Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada empedans tabanlı biyosensörleri kullanma tekniğini gösteriyoruz: beyin endotel bariyer gücünü ölçmek için ECIS ve cellZscope. Beyin endotelinin in vitro modeline çeşitli uyaranlar eklemenin hazırlanmasını ve tekniğini detaylandırıyoruz. Bulguları ölçüyor, kaydediyor ve temsili bir analiz yapıyoruz.

Özet

Kan-beyin bariyeri (BBB), beyin parankimini kandaki zararlı patojenlere karşı korur. BBB, perisitler, astrositik ayak süreçleri ve sıkıca yapışmış endotel hücrelerinden oluşan nörovasküler üniteden oluşur. Burada, beyin endotel hücreleri kan yoluyla bulaşan patojenlere karşı ilk bariyer hattını oluşturur. Kanser ve nöroinflamasyon gibi durumlarda, kandaki dolaşım faktörleri bu bariyeri bozabilir. Hastalığın ilerlemesi, beynin bölgelerine erişime veya bu bölgelerin bozulmasına izin veren bariyer bozulması sonrası önemli ölçüde kötüleşir. Bu, özellikle beyin düzeyinde mevcut olan sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle prognozları önemli ölçüde kötüleştirir. Bu nedenle, ortaya çıkan çalışmalar, kandaki bu zararlı faktörlerin beyin endotel hücreleri ile etkileşime girmesini önleyebilecek potansiyel terapötikleri araştırmayı amaçlamaktadır.

Ticari olarak temin edilebilen Elektrik Hücresi-Substrat Empedans Algılama (ECIS) ve cellZscope cihazları, bariyer güçlerini belirlemek için BBB endotel gibi hücresel tek tabakalar boyunca empedansı ölçer. Burada, çeşitli uyaranların eklenmesi üzerine beyin endotel bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesinde her iki biyosensörün kullanımını detaylandırıyoruz. En önemlisi, birden fazla değişkenin ve biyolojik arıtmanın eşzamanlı olarak araştırılması için yüksek verimli yeteneklerinin önemini vurguluyoruz.

Giriş

Bu makale, mikrovasküler hücrelerin değerlendirilmesindeki güncel eğilimleri tartışmaktadır. Serebral mikrovasküler endotel hücrelerinin bariyer özelliklerini ölçmek için ticari olarak mevcut iki platformun kullanımını özellikle detaylandırıyoruz. Endotel hücreleri, damar duvarını kaplayan kana bakan hücrelerdir. Bununla birlikte, serebral mikro damarlar, koruyucu kan-beyin bariyerini (BBB) oluşturmaya yardımcı oldukları için benzersizdir1,2,3. BBB, moleküllerin kandan beyne taşınmasını düzenlemek için işlev görür. Merkezi sinir sistemini (CNS) etkileyen periferik hastalıklar genellikle BBB 4,5'in fonksiyonel başarısızlığı ile bağlantılıdır. BBB'yi oluşturan anatomik yapılar, vücudun başka bir yerindeki kan-doku arayüzünde bulunmaz6. Bu anatomik yapılar, beyin endotel hücrelerine yakın bulunan ve çoğalmalarını ve geçirgenliklerini düzenleyen perisitleri içerir; besin karıştırma ve anatomik destek ile ilgili olan astrositik ayak süreçleri 7,8; Beyindeki yerleşik makrofajlar olan mikroglia, genellikle nöroinflamasyon ve iskemi 9,10,11,12 ve fenestrasyonlar olmadan sıkıca yapışmış hücrelerden oluşan bir tek tabaka oluşturan beyin endotelyumu 13,14. Beyin endoteli tipik olarak 'beyin endotel bariyeri' olarak bilinir ve beş farklı şekilde yapısal ve fonksiyonel bir bariyer oluşturur. İlk olarak, paraselüler bariyer bileşeni, lateral hücre-hücre bağlantılarında yapışma ile oluşturulur. İkincisi, transselüler bariyer bileşeni, endositozun düzenlenmesiyle sürdürülür. Üçüncüsü, özel bir bazal membran, büyük ölçüde kollajen15,16 içeren zengin bir hücre dışı matris aracılığıyla endotelyumu sabitler ve destekler. Son iki mekanizma, sırasıyla ilaçların metabolizmasını ve büyük moleküllerin alımını düzenlemeye yardımcı olan enzimler ve taşıyıcılar aracılığıyladır17.

Paraselüler etkileşimler, zar proteinleri claudins, okkludin ve eklem adezyon moleküllerini (JAM'ler) içeren sıkı bağlantılar (TJ'ler) tarafından kolaylaştırılan beyin endotel bariyerinin ana bileşenini oluşturur18. Membran proteinlerinin güçlü homotipik bağlanması ilk yapısal bariyeri oluşturur, ancak JAM'ler ayrıca aksesuar proteinler zonula okcludens'e bağlanır, böylece TJ'leri aktin hücre iskeletine19,20 bağlar. Aktin bağlantıları, TJ'leri endotel21'in apikal bölgesine yerleştirir, bu da endotel hücrelerini bu apikal veya "kanla yüz yüze" tarafta yapısal bariyer oluşturmak için işlevsel olarak polarize eder. Endotelin bazolateral bölgesinde, oldukça özelleşmiş adherens bağlantıları (AJ'ler) hücre morfolojisinin korunmasında düzenleyici bir rol oynar. AJ'ler, komşu endotel hücrelerinin hücre iskeletini katenin ailesi kompleksi20,22 aracılığıyla birbirine bağlayan kalsiyuma bağımlı kaderinleri içerir. Vasküler endotelyal kaderin (VE-Cadherin), endotelyal tek tabaka bütünlüğünü korumak için TJ proteinlerinin ekspresyonunu ve genel endotel bariyeri fonksiyonunu düzenleyen böyle bir kaderindir 23,24,25,26,27. Tümör nekroz faktörü-alfa (TNFa) gibi inflamatuar modülatörler, VE-kaderin içselleştirilmesini hücre bağlantılarından uzaklaştırarak endotel bariyerinin 28,29,30 dengesizleşmesine yol açar. Trombosit endotel hücre adezyon molekülü (PECAM)31, endotel bağlantılarını32,33 stabilize eden ve yeniden şekillendiren başka bir AJ kaderindir. Bu bağlantı proteinlerinin yoğunluğu, endotel hücreleri arasındaki paraselüler boşluktan elektron akışını kısıtlar. Bu özellik, beyin endotelyumu gibi birleşik hücre tek katmanları boyunca endotel bariyer kuvvetini veya trans-endotelyal elektrik direncini (TER) ölçmek için kullanılır.

Terapötik çalışmalar, kan-beyin arayüzündeki hayati rolü nedeniyle beyin endotelyumuna odaklanmaktadır. Multipl skleroz, felç, nörodejeneratif hastalıklar ve kanser gibi nöroinflamatuar durumlar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar beyin endotelini olumsuz etkiler 34,35,36,37. Beyin endotel bariyeri bozulduğunda, beyin kandaki zararlı uyaranlara etkili bir şekilde maruz kaldığından hastalığın ilerlemesi önemli ölçüde kötüleşir38. Daha önce inflamatuar mediatörlerin ve metastatik melanom hücrelerinin, endotel bariyer gücünü ölçen iki teknoloji kullanarak beyin endotel bariyerini bozduğunu göstermiştik 39,40,41.

Elektrik hücresi-substrat empedans algılama (ECIS), endotel hücre bariyeri bütünlüğünün gerçek zamanlı ve etiketsiz değerlendirmesine izin veren empedans tabanlı bir biyosensördür. Burada, tahlil kuyuları, tahlil sistemine alternatif akım (AC) getiren altın kaplama elektrotlarla kaplanmıştır. Beyin endotel hücreleri bu kuyucuklara ekilir, bu da AC'nin hücreler aracılığıyla uygulanabileceği anlamına gelir. (Şekil 1A-kuyu; yandan görünüm). Bu, empedansı hesaplamak için kullanılan elektrik devresini kurar (Şekil 1A-devre şeması). Beyin endotel hücreleri plakaya yapıştığında ve paraselüler bağlantılarını oluşturmaya başladığında empedans artar. Endotel hücreleri birleştiğinde, tek tabaka oluşturduğunda ve akım akışını kısıtladığında empedans platoları oluşur. AC'nin farklı frekanslarda uygulanması, endotel hücrelerinden geçen akım akış yolunu etkiler. Akım, daha yüksek bir frekansta (>10,4 Hz) uygulandığında endotel hücre gövdesinden akar. Bu, hücre bağlanmasını ve yayılmasını değerlendirmek için kullanılan hücre tek tabakasının kapasitansı hakkında bilgi sağlar. Düşük frekanslarda (102-10 4 Hz) membran empedansı yüksektir ve hücrelerden akım akışını kısıtlar. Bu durumda, akımın çoğunluğu hücreler arasında dolaşır. Yaklaşık 4.000 Hz'de, akım akışına karşı direnç, çoğunlukla hücreler arası boşluk yoluyla endotel hücre-hücre bağlantılarına atfedilir. Bu nedenle, bu frekansta dirençteki herhangi bir değişiklik, endotel bariyer bütünlüğü hakkında bilgi sağlar.

Ham empedans ölçümleri bariyer özellikleri hakkında bilgi sağlayabilirken, ECIS yazılımı daha sonra birden fazla AC frekansında ölçülen toplam direnci matematiksel olarak modelleyebilir ve daha kesin bir şekilde bariyer bütünlüğünün iki temel parametresine ayırabilir. Bu parametreler, komşu hücrelerin lateral zarları arasındaki parasellüler dirençtir (direnç beta-Rb; paraselüler bariyer; Şekil 1A-yeşil oklar) ve bazal hücre tabakası ile elektrot arasındaki bazolateral direnç (direnç alfa-Alfa; bazolateral bariyer; Şekil 1A-mavi oklar). Modellenen üçüncü bir parametre de hücre zarı kapasitansı (Cm; Şekil 1A-kırmızı oklar). CM, hücre zarı bileşiminin göstergesi olan hücrelerden geçen akımın kapasitif akışını gösterir. Burada, Rb veya parasellüler bariyerdeki değişiklikler, endotel bariyer bütünlüğünün korunmasında çok önemli olan TJ'ler ve AJ'lerdeki değişiklikleri gösterir. Rb'yi güvenilir bir şekilde yorumlamak için, Giaever ve Keese42 tarafından geliştirilen ve Stolwijk ve ark.43 tarafından eleştirel olarak tartışılan dört temel varsayım yapılmıştır. Bu varsayımlar, ECIS modellemesinin geçerliliğini sağlamak için önemli olsa da, birleşik bir endotelyal tek tabaka tarafından kolayca karşılanırlar.

ECIS gibi, cellZscope da endotel bariyer direncindeki değişikliklerin ölçülmesine izin verir; Bununla birlikte, hücreler gözenekli bir zar eki üzerinde kültürlenir. Bu sistemde, elektrik devresi bir membran ekinin her iki tarafındaki iki elektrot arasındadır. Endotelyal tek tabaka, trans-endotelyal elektrik direncinin (TER) ölçülmesine izin verecek şekilde bu membran ekinin üzerinde kültürlenir (Şekil 1B-kuyu; yandan görünüm). ECIS'te olduğu gibi, bu sistemde toplam empedans, uygulanan akımınfrekansına bağlı olarak birkaç bariyer bileşenine bağlanabilir 44. Düşük frekanslarda, elektrot kapasitansı (CEl) sistemin toplam empedansına hakimdir. Alternatif olarak, yüksek frekanslarda, ortamın direnci (Rortamı) toplam empedansa hakimdir. Bu nedenle, en kullanışlı ölçümler, endotel bariyerinin iki temel bileşeni hakkında bilgi sağlayan orta frekans aralığına (102-10 4 Hz) girer (Şekil 1B-devre şeması). İlk olarak, 103-10 4 Hz'de, hücre tabakası kapasitansı (CCl), membran direnci (Rzarı) ihmal edilecek kadar yüksek olduğundan ve akım ağırlıklı olarak kapasitör boyunca aktığından genel empedansa hakimdir. Bu nedenle, CCl , hücre zarı boyunca dirençteki değişiklikleri gösterir. Alternatif olarak, TER ağırlıklı olarak genel empedansı 102-10 3 Hz'de verir, burada akım akışı, bağlantı proteinleri tarafından bir arada tutulan komşu hücreler arasındaki bağlantı boşluklarından kanalize edilir. Bu nedenle, bu, daha önce ECIS'te Rb ile görüldüğü gibi, endotel bariyerinin parasellüler bileşeni hakkında bilgi sağlar.

Şekil 1C, beyin endotelinin belirli bölgelerinin melanom hücreleri ile tedavi ile nasıl bozulduğunu detaylandırmaktadır. Bu bozulma, biyosensörler tarafından paraselüler boşluktan geçen akım akışındaki bir değişiklikle (Rb veya TER olarak ölçülür) tespit edilir; bazolateral boşluk (Alfa olarak ölçülür); ve hücre zarı (C, m veya C, Cl olarak ölçülür). Sitokinler veya invaziv melanom hücreleri gibi çeşitli uyaranlarla tedaviyi takiben beyin endotel bariyeri değişimini ölçmek için bu girişte ayrıntıları verilen her iki biyosensörü de kullandık. Belirli bir uyaran endotel bariyerini bozarsa ölçülen direnç azalır ve akım akışına izin vermek için en az dirençli bir yol oluşturur. Bu nedenle, "bariyer direncindeki" bir azalma, bariyer bütünlüğünün kaybını veya beyin endotel bariyerinin bozulmasını gösterir. Bu tahlillerde, direnci ve modellenmiş parametreleri gerçek zamanlı olarak yorumlayarak bu bozulmayı inceledik. ECIS ve cellZscope'un bu tür araştırma sorularının ele alınmasındaki uygulamasıbaşka bir yerde detaylandırılmıştır 39,41,45,46.

İn vitro araştırmalar, hastalığı ilerleten molekülleri ve fonksiyonel yolları ortaya çıkararak önemli hastalık mekanizmalarının keşfedilmesini sağlar. Bununla birlikte, bu, işleyen bir vücuttan önemli ölçüde farklı olan in vitro olarak hastalığın güvenilir bir şekilde tekrarlanmasını gerektirir. İdeal bir senaryoda, in vitro araştırma tekrarlanabilir, non-invaziv, etiketsiz, nicel olmalı ve in vivo bulunan yapısal etkileri taklit etmelidir. Bu makalede, beyin endotel bariyeri bütünlüğünde tedaviye bağlı değişiklikleri ölçmek için bu iki rakip teknolojiyi kullanma metodolojisini detaylandırıyoruz. Engellerin bozulmasının daha kapsamlı bir resmini sağlamak için sonuçlarını birleştirmenin avantajlarını tartışıyor ve hala üstesinden gelinmesi gereken sınırlamaları paylaşıyoruz.

Protokol

1. Çeşitli tedavilere yanıt olarak beyin endotel bariyeri bütünlüğündeki değişiklikleri izlemek için ECIS'i kullanma

  1. Yazılımın, dizi istasyonunun ve makinenin kurulması
    1. 96 kuyulu dizi istasyonunu makineye bağlayın. Dizi istasyonunu plastik bir torbaya koyun ve ısınmasını sağlamak için testten en az 1 saat önce inkübatöre yerleştirin. Deneyden hemen önce plastik torbayı çıkarın.
    2. Hazır olduğunuzda, makineyi açın ve ilgili yazılımı bilgisayarda açın. Veri Topla sekmesi altındaki Kurulum düğmesine basın. Yazılım, bağlı adaptörün türünü (örneğin, 96 kuyulu dizi istasyonu) algılayacak ve gösterilen plaka haritasında kırmızı kuyuları gösterecek bir bağlantı kontrolünü tamamlayacaktır. Bu, yazılımın adaptörü algıladığını ancak takılı bir plakayı algılayamadığını belirtir. Sistem artık 96 oyuklu plaka için hazırdır.
  2. 96 oyuklu biyosensör plakasının hazırlanması
    NOT: 96 oyuklu plaka düzenlemesi kullanılmıştır. Her bir kuyucuğun tabanı, altın kaplama elektrotların iç içe geçen parmakları ile desenlenmiştir. Plakalar, yalnızca steril bir başlık/biyolojik güvenlik kabininde açılması gereken steril paketler halinde gelir. Altın elektrotlar, elektrot kapasitansını korumak için önce 10 mM sistein eklenerek kimyasal olarak stabilize edilmelidir.
    1. 10 mM sisteini steril bir olukta hazırlayın ve çok kanallı bir kanal kullanarak her bir oyuğa dikkatlice 100 μL pipetleyin. Sisteini oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve ardından elektrotun çizilmesini önlemek için sadece kuyu kenarlarından pipetleyerek dikkatlice aspire edin. Aynı pipetleme tekniğini kullanarak sisteini en az 2 kez steril deiyonize su (PBS değil) ile yıkayın.
      NOT: Plaka elektrotları, üreticinin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, sistein kaplama kullanmak yerine, ECIS aparatı üzerindeki sıcak ortam kullanılarak elektriksel olarak da stabilize edilebilir.
    2. ECM alt tabakasını kuyunun dibinde bir bazal membran görevi görecek şekilde hazırlayın.
      NOT: Kollajen veya laminin gibi ECM substratları, beyin endotel hücre hattının ihtiyacına bağlı olarak seçilebilir. Burada insan serebral mikrovasküler endotel hücre hattı (hCMVEC) için kollajen kullanıyoruz.
    3. Taze, steril bir olukta (oyuk başına 100 μL) 0.02 M asetik asit içinde çözülmüş 1 μg / cm2 sıçan kuyruğu kollajen I hazırlayın. Kolajeni steril başlıkta düşük ışıkta 1 saat bekletin, ardından 2 kez deiyonize su ve dikkatli pipetleme ile dikkatlice yıkayın.
      NOT: Son yıkamadan sonra deiyonize suyun mümkün olduğunca dikkatli bir şekilde çıkarıldığından emin olun ve plakayı davlumbazda kurumaya bırakın. Plakanın kaplamadan hemen sonra kullanılması tavsiye edilir; ancak geçici olarak (bir haftadan az) 4 °C'de suda saklanabilir. Plaka artık kullanıma hazırdır.
  3. Beyin endotel hücrelerinin 96 oyuklu biyosensör plakasına tohumlanmak üzere hazırlanması
    NOT: Öncelikle kullanılacak endotel hücre hattının büyüme fazının ve tohumlama yoğunluğunun optimize edilmesi önerilir. Bu protokolde, 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 20.000 hücrede tohumlamadan sonra birleşmeye ulaşması 48 saat süren hCMVEC hattı kullanıldı.
    1. Beyin endotel hücrelerini steril bir başlıkta nazik bir ayrışma reaktifi kullanarak toplayın ve doğru bir hücre sayımı yapın. 48 saat boyunca sabit bir büyüme aşaması için oyuk başına 100 μL ortamda 20.000 hCMVEC kullanın. 96 kuyucuğun tümünün optimum pipetlenmesini sağlamak için fazla beyin endotel hücrelerini hazırlayın.
      NOT: Bu nedenle, 96 oyuklu bir plaka için, 10 mL önceden ısıtılmış ortamda yaklaşık 2.000.000 hücreye ihtiyaç vardır.
    2. Beyin endotel hücrelerini taze bir steril oluğa aktarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak, oyuk başına dikkatlice 100 μL (20.000 hücre) hücre süspansiyonu ekleyin. Endotel hücrelerinin zamanla çökelmesini önlemek için hücreleri düzenli olarak olukta nazikçe yeniden askıya alın. 1 kuyunun yalnızca ortama sahip olduğundan ve matematiksel modellemeye izin verecek hücre olmadığından (hücresiz kuyu) ve tüm plakanın 30 saniye içinde tohumlandığından emin olun.
  4. Deneyi başlatma
    1. Plaka adaptörünün her iki yanındaki kırmızı klipsleri dışarı doğru hareket ettirerek plakayı inkübatördeki adaptöre dikkatlice takın. Plakanın A1 kuyusunu adaptörün A1 bölgesi ile hizalayın. Plakayı bir elinizle nazikçe yerinde tutun ve diğer elinizle kırmızı klipsleri tekrar yerine oturtun.
      NOT: Plakanın adaptörde sabit olduğundan emin olun.
    2. İnkübatörü kapatın ve tekrar Kurulum'a basın. Doğru tespit edilen kuyuları gösteren plaka haritasında yeşil kuyuları arayın. Kırmızı gösteren tüm kuyularda bağlantı hatası vardır. Bunu düzeltmek için plakayı hızlı bir şekilde yeniden takın,
      NOT: Zayıf bağlantılara sahip kuyuları tamir etmeye çalışmak için harcanan aşırı zaman hücre sağlığını tehlikeye atabilir.
    3. Ataşmanları mutlak empedans okumaları olarak yeniden kontrol etmek için Kontrol Et'e basın. Bu birkaç dakika sürecektir.
    4. Doğru plaka kataloğunun seçildiğinden emin olmak için plaka haritasının altındaki oka basın. Bu durumda, 96w20idf'dir.
    5. Gelecekteki matematiksel modellemeye izin vermek için empedansın birden fazla AC frekansında ölçüldüğünden emin olmak için çoklu frekans düğmesine basın.
    6. Deneyi başlatmak için Başlat'a basın. Hücrelerin ~ 48 saat boyunca çoğalmasına ve ohm'daki bir artışla ölçüldüğü gibi tipik yüksek dirençli tek tabakalarını oluşturmasına izin verin.
  5. Beyin endotel hücrelerinin 96 oyuklu plaka üzerinde kanser hücreleri veya sitokinlerle tedavi edilmesi
    NOT: 96 oyuklu plaka, birden fazla uyaranın aynı anda test edilmesine izin verdiğinden, istenen tedavi seçenekleriyle (Ek Şekil S1-alt). Her tedavi yapılabilir ve yapılmalıdır en az istatistiksel analizlere izin vermek için üç kopya halinde (üç kopya kuyu); Ancak, dört kopya şurada gösterilir: Ek Şekil S1.
    1. 48 saatte, beyin endotel hücrelerinin büyümesini kontrol edin. Tedavi solüsyonlarını hazırlamadan önce bir platoya ulaşıldığından emin olun.
      NOT: Farklı endotel hücre hatlarının bir platoya ulaşması farklı süreler alabilir. Bu nedenle, bu deney yapılmadan önce büyüme aşamaları ve tohumlama yoğunlukları optimize edilmelidir. Kuyular tipik olarak aynı saat içinde plato yapmalıdır. Aksi takdirde, tehlikeye girebilir veya yanlış bir şekilde pipetlenebilirler ve dahil edilmemelidirler.
    2. Sitokinlerle tedavi için, ilgili araç ve ortam kontrolleri ile birlikte önceden ısıtılmış tam ortamda uygun sitokin konsantrasyonlarını hazırlayın.
      1. Sitokinleri, beyin endotel hücreleri içeren her bir oyuğa eklendiğinde 1: 1 oranında seyreltileceğinden, istenen nihai konsantrasyonun 2 katında hazırlayın.
      2. Her tedavinin üç kopya halinde yürütülmesine izin vermek için, tüm sitokinleri 300 μL'den fazla toplam hacimde (ör., en az 350 μL), kuyucuk başına 100 μL'lik tedavi ilavesi için.
    3. Hücrelerle tedavi için, hücreleri (bu protokolde kullanılan üç farklı hasta kaynaklı melanom hücre hattı) nazik bir ayrışma reaktifi ile toplayın ve doğru bir hücre sayımı yapın. Tedavi hücrelerinin efektör hücreler (örneğin, melanom hücreleri) ve beyin endotel hücrelerinin hedef hücreler olduğu, yani 20.000 beyin endotel hücresine 20.000 melanom hücresi eklediği 1: 1'lik en üst efektör: hedef oranlarında (E: T oranları) hücre bazlı tedaviler gerçekleştirin.
      1. Gerektiğinde 1:10 veya 1:100'lük daha küçük E:T oranları için seri olarak seyreltin. Üçlü kuyucuklarda tedaviye izin vermek için, hücreleri sayın ve bunları 300 μL'den fazla toplam hacimde (yani en az 350 μL'de) kuyucuk başına 100 μL'lik tedavi ilavesi için hazırlayın.
    4. 8 tüplü şerit formatında (yani 1 mL şerit tüpleri) gelen 1.1 mL polipropilen küme tüplerini 96 oyuklu plaka haritasına göre etiketleyin (Ek Şekil S1-Top). Şerit tüplerini şerit tüp plakalarına yerleştirin ve deneyden önce otoklavlayın. Tedavi sitokinlerinin veya hücrelerinin toplam hacmini (ör. tam 350 μL tedavi) steril şerit tüplerine ekleyin ve sıcak tutmak için inkübatörde bırakın.
    5. Yazılımda, deneyi duraklatmak için Duraklat'a basın. Bu işlemin tamamlanması birkaç saniye sürebilir. Duraklatıldıktan sonra, inkübatörü açın ve bir elinizle plakayı sabitlerken diğer elinizle her iki kırmızı klipsi dikkatlice açın. Deneyi duraklatın ve plakayı steril davlumbazın üzerine getirin.
    6. Tedavi şeridi tüplerini inkübatörden çıkarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, tedavi şeridi tüplerinin içeriğini dikkatlice yeniden süspanse edin ve ardından kuyu dibine dokunmadan şerit tüplerinden 96 oyuklu plaka üzerindeki doğru kuyucuklara 100 μL işlem ekleyin. Tüm oyuklara ve ortamlara sadece hücresiz kuyuya dikkatlice tedavi ekleyin ve aşırı soğutma endotel tek tabakasının direncini etkileyeceğinden, bu adımı tam 96 oyuklu bir plaka için 5 dakikadan kısa sürede tamamlayın.
    7. İşlem görmüş plakayı makineye geri koyun, daha önce yapıldığı gibi takın ve ardından Ayarlar | Kontrol.
    8. Doğru plaka kataloğunun ve çok frekanslı alım ayarlarının seçildiğinden emin olun ve deneye devam etmek için Sürdür'e basın. Denemenin ilerlemesine izin verin ve istenen uç noktaya kadar çalıştırın.
    9. Kaydedilen abp dosyasını otomatik olarak kaydeden deneyi tamamlamak için Finish (Son ) tuşuna basın. Dosya | Bu dosyayı xls olarak almak için Verileri Dışa Aktar. veya csv. daha fazla analiz için dosya.

2. Çeşitli tedavilere yanıt olarak beyin endotel bariyeri bütünlüğündeki değişiklikleri izlemek için cellZscope'u kullanma

  1. Aparatın metal bileşenlerinin, adaptörünün ve gözenekli membran ekinin hazırlanması
    1. Metal bileşenleri sırayla deiyonize su, ardından %70 etanol ve ardından tekrar deiyonize su ile temizleyin.
    2. Alt elektrodu veya "saksıları" ve üst daldırma elektrotlarını otoklavlayın ve Hücre Modülünün diğer tüm bileşenlerini %70 etanol ile sterilize edin.
    3. Steril bir başlıkta, 24 alt elektrotun/"kabın" tümünü, baştan sona steriliteyi korumaya özen göstererek, Hücre Modülüne vidalayarak takın.
    4. Kuyucuklara 900 μL baz ortam ekleyin.
      NOT: Baz ortamı, endotelin bazal bölmesi olarak işlev gören alt kuyucuğa eklenir. Beyin endotelinin bazal ortamını daha güvenilir bir şekilde çoğaltmak için bu bölmede serum kullanılmaması önerilir.
    5. Daldırma elektrotlarını manyetik olarak Hücre Modülü kapağına bağlayın ve daldırma elektrotlarının alt elektrot kaplarına girmesi için kuyuların üzerindeki kapağı kapatın.
    6. Hücre Modülünü bir inkübatördeki adaptöre takın ve dengelenmesi için en az 1 saat bekletin. Bu aşamada, Yerleşim sekmesi altında deney plakası haritasını yüklemek için yazılımı açın, böylece tedavi plakası haritasını, sonuçta verileri içerecek olan dosyalara gömün.
    7. Kaplamanın gerekli olduğu durumlarda, ekleri tutmak için steril bir 24 oyuklu kültür plakası kullanarak ve bölüm 1.2.3'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ECM alt tabakasını (örn. kollajen) kuyunun iç kısmına ekleyerek membran eklerini steril bir başlıkta kaplayın. ECM alt tabakasını her bir kuyucuğa dikkatlice yüklemek için tek kanallı bir pipet kullanın.
  2. Beyin endotel hücrelerinin membran ekine tohumlanmak üzere hazırlanması ve deneyin başlatılması
    1. Beyin endotel hücrelerini bölüm 1.3'e göre toplayın ve sayın, ancak gerekli son hücre titrasyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde hazırlayın. Hasat edilen hücrelerin, gerekli tüm büyüme faktörleri ve serum dahil olmak üzere sıcak tam ortamda olduğundan emin olun.
    2. Tek kanallı bir pipet kullanarak, beyin endotel hücrelerini (bu protokolde 80.000) 350 μL tam ortamda bir kuyu ekinin apikal odasına dikkatlice tohumlayın.
    3. Komple medyayı eklerden yalnızca birine pipetleyerek hücresiz bir kuyu ekleyin.
    4. Hücre Modülünü kuvözden çıkarın ve steril davlumbazın içine yerleştirin. Hazırlanan ekleri, ekin yalnızca üst desteklerini tutmak için bir cımbız kullanarak alt elektrot kaplarına aktarın. Zarın altında kabarcık oluşmasını önleyin.
    5. Hücre Modülünü adaptörün üzerinden inkübatöre geri yerleştirin.
    6. Yazılımda, deney sekmesinde, Spektrum bölümünün altında, tüm frekans aralığında veri almak için 1 Hz'de Başlat ve 100 kHz'de Durdur'u seçin; İnce adımlar'ı seçin.
    7. Bekleme süresi'nin altında, yazılım tarafından gerçekleştirilen en hızlı hızda sürekli ölçümlere izin vermek için 15 dakika'yı seçin.
    8. Deneye başlamak ve beyin endotel hücrelerinin çoğalmasına ve yüksek dirençli bir tek tabaka oluşturmasına izin vermek için Başlat'a basın. Bu adım yaklaşık 48 saat sürer.
  3. Beyin endotel hücrelerinin kanser hücreleri ve zar ekleri üzerindeki sitokinlerle tedavi edilmesi
    1. 48 saatte, tedavi sitokinlerini veya hücrelerini (ör., melanom hücreleri), uygun olduğunda hücre sayımlarının yapılması da dahil olmak üzere, bölüm 1.5'e göre hazırlayın ve 1 mL şerit tüplerde veya eşdeğerinde toplayın.
    2. Her kuyucuğa 70 μL eklemek için doğru konsantrasyonlarda işlem hazırlayın (ekleyin). Sıcak tutmak için tedavileri kuluçka makinesine yerleştirin.
    3. Buradaki cihaz her 15 dakikada bir ölçüm yaptığından, ölçüm tamamlandıktan hemen sonra başlayan bir tedavi süresi seçin. Bu sırada, Hücre Modülünü inkübatörden çıkarın ve tüy bırakmayan mendiller kullanarak %70 etanol ile nazikçe silin.
    4. Steril bir başlıkta, Hücre Modülünü açın ve tedavinin 70 μL'sini ilgili ekin apikal odasına dikkatlice pipetleyin. Bunu tek kanallı bir pipet kullanarak yapın ve kabarcıklardan kaçınarak dairesel hareketlerle ekleyin. Bir sonraki ölçüm başlamadan önce Hücre Modülünü adaptöre geri döndürmek için bu adımı 10 dakikadan kısa sürede tamamlayın.
    5. Denemeyi sonlandırmak için Durdur'a basın. Verileri doğrudan bir xls'ye aktarın. Dosya altındaki dosya | Dışa Aktar Sekmesi. Bu dosyayı açtıktan sonra uygun şekilde adlandırın ve kaydedin.

Sonuçlar

ECIS empedans verilerinin yorumlanması

Optimal deney koşullarını anlama
Burada, veriler yazılım kullanılarak doğrudan görüntülenebilir (Şekil 2A) veya analiz ve grafik çizimi için dışa aktarılabilir (Şekil 2B). Şekil 2A , gerçek yazılım arayüzünde görüntülenen verilerin bir örneğini göstermektedir. Soldaki grafik, 96 oyuklu biyosens...

Tartışmalar

BBB'yi etkileyen hastalıklar üzerine yapılan terapötik çalışmalar, beyin endotel bariyer bütünlüğünün ve regülasyonunun önemini göz önünde bulundurmalıdır. Örneğin, kanserin diğer anatomik bölgelerden beyne metastaz yapmasında beyin endotel bariyerinin bozulması kritik olarak araştırılmaktadır. Bunun nedeni, beyin endotelinin dolaşımdaki tümör hücrelerine karşı ilk bariyeri oluşturmasıdır. Giriş bölümünde daha önce de belirtildiği gibi, endotel bariyer bütünlüğü ile ilgi...

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Akshata Anchan, Yeni Zelanda Nöroloji Vakfı tarafından Gillespie Bursu (hibe referansı: 1628-GS) ve İlk Burs (hibe referansı: 2021 FFE) için finanse edildi. Araştırma maliyeti ayrıca kısmen Nöroloji Vakfı Bursu-2021 FFE ve Auckland Üniversitesi Fakülte Araştırma Geliştirme Fonu tarafından finanse edildi. James Hucklesby, Auckland Tıbbi Araştırma Vakfı'ndan bir bursla finanse edildi. Baguley ekibine ve Auckland Kanser Derneği Araştırma Merkezi'ne hasta kaynaklı Yeni Zelanda Melanom NZM hücre hatları için teşekkürler.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
aMEMGibco12561072Melanoma cell base media
cellZscope arraynanoAnalyticscellZscope2; software v4.3.1TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tailGibcoA1048301ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMPSigma-AldrichD0627Brain endothelial media supplement
ECIS array Applied BiophysicsECIS ZΘ; software v1.2.163.0Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate Applied Biophysics96W20idf 96-well biosensor plate
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Brain endothelial media supplement
hCMVECApplied Biological MaterialsT0259Brain endothelial cell line
hEGFPeproTechPTAF10015100Brain endothelial media supplement
HeparinSigma-AldrichH-3393Brain endothelial media supplement
hFGFPeproTechPTAF10018B50Brain endothelial media supplement
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Brain endothelial media supplement
IL-1βPeproTech200-01BCytokine
Insulin-Transferrin-Sodium SeleniteSigma-Aldrich11074547001Melanoma cell media supplement
M199Gibco11150-067Brain endothelial cell base media
MilliQ waterDeionized water
PBS 1xGibco10010-023
TNFαPeproTech300-01ACytokine
Transwell insertCorningCLS3464Porous membrane insert
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Dissociation reagent

Referanslar

  1. Fidler, I. J., Schackert, G., Zhang, R. D., Radinsky, R., Fujimaki, T. The biology of melanoma brain metastasis. Cancer Metastasis Reviews. 18 (3), 387-400 (1999).
  2. Tomlinson, E. Theory and practice of site-specific drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 1 (2), 87-198 (1987).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Neuwelt, E., et al. Strategies to advance translational research into brain barriers. The Lancet. Neurology. 7 (1), 84-96 (2008).
  5. Stolp, H. B., Dziegielewska, K. M. Review: Role of developmental inflammation and blood-brain barrier dysfunction in neurodevelopmental and neurodegenerative diseases. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (2), 132-146 (2009).
  6. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: Beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  7. Kacem, K., Lacombe, P., Seylaz, J., Bonvento, G. Structural organization of the perivascular astrocyte endfeet and their relationship with the endothelial glucose transporter: A confocal microscopy study. Glia. 23 (1), 1-10 (1998).
  8. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  9. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the cns are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science. 239 (4837), 290-292 (1988).
  10. Smith, J. A., Das, A., Ray, S. K., Banik, N. L. Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases. Brain Research Bulletin. 87 (1), 10-20 (2012).
  11. Denes, A., et al. Proliferating resident microglia after focal cerebral ischaemia in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (12), 1941-1953 (2007).
  12. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Celular andl Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
  13. Felgenhauer, K. The blood-brain barrier redefined. Journal of Neurology. 233 (4), 193-194 (1986).
  14. Scheinberg, L. C., Edelman, F. L., Levy, W. A. Is the brain "an immunologically privileged site"?I. Studies based on intracerebral tumor homotransplantation and isotransplantation to sensitized hosts. Archives of Neurology. 11, 248-264 (1964).
  15. Carbonell, W. S., Ansorge, O., Sibson, N., Muschel, R. The vascular basement membrane as "soil" in brain metastasis. PLoS One. 4 (6), e5857 (2009).
  16. Nag, S. Morphology and molecular properties of cellular components of normal cerebral vessels. Methods in Molecular Medicine. 89, 3-36 (2003).
  17. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 71 (1), 113-128 (2011).
  18. Bauer, H. C., et al. New aspects of the molecular constituents of tissue barriers. Journal of Neural Transmission (Vienna). 118 (1), 7-21 (2011).
  19. Balda, M. S., Matter, K. Tight junctions as regulators of tissue remodelling. Current Opinion in Cell Biology. 42, 94-101 (2016).
  20. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
  21. Van Itallie, C. M., Tietgens, A. J., Anderson, J. M. Visualizing the dynamic coupling of claudin strands to the actin cytoskeleton through zo-1. Molecular Biology of the Cell. 28 (4), 524-534 (2017).
  22. Takeichi, M. Historical review of the discovery of cadherin, in memory of tokindo okada. Development, Growth & Differentiation. 60 (1), 3-13 (2018).
  23. Vincent, P. A., Xiao, K., Buckley, K. M., Kowalczyk, A. P. Ve-cadherin: Adhesion at arm's length. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286 (5), C987-C997 (2004).
  24. Brasch, J., et al. Structure and binding mechanism of vascular endothelial cadherin: A divergent classical cadherin. Journal of Molecular Biology. 408 (1), 57-73 (2011).
  25. Gavard, J., Patel, V., Gutkind, J. S. Angiopoietin-1 prevents vegf-induced endothelial permeability by sequestering src through mdia. Developmental Cell. 14 (1), 25-36 (2008).
  26. Romero, I. A., et al. Changes in cytoskeletal and tight junctional proteins correlate with decreased permeability induced by dexamethasone in cultured rat brain endothelial cells. Neuroscience Letters. 344 (2), 112-116 (2003).
  27. Aragon-Sanabria, V., et al. Ve-cadherin disassembly and cell contractility in the endothelium are necessary for barrier disruption induced by tumor cells. Scientific Reports. 7, 45835 (2017).
  28. Angelini, D. J., et al. Tnf-alpha increases tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and opens the paracellular pathway through fyn activation in human lung endothelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (6), L1232-L1245 (2006).
  29. Nwariaku, F. E., et al. Tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and the regulation of microvascular permeability. Surgery. 132 (2), 180-185 (2002).
  30. Orsenigo, F., et al. Phosphorylation of ve-cadherin is modulated by haemodynamic forces and contributes to the regulation of vascular permeability in vivo. Nature Communications. 3, 1208 (2012).
  31. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  32. Chen, Z., Tzima, E. Pecam-1 is necessary for flow-induced vascular remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1067-1073 (2009).
  33. Privratsky, J. R., Newman, P. J. Pecam-1: Regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  34. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: Targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 315 (3), C343-C356 (2018).
  35. Bernardo-Castro, S., et al. Pathophysiology of blood-brain barrier permeability throughout the different stages of ischemic stroke and its implication on hemorrhagic transformation and recovery. Frontiers in Neurology. 11, 594672 (2020).
  36. Wilhelm, I., Molnár, J., Fazakas, C., Haskó, J., Krizbai, I. A. Role of the blood-brain barrier in the formation of brain metastases. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1383-1411 (2013).
  37. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier". Frontiers in Neuroscience. 17, 1047778 (2023).
  38. Abate-Daga, D., Ramello, M. C., Smalley, I., Forsyth, P. A., Smalley, K. S. M. The biology and therapeutic management of melanoma brain metastases. Biochemistry & Pharmacology. 153, 35-45 (2018).
  39. Anchan, A., et al. Real-time measurement of melanoma cell-mediated human brain endothelial barrier disruption using electric cell-substrate impedance sensing technology. Biosensors (Basel). 9 (2), (2019).
  40. Anchan, A., et al. Analysis of melanoma secretome for factors that directly disrupt the barrier integrity of brain endothelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8193 (2020).
  41. Hucklesby, J. J. W., et al. Comparison of leading biosensor technologies to detect changes in human endothelial barrier properties in response to pro-inflammatory tnfα and il1β in real-time. Biosensors (Basel). 11 (5), 159 (2021).
  42. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (17), 7896 (1991).
  43. Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of gpcr-mediated changes in endothelial barrier function: Overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 467 (10), 2193-2218 (2015).
  44. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -. J. Impedance-based cell monitoring: Barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 5 (2013).
  45. Anchan, A., Finlay, G., Angel, C. E., Hucklesby, J. J. W., Graham, S. E. Melanoma mediated disruption of brain endothelial barrier integrity is not prevented by the inhibition of matrix metalloproteinases and proteases. Biosensors (Basel). 12 (8), 660 (2022).
  46. Robilliard, L. D., et al. The importance of multifrequency impedance sensing of endothelial barrier formation using ecis technology for the generation of a strong and durable paracellular barrier. Biosensors. 8 (3), 64 (2018).
  47. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. The Journal of Clinical Investigation. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  48. Qi, J., Chen, N., Wang, J., Siu, C. H. Transendothelial migration of melanoma cells involves n-cadherin-mediated adhesion and activation of the beta-catenin signaling pathway. Molecular Biology of the Cell. 16 (9), 4386-4397 (2005).
  49. Brayton, J., Qing, Z., Hart, M. N., Vangilder, J. C., Fabry, Z. Influence of adhesion molecule expression by human brain microvessel endothelium on cancer cell adhesion. Journal of Neuroimmunology. 89 (1-2), 104-112 (1998).
  50. Soto, M. S., Serres, S., Anthony, D. C., Sibson, N. R. Functional role of endothelial adhesion molecules in the early stages of brain metastasis. Neuro-oncology. 16 (4), 540-551 (2014).
  51. García-Martín, A. B., et al. Vla-4 mediated adhesion of melanoma cells on the blood-brain barrier is the critical cue for melanoma cell intercalation and barrier disruption. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (10), 1995-2010 (2018).
  52. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  53. Stone, N. L., England, T. J., O'sulli, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
  54. . Abstracts from the international symposium "signal transduction at the blood-brain barriers" 2022. Fluids and Barriers of the CNS. 20 (1), 26 (2023).
  55. Srinivasan, B., et al. Teer measurement techniques for in vitro barrier model systems. SLAS Technology. 20 (2), 107-126 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar kelime ler Kan beyin BariyeriBBBEndotel H creleriN rovask ler nitePerisitlerAstrositlerKanserN roinflamasyonSitokinlerEmpedans Tabanl Biyosens rlerECISCellZscopeBariyer B t nlY ksek VerimliH cresel Tek Tabaka

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır