암세포와 사이토카인에 대응하는 두 개의 임피던스 기반 바이오센서를 사용한 뇌내피 장벽 무결성 측정

요약

여기에서는 뇌 내피 장벽 강도를 측정하기 위해 임피던스 기반 바이오센서인 ECIS 및 cellZscope를 사용하는 기술을 보여줍니다. 우리는 뇌 내피의 체외 모델에 다양한 자극을 추가하는 준비 및 기술에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 결과를 측정, 기록 및 대표 분석을 제공합니다.

초록

혈액-뇌 장벽(BBB)은 혈액 속의 해로운 병원체로부터 뇌 실질을 보호합니다. BBB는 pericyte, astrocytic foot process 및 단단히 부착 된 내피 세포로 구성된 신경 혈관 단위로 구성됩니다. 여기서 뇌 내피 세포는 혈액 매개 병원체에 대한 첫 번째 장벽을 형성합니다. 암 및 신경 염증과 같은 상태에서는 혈액 내 순환 인자가 이 장벽을 파괴할 수 있습니다. 질병의 진행은 뇌 영역에 대한 접근을 허용하거나 손상을 허용하는 장벽 파괴 후 크게 악화됩니다. 이는 특히 뇌 수준에서 사용할 수 있는 제한된 치료 옵션으로 인해 예후를 크게 악화시킵니다. 따라서 새로운 연구는 혈액 속의 이러한 해로운 요인이 뇌 내피 세포와 상호 작용하는 것을 방지할 수 있는 잠재적인 치료법을 조사하는 것을 목표로 합니다.

상용 ECIS(Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) 및 cellZscope 기기는 BBB 내피와 같은 세포 단층의 임피던스를 측정하여 장벽 강도를 측정합니다. 여기에서 우리는 다양한 자극의 추가에 대한 뇌 내피 장벽 무결성을 평가하기 위해 두 바이오센서의 사용에 대해 자세히 설명합니다. 결정적으로, 우리는 여러 변수와 생물학적 처리의 동시 조사를 위한 고처리량 능력의 중요성을 강조합니다.

서문

이 기사에서는 미세혈관 세포 평가의 현재 동향에 대해 설명합니다. 우리는 특히 대뇌 미세혈관 내피 세포의 장벽 특성을 측정하기 위해 상업적으로 이용 가능한 두 가지 플랫폼의 사용에 대해 자세히 설명합니다. 내피 세포는 혈관 벽을 둘러싸고 있는 혈액을 마주하는 세포입니다. 그러나 대뇌 미세혈관은 보호하는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 형성하는 데 도움이 된다는 점에서 독특합니다^1,2,3. BBB는 혈액에서 뇌로 분자가 이동하는 것을 조절하는 기능을 합니다. 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 말초 질환은 일반적으로 BBB ^4,5의 기능 부전과 관련이 있습니다. BBB를 형성하는 해부학적 구조는 신체의 다른 곳의 혈액-조직 계면에 존재하지 않는다⁶. 이러한 해부학적 구조는 뇌 내피 세포에 가까운 주위 세포로 구성되며 증식과 투과성을 조절합니다. 영양 셔플링 및 해부학적 지원에 관여하는 성상세포발 돌기

프로토콜

1. ECIS 를 사용하여 다양한 치료에 대한 반응으로 뇌 내피 장벽 무결성의 변화를 모니터링합니다.

1. 소프트웨어, 어레이 스테이션 및 기계 설정
   1. 96웰 어레이 스테이션을 기계에 연결합니다. 어레이 스테이션을 비닐 봉지에 넣고 분석하기 최소 1시간 전에 인큐베이터에 넣어 예열할 수 있도록 합니다. 실험 직전에 비닐 봉지를 제거하십시오.
   2. 준비가 되면 기기를 켜고 컴퓨터에서 해당 소프트웨어를 엽니다. Collect Data 탭 아래의 Setup 버튼을 누릅니다. 소프트웨어는 연결 검사를 완료하여 연결된 어댑터 유형(예: 96웰 어레이 스테이션)을 감지하고 표시된 플레이트 맵에 빨간색 웰을 표시합니다. 이것은 소프트웨어가 어댑터를 감지하지만 부착된 플레이트를 감지할 수 없음을 나타냅니다. 이제 시스템은 96웰 플레이트를 사용할 준비가 되었습니다.
2. 96웰 바이오센서 플레이트 준비
   참고: 96웰 플레이트 배열이 사용됩니다. 각 웰의 바닥에는 금도금 전극의 손가락이 교차되어 있습니다. 플레이트는 멸균 후드/생물학적 안전 작업대에서만 열어야 하는 멸균 팩으로 제공됩니다. 금 전극은 전극 커패시턴스를 유지하기 위....

토론

BBB에 영향을 미치는 질병에 대한 치료 연구는 뇌 내피 장벽의 무결성과 조절의 중요성을 고려해야 합니다. 예를 들어, 다른 해부학적 부위에서 뇌로 암이 전이되는 과정에서 뇌 내피 장벽 파괴가 비판적으로 조사되고 있습니다. 이는 뇌 내피가 순환하는 종양 세포에 대한 첫 번째 장벽을 형성하기 때문입니다. 소개에서 앞서 언급했듯이 내피 장벽 무결성에 대한 체외 연구는 재현 가능하고,.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
aMEM	Gibco	12561072	Melanoma cell base media
cellZscope array	nanoAnalytics	cellZscope2; software v4.3.1	TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tail	Gibco	A1048301	ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Brain endothelial media supplement
ECIS array	Applied Biophysics	ECIS ZΘ; software v1.2.163.0	Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate	Applied Biophysics	96W20idf	96-well biosensor plate
FBS	Sigma-Aldrich	12203C-500ML
GlutaMAX	Gibco	305050-061	Brain endothelial media supplement
hCMVEC	Applied Biological Materials	T0259	Brain endothelial cell line
hEGF	PeproTech	PTAF10015100	Brain endothelial media supplement
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3393	Brain endothelial media supplement
hFGF	PeproTech	PTAF10018B50	Brain endothelial media supplement
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Brain endothelial media supplement
IL-1β	PeproTech	200-01B	Cytokine
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	11074547001	Melanoma cell media supplement
M199	Gibco	11150-067	Brain endothelial cell base media
MilliQ water			Deionized water
PBS 1x	Gibco	10010-023
TNFα	PeproTech	300-01A	Cytokine
Transwell insert	Corning	CLS3464	Porous membrane insert
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Dissociation reagent