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요약

여기에서는 뇌 내피 장벽 강도를 측정하기 위해 임피던스 기반 바이오센서인 ECIS 및 cellZscope를 사용하는 기술을 보여줍니다. 우리는 뇌 내피의 체외 모델에 다양한 자극을 추가하는 준비 및 기술에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 결과를 측정, 기록 및 대표 분석을 제공합니다.

초록

혈액-뇌 장벽(BBB)은 혈액 속의 해로운 병원체로부터 뇌 실질을 보호합니다. BBB는 pericyte, astrocytic foot process 및 단단히 부착 된 내피 세포로 구성된 신경 혈관 단위로 구성됩니다. 여기서 뇌 내피 세포는 혈액 매개 병원체에 대한 첫 번째 장벽을 형성합니다. 암 및 신경 염증과 같은 상태에서는 혈액 내 순환 인자가 이 장벽을 파괴할 수 있습니다. 질병의 진행은 뇌 영역에 대한 접근을 허용하거나 손상을 허용하는 장벽 파괴 후 크게 악화됩니다. 이는 특히 뇌 수준에서 사용할 수 있는 제한된 치료 옵션으로 인해 예후를 크게 악화시킵니다. 따라서 새로운 연구는 혈액 속의 이러한 해로운 요인이 뇌 내피 세포와 상호 작용하는 것을 방지할 수 있는 잠재적인 치료법을 조사하는 것을 목표로 합니다.

상용 ECIS(Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) 및 cellZscope 기기는 BBB 내피와 같은 세포 단층의 임피던스를 측정하여 장벽 강도를 측정합니다. 여기에서 우리는 다양한 자극의 추가에 대한 뇌 내피 장벽 무결성을 평가하기 위해 두 바이오센서의 사용에 대해 자세히 설명합니다. 결정적으로, 우리는 여러 변수와 생물학적 처리의 동시 조사를 위한 고처리량 능력의 중요성을 강조합니다.

서문

이 기사에서는 미세혈관 세포 평가의 현재 동향에 대해 설명합니다. 우리는 특히 대뇌 미세혈관 내피 세포의 장벽 특성을 측정하기 위해 상업적으로 이용 가능한 두 가지 플랫폼의 사용에 대해 자세히 설명합니다. 내피 세포는 혈관 벽을 둘러싸고 있는 혈액을 마주하는 세포입니다. 그러나 대뇌 미세혈관은 보호하는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 형성하는 데 도움이 된다는 점에서 독특합니다1,2,3. BBB는 혈액에서 뇌로 분자가 이동하는 것을 조절하는 기능을 합니다. 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 말초 질환은 일반적으로 BBB 4,5의 기능 부전과 관련이 있습니다. BBB를 형성하는 해부학적 구조는 신체의 다른 곳의 혈액-조직 계면에 존재하지 않는다6. 이러한 해부학적 구조는 뇌 내피 세포에 가까운 주위 세포로 구성되며 증식과 투과성을 조절합니다. 영양 셔플링 및 해부학적 지원에 관여하는 성상세포발 돌기 7,8; 종종 신경 염증 및 허혈증과 관련이 있는 뇌의 상주 대식세포인 미세아교세포(microglia) 9,10,11,12와 창구 없이 단단히 부착된 세포의 단층을 형성하는 뇌 내피(brain endothelium) 13,14. 뇌 내피는 일반적으로 '뇌 내피 장벽'으로 알려져 있으며 다섯 가지 방식으로 구조적, 기능적 장벽을 형성합니다. 첫째, paracellular barrier 구성 요소는 lateral cell-cell junctions에서의 접착에 의해 형성됩니다. 둘째, transcellular barrier 구성 요소는 endocytosis를 조절함으로써 유지됩니다. 셋째, 전문화된 기저막은 주로 콜라겐15,16으로 구성된 풍부한 세포외 기질을 통해 내피를 고정하고 지지합니다. 마지막 두 가지 메커니즘은 약물의 대사와 큰 분자의 흡수를 조절하는 데 도움이 되는 효소와 수송체를 통해 이루어집니다각각 17.

세포주위 상호작용은 뇌내피장벽의 주요 구성 요소를 형성하며, 막단백질인 클라우딘(claudins), 오클루딘(occludin) 및 접합접착분자(junctional adhesion molecules, JAM)로 구성된 긴밀한 접합(TJ)에 의해 촉진됩니다18. 막 단백질의 강력한 동형 결합은 첫 번째 구조적 장벽을 형성하지만, JAM은 부속 단백질 zonula occludens에도 연결되어 TJ를 액틴 세포골격19,20에 연결합니다. 액틴 연결은 TJ를 내피21의 정점 영역에 배치하며, 이는 내피 세포를 기능적으로 분극화하여 이 정점 또는 "혈액을 향한" 쪽에 구조적 장벽을 형성합니다. 내피의 기저외측 영역에서는 고도로 전문화된 부착 접합부(AJ)가 세포 형태를 유지하는 데 조절 역할을 합니다. AJ는 칼슘 의존성 cadherins로 구성되며, 이는 catenin family complex20,22를 통해 이웃 내피 세포의 세포 골격을 연결합니다. 혈관 내피 렌즈 카데린(VE-Cadherin)은 TJ 단백질의 발현과 전반적인 내피 장벽 기능을 조절하여 내피 단층 무결성 23,24,25,26,27을 유지하는 그러한 cadherin 중 하나입니다. 종양괴사인자-알파(TNFα)와 같은 염증 조절인자는 세포 접합부에서 VE-cadherin 내재화 신호를 보내 내피 장벽(28,29,30)의 불안정화를 유도합니다. 혈소판 내피 세포 접착 분자 (PECAM) 31은 내피 접합부(32,33)를 안정화하고 리모델링하는 또 다른 AJ cadherin입니다. 이러한 접합 단백질의 밀도는 내피 세포 사이의 세포주위 공간을 통한 전자의 흐름을 제한합니다. 이 속성은 뇌 내피와 같은 융합 세포 단층에서 내피 장벽 강도 또는 경내피 전기 저항(TER)을 측정하는 데 사용됩니다.

치료 연구는 혈액-뇌 계면에서 중요한 역할을 하는 뇌 내피에 초점을 맞춥니다. 다발성 경화증, 뇌졸중, 신경 퇴행성 질환 및 암과 같은 신경 염증성 상태를 포함한 여러 질병이 뇌 내피에 부정적인 영향을 미칩니다 34,35,36,37. 일단 뇌 내피 장벽이 파괴되면, 뇌가 혈액 속의 해로운 자극에 효과적으로 노출됨에 따라 질병 진행이 현저히 악화된다38. 우리는 이전에 염증 매개체와 전이성 흑색종 세포가 내피 장벽 강도를 측정하는 두 가지 기술을 사용하여 뇌 내피 장벽을 파괴한다는 것을 보여주었습니다 39,40,41.

전기 세포 기판 임피던스 감지(ECIS)는 내피 세포 장벽 무결성에 대한 실시간 및 무표지 평가를 가능하게 하는 임피던스 기반 바이오센서입니다. 여기에서, 분석 웰은 금도금 전극으로 라이닝되어 있으며, 이는 분석 시스템에 교류(AC)를 도입합니다. 뇌 내피 세포는 이 웰에 파종되는데, 이는 AC가 세포를 통해 적용될 수 있음을 의미합니다. (그림 1A-웰; 측면 view). 이것은 임피던스를 계산하는 데 사용되는 전기 회로를 설정합니다(그림 1A 회로도). 임피던스는 뇌 내피 세포가 플레이트에 부착되어 세포 주위 접합부를 형성하기 시작할 때 증가합니다. 임피던스는 내피 세포가 합류하여 단층을 형성하고 전류 흐름을 제한할 때 정체됩니다. 다른 주파수에서 AC를 적용하면 내피 세포를 통한 전류 흐름 경로에 영향을 미칩니다. 전류는 더 높은 주파수(>10,4Hz )로 적용될 때 내피 세포체를 통해 흐릅니다. 이는 세포 부착 및 확산을 평가하는 데 사용되는 세포 단층의 커패시턴스에 대한 정보를 제공합니다. 저주파(102-10 4Hz )에서는 멤브레인 임피던스가 높아 셀을 통한 전류 흐름을 제한합니다. 이 경우 대부분의 전류는 셀 사이를 이동합니다. 약 4,000Hz에서 전류 흐름에 대한 저항은 주로 세포 간 공간을 통한 내피 세포-세포 접합부에 기인합니다. 따라서 이 주파수에서 저항의 변화는 내피 장벽 무결성에 관한 정보를 제공합니다.

원시 임피던스 측정은 장벽 속성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, ECIS 소프트웨어는 여러 AC 주파수에서 측정된 총 저항을 수학적으로 모델링하고 보다 정확하게는 장벽 무결성의 두 가지 주요 매개변수로 분리할 수 있습니다. 이러한 매개변수는 인접 세포의 외측막 사이의 세포주위 저항성(resistance beta-Rb; paracellular barrier; 그림 1A-녹색 화살표), 기저 세포층과 전극 사이의 기저측 저항(저항 알파-알파; 기저외측 장벽; 그림 1A-파란색 화살표). 세 번째 모델링된 매개변수는 또한 세포막 커패시턴스(C, m; 그림 1A-빨간색 화살표). CM 은 세포를 통과하는 전류의 용량성 흐름을 표시하며, 이는 세포막 구성을 나타냅니다. 여기서, Rb 또는 paracellular barrier의 변화는 TJ 및 AJs의 변화를 나타내며, 이는 내피 장벽 무결성을 유지하는 데 중요합니다. Rb를 신뢰성 있게 해석하기 위해 Giaever와 Keese(42 )가 개발하고 Stolwijk et al.43이 비판적으로 논의한 바와 같이 네 가지 주요 가정이 이루어집니다. 이러한 가정은 ECIS 모델링의 타당성을 보장하는 데 중요하지만, 합류하는 내피 단층에 의해 쉽게 충족됩니다.

ECIS와 마찬가지로 cellZscope를 사용하면 내피 장벽 저항의 변화를 측정할 수 있습니다. 그러나 세포는 다공성 멤브레인 삽입부에서 배양됩니다. 이 시스템에서 전기 회로는 멤브레인 인서트의 양쪽에 있는 두 전극 사이에 있습니다. 내피 단층은 이 멤브레인 삽입물 위에 배양되어 경향 내피 전기 저항(TER)을 측정할 수 있습니다(그림 1B-well, 측면도). ECIS와 마찬가지로, 이 시스템에서, 총 임피던스는 인가된 전류의 주파수에 따라 여러 배리어 구성 요소에 기인할 수 있다(44). 저주파에서 전극 커패시턴스(CEL)는 시스템의 총 임피던스를 지배합니다. 대안적으로, 고주파에서 매체 (R매체)의 저항이 총 임피던스를 지배합니다. 따라서 가장 유용한 측정은 내피 장벽의 두 가지 주요 구성 요소에 대한 정보를 제공하는 중간 주파수 범위(10 2-104Hz)에 속합니다(그림 1B 회로도). 첫째, 103-10 4Hz에서 멤브레인 저항(R멤브레인)이 무시할 수 있을 만큼 높고 전류가 주로 커패시터를 가로질러 흐르기 때문에 셀층 커패시턴스(Cl)가 전체 임피던스를 지배합니다. 따라서 C, Cl은 세포막을 통한 저항성의 변화를 나타냅니다. 또는 TER은 주로 10 2-103Hz에서 전체 임피던스를 부여하며, 여기서 전류 흐름은 접합 단백질에 의해 함께 유지되는 인접 세포 사이의 접합 공간을 통해 전달됩니다. 따라서 이는 이전에 ECIS의 Rb에서 보았던 바와 같이 내피 장벽의 준세포 구성 요소에 대한 정보를 제공합니다.

그림 1C는 뇌 내피의 특정 영역이 흑색종 세포 치료에 의해 어떻게 파괴되는지 자세히 보여줍니다. 이러한 파괴는 파라 세포 공간 (Rb 또는 TER로 측정됨)을 통한 전류 흐름의 변화에 의해 바이오 센서에 의해 감지됩니다. 기저외측 공간(알파로 측정); 및 세포막(CM 또는 CL로 측정). 우리는 이 소개에서 자세히 설명한 두 가지 바이오센서를 사용하여 사이토카인 또는 침습성 흑색종 세포와 같은 다양한 자극으로 치료 후 뇌 내피 장벽 변화를 측정했습니다. 측정된 저항은 주어진 자극이 내피 장벽을 방해하면 감소하여 전류 흐름을 허용하기 위해 저항이 가장 적은 경로를 생성합니다. 따라서 "장벽 저항성"의 감소는 장벽 무결성의 상실 또는 뇌 내피 장벽 파괴를 암시합니다. 이 분석에서 우리는 저항과 모델링된 매개변수를 실시간으로 해석하여 이러한 중단을 연구했습니다. 이러한 연구 질문을 해결하기 위한 ECIS 및 cellZscope의 적용은 다른 곳에 자세히 설명되어 있습니다 39,41,45,46.

체외 연구는 질병을 진행시키는 분자와 기능적 경로를 밝혀 중요한 질병 메커니즘을 발견할 수 있도록 합니다. 그러나 이를 위해서는 체 외에서 질병을 신뢰할 수 있게 복제해야 하며, 이는 신체가 기능하는 것과는 크게 다릅니다. 이상적인 시나리오에서, in vitro 연구는 재현 가능하고, 비침습적이며, 라벨이 없고, 정량적이며, in vivo에서 발견되는 구조적 영향을 모방해야 합니다. 이 기사에서는 뇌 내피 장벽 무결성의 치료 유도 변화를 측정하기 위해 이 두 가지 경쟁 기술을 사용하는 방법론에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 장벽 붕괴에 대한 보다 포괄적인 그림을 제공하고 아직 극복해야 할 한계를 공유하기 위해 결과를 결합하는 이점에 대해 논의합니다.

프로토콜

1. ECIS 를 사용하여 다양한 치료에 대한 반응으로 뇌 내피 장벽 무결성의 변화를 모니터링합니다.

  1. 소프트웨어, 어레이 스테이션 및 기계 설정
    1. 96웰 어레이 스테이션을 기계에 연결합니다. 어레이 스테이션을 비닐 봉지에 넣고 분석하기 최소 1시간 전에 인큐베이터에 넣어 예열할 수 있도록 합니다. 실험 직전에 비닐 봉지를 제거하십시오.
    2. 준비가 되면 기기를 켜고 컴퓨터에서 해당 소프트웨어를 엽니다. Collect Data 탭 아래의 Setup 버튼을 누릅니다. 소프트웨어는 연결 검사를 완료하여 연결된 어댑터 유형(예: 96웰 어레이 스테이션)을 감지하고 표시된 플레이트 맵에 빨간색 웰을 표시합니다. 이것은 소프트웨어가 어댑터를 감지하지만 부착된 플레이트를 감지할 수 없음을 나타냅니다. 이제 시스템은 96웰 플레이트를 사용할 준비가 되었습니다.
  2. 96웰 바이오센서 플레이트 준비
    참고: 96웰 플레이트 배열이 사용됩니다. 각 웰의 바닥에는 금도금 전극의 손가락이 교차되어 있습니다. 플레이트는 멸균 후드/생물학적 안전 작업대에서만 열어야 하는 멸균 팩으로 제공됩니다. 금 전극은 전극 커패시턴스를 유지하기 위해 먼저 10mM 시스테인을 첨가하여 화학적으로 안정화되어야 합니다.
    1. 멸균 용기에서 10mM 시스테인을 준비하고 다중 채널을 사용하여 각 웰에 100μL를 조심스럽게 피펫팅합니다. 시스테인을 실온에서 15분 동안 배양한 다음 전극이 긁히지 않도록 웰 가장자리에서만 피펫팅하여 조심스럽게 흡입합니다. 동일한 피펫팅 기술을 사용하여 멸균 탈이온수(PBS 아님)로 시스테인을 최소 2회 씻어냅니다.
      알림: 플레이트 전극은 제조업체의 프로토콜에 자세히 설명된 대로 시스테인 코팅을 사용하는 대신 ECIS 장치의 따뜻한 매체를 사용하여 전기적으로 안정화할 수도 있습니다.
    2. 우물 바닥의 기저막 역할을 할 ECM 기판을 준비합니다.
      참고: 콜라겐 또는 라미닌과 같은 ECM 기질은 뇌 내피 세포주의 요구 사항에 따라 선택될 수 있습니다. 여기에서는 인간 대뇌 미세혈관 내피 세포주(hCMVEC)에 콜라겐을 사용합니다.
    3. 신선하고 멸균 된 물통 (웰 당 100 μL)에서 0.02M 아세트산에 용해 된 1 μg / cm2 쥐 꼬리 콜라겐을 준비합니다. 제균 후드에서 콜라겐을 저조도에서 1시간 동안 방치한 다음 탈이온수와 조심스럽게 피펫팅으로 2배 조심스럽게 세척합니다.
      알림: 마지막 세척 후 탈이온수를 최대한 조심스럽게 제거하고 플레이트를 후드에서 건조시키십시오. 코팅 직후에 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 4 °C의 물에 임시로 (일주일 미만) 보관할 수 있습니다. 이제 플레이트를 사용할 준비가 되었습니다.
  3. 96웰 바이오센서 플레이트에 파종하기 위한 뇌 내피 세포 준비
    NOTE: 먼저 사용할 내피 세포주의 성장 단계와 파종 밀도를 최적화하는 것이 좋습니다. hCMVEC 라인은 이 프로토콜에 사용되었으며, 96웰 플레이트에서 웰당 20,000개의 세포를 파종한 후 밀도에 도달하는 데 48시간이 걸립니다.
    1. 부드러운 해리 시약을 사용하여 멸균 후드에서 뇌 내피 세포를 수확하고 정확한 세포 수를 수행합니다. 웰당 100μL의 배지에 20,000hCMVEC를 사용하여 48시간 동안 안정적인 성장 단계를 수행합니다. 96개 웰 모두의 최적 피펫팅을 보장하기 위해 과도한 뇌 내피 세포를 준비합니다.
      참고: 따라서 96웰 플레이트의 경우 10mL의 예열된 배지에 약 2,000,000개의 세포가 필요합니다.
    2. 뇌 내피 세포를 새로운 멸균 트로프로 옮기고 다중 채널 피펫을 사용하여 웰당 100μL(20,000개 세포)의 세포 현탁액을 조심스럽게 추가합니다. 시간이 지남에 따라 내피 세포가 가라앉지 않도록 정기적으로 세포를 트로프에 부드럽게 재현탁시킵니다. 수학적 모델링(셀 없는 웰)을 허용하기 위해 1개의 웰에 매체만 있고 셀이 없는지 확인하고 전체 플레이트가 30초 이내에 파종되었는지 확인합니다.
  4. 실험 시작
    1. 플레이트 어댑터의 양쪽에 있는 빨간색 클립을 바깥쪽으로 움직여 플레이트를 인큐베이터의 어댑터에 조심스럽게 부착합니다. 플레이트의 A1 웰을 어댑터의 A1 영역에 맞춥니다. 한 손을 위에 올려 접시를 부드럽게 잡고 다른 손으로 빨간색 클립을 제자리에 다시 클릭합니다.
      알림: 플레이트가 어댑터에서 안정적인지 확인하십시오.
    2. 인큐베이터를 닫고 설정을 다시 누릅니다. 플레이트 맵에서 올바르게 감지된 웰을 나타내는 녹색 웰을 찾습니다. 빨간색으로 표시된 모든 웰에는 연결 오류가 있습니다. 이 문제를 해결하려면 플레이트를 빠르게 다시 부착하십시오.
      알림: 연결이 불량한 웰을 수리하는 데 과도한 시간을 소비하면 세포 건강을 손상시킬 수 있습니다.
    3. Check를 눌러 첨부 파일을 절대 임피던스 판독값으로 다시 확인합니다. 이 작업은 몇 분 정도 걸립니다.
    4. 플레이트 맵 아래의 화살표를 눌러 올바른 플레이트 카탈로그가 선택되었는지 확인합니다. 이 경우 96w20idf입니다.
    5. 다중 주파수 버튼을 눌러 임피던스가 여러 AC 주파수에서 측정되도록 하여 향후 수학적 모델링을 허용합니다.
    6. 시작을 눌러 실험을 시작합니다. 세포가 ~ 48 시간 동안 증식하고 옴 단위의 증가로 측정 된 높은 저항의 전형적인 단층을 형성하도록합니다.
  5. 96-well plate에서 암세포 또는 사이토카인으로 뇌내피세포를 치료합니다.
    참고: 96웰 플레이트는 여러 자극을 동시에 테스트할 수 있으므로 원하는 치료 옵션(보충 그림 S1-bottom)입니다. 각 치료는 수행할 수 있으며 수행해야 합니다 적어도 통계적 분석을 허용하기 위해 삼중(3개의 반복 우물)에서; 그러나 4개의 반복실험은 보충 그림 S1.
    1. 48 시간에서 뇌 내피 세포의 성장을 확인하십시오. 치료 용액을 준비하기 전에 정체기에 도달했는지 확인하십시오.
      참고: 내피 세포주마다 정체기에 도달하는 데 걸리는 시간이 다를 수 있습니다. 따라서 이 실험을 수행하기 전에 성장 단계와 파종 밀도를 최적화해야 합니다. 우물은 일반적으로 같은 시간 내에 안정되어야 합니다. 그렇지 않은 경우 손상되거나 부정확하게 피펫팅될 수 있으므로 포함해서는 안 됩니다.
    2. 사이토카인으로 처리하려면 관련 차량 및 배지 대조군과 함께 미리 따뜻해진 완전한 배지에 적절한 농도의 사이토카인을 준비합니다.
      1. 사이토카인은 뇌 내피 세포가 들어있는 각 웰에 추가될 때 1:1로 희석되므로 최종 원하는 농도의 2배로 준비합니다.
      2. 각 처리를 삼중으로 수행할 수 있도록 하려면 웰당 100μL의 처리 추가를 위해 총 부피가 300μL 이상(즉, 총 350μL 이상)인 모든 사이토카인을 준비합니다.
    3. 세포 치료를 위해 부드러운 해리 시약으로 세포(이 프로토콜에 사용된 3개의 다른 환자 유래 흑색종 세포주)를 수확하고 정확한 세포 수를 수행합니다. 치료 세포는 이펙터 세포(예: 흑색종 세포)이고 뇌 내피 세포는 표적 세포, 즉 웰당 20,000개의 뇌 내피 세포에 20,000개의 흑색종 세포를 추가하는 1:1의 최고 이펙터:목표 비율(E:T 비율)로 세포 기반 치료를 수행합니다.
      1. 필요한 경우 1:10 또는 1:100의 더 작은 E:T 비율을 위해 순차적으로 희석합니다. 삼중 웰에서 처리할 수 있도록 하려면 세포를 계수하고 웰당 100μL의 처리 추가를 위해 총 부피의 300μL 이상(즉, 총 350μL 이상)으로 준비합니다.
    4. 96-well plate map(Supplemental Figure S1-Top)에 따라 8-튜브 스트립 형식(즉, 1mL 스트립 튜브)으로 제공되는 1.1mL 폴리프로필렌 클러스터 튜브에 라벨을 부착합니다. 스트립 튜브를 스트립 튜브 플레이트에 삽입하고 실험 전에 고압멸균합니다. 처리 사이토카인 또는 세포의 총 부피(즉, 전체 처리량 350μL)를 멸균 스트립 튜브에 추가하고 인큐베이터에 넣어 따뜻하게 유지합니다.
    5. 소프트웨어에서 Pause(일시 중지 )를 눌러 실험을 일시 중지합니다. 완료하는 데 몇 초 정도 걸릴 수 있습니다. 일시 중지되면 인큐베이터를 열고 한 손으로 두 빨간색 클립을 조심스럽게 풀고 다른 손으로 플레이트를 고정합니다. 실험을 일시 중지 상태로 유지하고 플레이트를 멸균 후드로 가져옵니다.
    6. 인큐베이터에서 치료 스트립 튜브를 제거합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 트리트먼트 스트립 튜브의 내용물을 조심스럽게 재현탁한 다음 웰 바닥에 닿지 않고 스트립 튜브에서 96웰 플레이트의 올바른 웰로 100μL의 트리트먼트를 추가합니다. 모든 웰과 배지에 처리를 조심스럽게 추가하고 cell-free 웰에만 처리를 추가하고 과도한 냉각은 내피 단층의 저항에 영향을 미치므로 전체 96웰 플레이트의 경우 5분 이내에 이 단계를 완료합니다.
    7. 처리된 플레이트를 기기에 다시 넣고 이전과 같이 부착한 다음 설정 | 확인하다.
    8. 올바른 플레이트 카탈로그와 다중 주파수 수집 설정이 선택되었는지 확인하고 Resume 을 눌러 실험을 재개합니다. 실험이 진행될 수 있도록 허용하고 원하는 엔드포인트까지 실행합니다.
    9. Finish를 눌러 실험을 완료하면 기록된 abp. 파일이 자동으로 저장됩니다. File(파일) | 데이터를 내보내 이 파일을 xls로 검색합니다. 또는 csv. 추가 분석을 위한 파일.

2. cellZscope를 사용하여 다양한 치료에 대한 반응으로 뇌 내피 장벽 무결성의 변화를 모니터링합니다.

  1. 장치의 금속 부품, 어댑터 및 다공성 멤브레인 인서트 준비
    1. 탈이온수로 금속 부품을 순차적으로 청소한 다음 70% 에탄올로 청소한 다음 다시 탈이온수로 청소합니다.
    2. 하단 전극 또는 "포트"와 상단 침지 전극을 고압 멸균하고 셀 모듈의 다른 모든 구성 요소를 70% 에탄올로 멸균합니다.
    3. 멸균 후드에서 24개의 하단 전극/"포트"를 모두 셀 모듈에 나사로 고정하여 설치하고 전체적으로 멸균 상태를 유지하도록 주의합니다.
    4. 900μL의 기본 매체를 웰에 추가합니다.
      참고: 베이스 미디어는 내피의 기저 구획 역할을 하는 하단 웰에 추가됩니다. 뇌 내피의 기저 환경을 보다 확실하게 복제하기 위해 이 구획에 혈청을 사용하지 않는 것이 좋습니다.
    5. 디핑 전극을 셀 모듈 덮개에 자기적으로 연결하고 웰 위의 뚜껑을 닫아 디핑 전극이 하단 전극 포트에 끼워지도록 합니다.
    6. Cell Module을 인큐베이터의 어댑터에 부착하고 평형을 이룰 때까지 최소 1시간 동안 그대로 두십시오. 이 단계에서 소프트웨어를 열어 Layout 탭 아래에 실험용 플레이트 맵을 로드하면 처리 플레이트 맵이 파일에 포함되며, 이 파일에는 최종적으로 데이터가 포함됩니다.
    7. 코팅이 필요한 경우, 섹션 1.2.3에 설명된 대로 멸균 24웰 배양 플레이트를 사용하여 인서트를 고정하고 ECM 기질(예: 콜라겐)을 웰의 내부 섹션에 추가하여 멤브레인 후드에 멤브레인 인서트를 코팅합니다.
  2. 멤브레인 삽입물에 파종하기 위해 뇌 내피 세포를 준비하고 실험을 시작합니다.
    1. 섹션 1.3에 따라 뇌 내피 세포를 수확하고 계수하지만 50mL 원심분리 튜브에서 최종 필요한 세포 적정을 준비합니다. 채취한 세포가 필요한 모든 성장 인자와 혈청을 포함한 따뜻하고 완전한 배지에 있는지 확인합니다.
    2. 단일 채널 피펫을 사용하여 뇌 내피 세포(이 프로토콜에서는 80,000개)를 350μL의 완전한 배지에 삽입된 웰 인서트의 정점 챔버에 조심스럽게 파종합니다.
    3. 인서트 중 하나에만 완전한 배지를 피펫팅하여 cell-free well을 포함합니다.
    4. 인큐베이터에서 세포 모듈을 제거하고 멸균 후드에 넣습니다. 한 쌍의 핀셋을 사용하여 준비된 인서트를 하단 전극 포트에 옮기고 인서트의 상부 지지대만 처리합니다. 멤브레인 아래에 기포가 형성되지 않도록 하십시오.
    5. 셀 모듈을 어댑터 위의 인큐베이터에 다시 놓습니다.
    6. 소프트웨어의 실험 탭에 있는 스펙트럼 섹션에서 1Hz에서 시작 및 100kHz에서 중지 를 선택하여 전체 주파수 범위에 걸쳐 데이터를 수집합니다. 미세 단계를 선택합니다.
    7. 대기 시간에서 15분을 선택하여 소프트웨어가 수행하는 가장 빠른 속도로 연속 측정을 허용합니다.
    8. Start를 눌러 실험을 시작하고 뇌 내피 세포가 증식하여 저항성이 높은 단층을 형성할 수 있도록 합니다. 이 단계는 약 48시간이 걸립니다.
  3. 멤브레인 삽입물에 암세포와 사이토카인으로 뇌내피세포를 치료합니다.
    1. 48시간에서 해당되는 경우 세포 계수 수행을 포함하여 섹션 1.5에 따라 치료 사이토카인 또는 세포(예: 흑색종 세포)를 준비하고 1mL 스트립 튜브 또는 이에 상응하는 것으로 수집합니다.
    2. 각 웰(삽입물)에 70μL를 추가하기 위해 올바른 농도로 처리를 준비합니다. 인큐베이터에 트리트먼트를 넣어 따뜻하게 유지합니다.
    3. 본 기기는 15분마다 측정을 수행하므로 측정이 완료된 직후 시작되는 처리 시간을 선택하십시오. 이때 인큐베이터에서 Cell Module을 제거하고 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 70% 에탄올로 부드럽게 닦습니다.
    4. 멸균 후드에서 Cell Module을 열고 처리액 70μL를 각 인서트의 정점 챔버로 조심스럽게 피펫팅합니다. 단일 채널 피펫을 사용하여 이 작업을 수행하고 기포를 피하면서 원을 그리며 추가합니다. 다음 측정이 시작되기 전에 셀 모듈을 어댑터로 되돌리려면 10분 이내에 이 단계를 완료하십시오.
    5. 중지를 눌러 실험을 종료합니다. 데이터를 xls로 직접 내보냅니다. 파일 아래의 파일 | 내보내기 탭. 이 파일을 연 후 이름을 지정하고 적절하게 저장합니다.

결과

ECIS 임피던스 데이터 해석

최적의 실험 조건 이해
여기에서 소프트웨어는 데이터를 직접 보거나(그림 2A) 분석 및 그래프 플로팅을 위해 내보낼 수 있습니다(그림 2B). 그림 2A 는 실제 소프트웨어 인터페이스에 표시되는 데이터의 예를 보여줍니다. 왼쪽 그래프는 어레이 스테이...

토론

BBB에 영향을 미치는 질병에 대한 치료 연구는 뇌 내피 장벽의 무결성과 조절의 중요성을 고려해야 합니다. 예를 들어, 다른 해부학적 부위에서 뇌로 암이 전이되는 과정에서 뇌 내피 장벽 파괴가 비판적으로 조사되고 있습니다. 이는 뇌 내피가 순환하는 종양 세포에 대한 첫 번째 장벽을 형성하기 때문입니다. 소개에서 앞서 언급했듯이 내피 장벽 무결성에 대한 체외 연구는 재현 가능하고,...

공개

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

Akshata Anchan은 Gillespie Scholarship(보조금 참조: 1628-GS) 및 First Fellowship(보조금 참조: 2021 FFE)을 위해 뉴질랜드 신경학 재단(Neurological Foundation of New Zealand)의 자금을 지원받았습니다. 연구 비용은 또한 Neurological Foundation Fellowship-2021 FFE와 오클랜드 대학교 교수 연구 개발 기금에서 부분적으로 지원되었습니다. 제임스 허클스비(James Hucklesby)는 오클랜드 의학 연구 재단(Auckland Medical Research Foundation)의 장학금으로 자금을 지원받았습니다. 환자 유래 뉴질랜드 흑색종 NZM 세포주를 연구하기 위해 Baguley 팀과 오클랜드 암 학회 연구 센터 덕분입니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
aMEMGibco12561072Melanoma cell base media
cellZscope arraynanoAnalyticscellZscope2; software v4.3.1TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tailGibcoA1048301ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMPSigma-AldrichD0627Brain endothelial media supplement
ECIS array Applied BiophysicsECIS ZΘ; software v1.2.163.0Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate Applied Biophysics96W20idf 96-well biosensor plate
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Brain endothelial media supplement
hCMVECApplied Biological MaterialsT0259Brain endothelial cell line
hEGFPeproTechPTAF10015100Brain endothelial media supplement
HeparinSigma-AldrichH-3393Brain endothelial media supplement
hFGFPeproTechPTAF10018B50Brain endothelial media supplement
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Brain endothelial media supplement
IL-1βPeproTech200-01BCytokine
Insulin-Transferrin-Sodium SeleniteSigma-Aldrich11074547001Melanoma cell media supplement
M199Gibco11150-067Brain endothelial cell base media
MilliQ waterDeionized water
PBS 1xGibco10010-023
TNFαPeproTech300-01ACytokine
Transwell insertCorningCLS3464Porous membrane insert
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Dissociation reagent

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