
HeparinSigma-AldrichH-3393Brain endothelial media supplement
hFGFPeproTechPTAF10018B50Brain endothelial media supplement
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Brain endothelial media supplement
IL-1βPeproTech200-01BCytokine
Insulin-Transferrin-Sodium SeleniteSigma-Aldrich11074547001Melanoma cell media supplement
M199Gibco11150-067Brain endothelial cell base media
MilliQ waterDeionized water
PBS 1xGibco10010-023
TNFαPeproTech300-01ACytokine
Transwell insertCorningCLS3464Porous membrane insert
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Dissociation reagent

Riferimenti

  1. Fidler, I. J., Schackert, G., Zhang, R. D., Radinsky, R., Fujimaki, T. The biology of melanoma brain metastasis. Cancer Metastasis Reviews. 18 (3), 387-400 (1999).
  2. Tomlinson, E. Theory and practice of site-specific drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 1 (2), 87-198 (1987).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Neuwelt, E., et al. Strategies to advance translational research into brain barriers. The Lancet. Neurology. 7 (1), 84-96 (2008).
  5. Stolp, H. B., Dziegielewska, K. M. Review: Role of developmental inflammation and blood-brain barrier dysfunction in neurodevelopmental and neurodegenerative diseases. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (2), 132-146 (2009).
  6. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: Beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  7. Kacem, K., Lacombe, P., Seylaz, J., Bonvento, G. Structural organization of the perivascular astrocyte endfeet and their relationship with the endothelial glucose transporter: A confocal microscopy study. Glia. 23 (1), 1-10 (1998).
  8. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  9. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the cns are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science. 239 (4837), 290-292 (1988).
  10. Smith, J. A., Das, A., Ray, S. K., Banik, N. L. Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases. Brain Research Bulletin. 87 (1), 10-20 (2012).
  11. Denes, A., et al. Proliferating resident microglia after focal cerebral ischaemia in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (12), 1941-1953 (2007).
  12. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Celular andl Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
  13. Felgenhauer, K. The blood-brain barrier redefined. Journal of Neurology. 233 (4), 193-194 (1986).
  14. Scheinberg, L. C., Edelman, F. L., Levy, W. A. Is the brain "an immunologically privileged site"?I. Studies based on intracerebral tumor homotransplantation and isotransplantation to sensitized hosts. Archives of Neurology. 11, 248-264 (1964).
  15. Carbonell, W. S., Ansorge, O., Sibson, N., Muschel, R. The vascular basement membrane as "soil" in brain metastasis. PLoS One. 4 (6), e5857 (2009).
  16. Nag, S. Morphology and molecular properties of cellular components of normal cerebral vessels. Methods in Molecular Medicine. 89, 3-36 (2003).
  17. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 71 (1), 113-128 (2011).
  18. Bauer, H. C., et al. New aspects of the molecular constituents of tissue barriers. Journal of Neural Transmission (Vienna). 118 (1), 7-21 (2011).
  19. Balda, M. S., Matter, K. Tight junctions as regulators of tissue remodelling. Current Opinion in Cell Biology. 42, 94-101 (2016).
  20. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
  21. Van Itallie, C. M., Tietgens, A. J., Anderson, J. M. Visualizing the dynamic coupling of claudin strands to the actin cytoskeleton through zo-1. Molecular Biology of the Cell. 28 (4), 524-534 (2017).
  22. Takeichi, M. Historical review of the discovery of cadherin, in memory of tokindo okada. Development, Growth & Differentiation. 60 (1), 3-13 (2018).
  23. Vincent, P. A., Xiao, K., Buckley, K. M., Kowalczyk, A. P. Ve-cadherin: Adhesion at arm's length. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286 (5), C987-C997 (2004).
  24. Brasch, J., et al. Structure and binding mechanism of vascular endothelial cadherin: A divergent classical cadherin. Journal of Molecular Biology. 408 (1), 57-73 (2011).
  25. Gavard, J., Patel, V., Gutkind, J. S. Angiopoietin-1 prevents vegf-induced endothelial permeability by sequestering src through mdia. Developmental Cell. 14 (1), 25-36 (2008).
  26. Romero, I. A., et al. Changes in cytoskeletal and tight junctional proteins correlate with decreased permeability induced by dexamethasone in cultured rat brain endothelial cells. Neuroscience Letters. 344 (2), 112-116 (2003).
  27. Aragon-Sanabria, V., et al. Ve-cadherin disassembly and cell contractility in the endothelium are necessary for barrier disruption induced by tumor cells. Scientific Reports. 7, 45835 (2017).
  28. Angelini, D. J., et al. Tnf-alpha increases tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and opens the paracellular pathway through fyn activation in human lung endothelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (6), L1232-L1245 (2006).
  29. Nwariaku, F. E., et al. Tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and the regulation of microvascular permeability. Surgery. 132 (2), 180-185 (2002).
  30. Orsenigo, F., et al. Phosphorylation of ve-cadherin is modulated by haemodynamic forces and contributes to the regulation of vascular permeability in vivo. Nature Communications. 3, 1208 (2012).
  31. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  32. Chen, Z., Tzima, E. Pecam-1 is necessary for flow-induced vascular remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1067-1073 (2009).
  33. Privratsky, J. R., Newman, P. J. Pecam-1: Regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  34. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: Targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 315 (3), C343-C356 (2018).
  35. Bernardo-Castro, S., et al. Pathophysiology of blood-brain barrier permeability throughout the different stages of ischemic stroke and its implication on hemorrhagic transformation and recovery. Frontiers in Neurology. 11, 594672 (2020).
  36. Wilhelm, I., Molnár, J., Fazakas, C., Haskó, J., Krizbai, I. A. Role of the blood-brain barrier in the formation of brain metastases. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1383-1411 (2013).
  37. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier". Frontiers in Neuroscience. 17, 1047778 (2023).
  38. Abate-Daga, D., Ramello, M. C., Smalley, I., Forsyth, P. A., Smalley, K. S. M. The biology and therapeutic management of melanoma brain metastases. Biochemistry & Pharmacology. 153, 35-45 (2018).
  39. Anchan, A., et al. Real-time measurement of melanoma cell-mediated human brain endothelial barrier disruption using electric cell-substrate impedance sensing technology. Biosensors (Basel). 9 (2), (2019).
  40. Anchan, A., et al. Analysis of melanoma secretome for factors that directly disrupt the barrier integrity of brain endothelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8193 (2020).
  41. Hucklesby, J. J. W., et al. Comparison of leading biosensor technologies to detect changes in human endothelial barrier properties in response to pro-inflammatory tnfα and il1β in real-time. Biosensors (Basel). 11 (5), 159 (2021).
  42. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (17), 7896 (1991).
  43. Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of gpcr-mediated changes in endothelial barrier function: Overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 467 (10), 2193-2218 (2015).
  44. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -. J. Impedance-based cell monitoring: Barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 5 (2013).
  45. Anchan, A., Finlay, G., Angel, C. E., Hucklesby, J. J. W., Graham, S. E. Melanoma mediated disruption of brain endothelial barrier integrity is not prevented by the inhibition of matrix metalloproteinases and proteases. Biosensors (Basel). 12 (8), 660 (2022).
  46. Robilliard, L. D., et al. The importance of multifrequency impedance sensing of endothelial barrier formation using ecis technology for the generation of a strong and durable paracellular barrier. Biosensors. 8 (3), 64 (2018).
  47. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. The Journal of Clinical Investigation. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  48. Qi, J., Chen, N., Wang, J., Siu, C. H. Transendothelial migration of melanoma cells involves n-cadherin-mediated adhesion and activation of the beta-catenin signaling pathway. Molecular Biology of the Cell. 16 (9), 4386-4397 (2005).
  49. Brayton, J., Qing, Z., Hart, M. N., Vangilder, J. C., Fabry, Z. Influence of adhesion molecule expression by human brain microvessel endothelium on cancer cell adhesion. Journal of Neuroimmunology. 89 (1-2), 104-112 (1998).
  50. Soto, M. S., Serres, S., Anthony, D. C., Sibson, N. R. Functional role of endothelial adhesion molecules in the early stages of brain metastasis. Neuro-oncology. 16 (4), 540-551 (2014).
  51. García-Martín, A. B., et al. Vla-4 mediated adhesion of melanoma cells on the blood-brain barrier is the critical cue for melanoma cell intercalation and barrier disruption. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (10), 1995-2010 (2018).
  52. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  53. Stone, N. L., England, T. J., O'sulli, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
  54. . Abstracts from the international symposium "signal transduction at the blood-brain barriers" 2022. Fluids and Barriers of the CNS. 20 (1), 26 (2023).
  55. Srinivasan, B., et al. Teer measurement techniques for in vitro barrier model systems. SLAS Technology. 20 (2), 107-126 (2015).

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