使用两个基于阻抗的生物传感器测量响应癌细胞和细胞因子的脑内皮屏障完整性的变化

摘要

在这里，我们演示了使用基于阻抗的生物传感器的技术:ECIS 和 cellZscope，用于测量大脑内皮屏障强度。我们详细介绍了向脑内皮的 体外 模型添加各种刺激的准备和技术。我们测量、记录并给出对结果的代表性分析。

摘要

血脑屏障 （BBB） 保护脑实质免受血液中有害病原体的侵害。BBB 由神经血管单位组成，包括周细胞、星形胶质细胞足突和紧密粘附的内皮细胞。在这里，脑内皮细胞形成了抵御血源性病原体的第一道屏障。在癌症和神经炎症等情况下，血液中的循环因子会破坏这种屏障。屏障破坏后疾病进展显着恶化，这允许进入或损害大脑区域。这显着恶化了预后，特别是由于大脑水平可用的治疗选择有限。因此，新兴研究旨在研究可以防止血液中这些有害因子与脑内皮细胞相互作用的潜在治疗方法。

市售的电细胞衬底阻抗传感 （ECIS） 和 cellZscope 仪器可测量细胞单层（如 BBB 内皮细胞）的阻抗，以确定其屏障强度。在这里，我们详细介绍了在添加各种刺激后使用这两种生物传感器来评估脑内皮屏障完整性。至关重要的是，我们强调了它们的高通量能力对于同时研究多个变量和生物处理的重要性。

引言

本文讨论了微血管细胞评估的当前趋势。我们特别详细介绍了使用两个市售平台来测量脑微血管内皮细胞的屏障特性。内皮细胞是面向血液的细胞，排列在血管壁上。然而，脑微血管是独一无二的，因为它们有助于形成保护性血脑屏障 （BBB）^1,2,3。BBB 的功能是调节分子从血液到大脑的运输。影响中枢神经系统 （CNS） 的外周疾病通常与 BBB 的功能衰竭有关 ^4,5。形成 BBB 的解剖结构不存在于身体其他部位的血组织界面⁶。这些解剖结构包括位于脑内皮细胞附近的周细胞，并调节它们的增殖和通透性;星形胶质细胞足突，参与营养洗牌和解剖支持 ^7,8;小胶质细胞是大脑中的常驻巨噬细胞，通常与神经炎症和缺血有关 9,10,11,12，以及脑内皮细胞，它形成单层紧密粘附的细胞，没有开窗 ^13,14.脑内皮通常被称为"脑内皮屏障"，以五种不同的方式形成结构和功能屏障。首先，细胞旁屏障成分是通过粘附在外侧细胞间连接处形成的。其次，通过调节内吞作用来维持跨细胞屏障成分。第三，一个专门的基底膜通过主要由胶原蛋白组成的丰富细胞外基质锚定和支持内皮^15,16。最后两种机制是通过酶和转运蛋白，分别有助于调节药物代谢和大分子摄取¹⁷。

细胞旁相互作用构成了脑内皮屏障的主要组成部分，由紧密连接 （TJ） 促进，包括膜蛋白 claudins、occluthin 和 junctional adhesion moleconductor （JAM）¹⁸。膜蛋白的强同型结合形成第一个结构屏障，尽管 JAM 也与辅助蛋白 zonula occludens 连接，从而将 TJ 连接到肌动蛋白细胞骨架^19,20。肌动蛋白连接将 TJ 置于内皮 21 的顶端区域，内皮²¹ 在功能上极化内皮细胞，从而在该顶端或"面向血液"的一侧形成结构屏障。在内皮的基底外侧区域，高度特化的粘附连接 （AJ） 在维持细胞形态中起调节作用。AJ 包含钙依赖性钙粘蛋白，钙粘蛋白通过连环蛋白家族复合物连接邻近内皮细胞的细胞骨架^20,22。血管内皮钙粘蛋白 （VE-Cadherin） 就是这样一种钙粘蛋白，它调节 TJ 蛋白的表达和整体内皮屏障功能以维持内皮单层完整性 23,24,25,26,27。炎症调节剂，如肿瘤坏死因子-α （TNFα），向 VE-钙粘蛋白内化发出远离细胞连接的信号，导致内皮屏障不稳定 28,29,30。血小板内皮细胞粘附分子 （PECAM）³¹ 是另一种 AJ 钙粘蛋白，可稳定和重塑内皮连接^32,33。这些连接蛋白的密度限制了电子流经内皮细胞之间的细胞旁空间。该属性用于测量跨融合细胞单层（如脑内皮）的内皮屏障强度或跨内皮电阻 （TER）。

治疗研究集中在脑内皮上，因为它在血脑界面中起着至关重要的作用。几种疾病会对脑内皮产生负面影响，包括多发性硬化症、中风、神经退行性疾病和癌症等神经炎症性疾病 34,35,36,37。一旦大脑内皮屏障被破坏，疾病进展就会显着恶化，因为大脑会有效地暴露于血液中的有害刺激³⁸。我们之前已经表明，炎症介质和转移性黑色素瘤细胞通过使用两种测量内皮屏障强度的技术来破坏大脑内皮屏障 39,40,41。

电细胞-基质阻抗传感 （ECIS） 是一种基于阻抗的生物传感器 ，可实时 和无标记地评估内皮细胞屏障的完整性。在这里，检测孔衬有镀金电极，这将交流电 （AC） 引入检测系统。脑内皮细胞接种到这些孔中，这意味着 AC 可以通过细胞应用。（图 1A 井;侧视图）。这建立了用于计算阻抗的电路（图 1A - 电路图）。当脑内皮细胞粘附在板上并开始形成它们的细胞旁连接时，阻抗会增加。当内皮细胞汇合时，阻抗趋于稳定，形成单层，并限制电流。以不同频率应用交流电会影响电流通过内皮细胞的流动路径。当以较高频率 （>10⁴ Hz） 施加时，电流流过内皮细胞体。这提供了有关细胞单层电容的信息，用于评估细胞粘附和扩散。在低频 （10^{2-10 4} Hz） 下，膜阻抗很高，限制了 电流流过 电池。在这种情况下，大多数电流在像元 之间 导航。在大约 4,000 Hz 时，电流阻力主要归因于通过 细胞间隙 的内皮细胞-细胞连接。因此，在此频率下电阻的任何变化都提供了有关内皮屏障完整性的信息。

虽然原始阻抗测量可以深入了解屏障特性，但 ECIS 软件可以对在多个交流频率上测量的总电阻进行数学建模，更准确地说，将其分为屏障完整性的两个关键参数。这些参数是相邻细胞侧膜之间的细胞旁抗性（抗性 β-Rb;细胞旁屏障; 图 1A - 绿色箭头），以及基底细胞层和电极之间的基底外侧电阻（电阻 α-Alpha;基底外侧屏障; 图 1A - 蓝色箭头）。第三个建模参数也测量为细胞膜电容 （C_m; 图 1A - 红色箭头）。C_m 显示通过细胞的电容电流，指示细胞膜组成。在此，Rb 或细胞旁屏障的变化表明 TJs 和 AJs 的改变，这对于维持内皮屏障完整性至关重要。为了可靠地解释 Rb，提出了四个关键假设，由 Giaever 和 Keese⁴² 提出，并由 Stolwijk 等人 ⁴³ 进行了批判性讨论。尽管这些假设对于确保 ECIS 建模的有效性很重要，但它们很容易被融合的内皮单层满足。

与 ECIS 一样，cellZscope 允许测量内皮屏障电阻的变化;然而，细胞是在多孔膜插入物上培养的。在该系统中，电路位于膜插件两侧的两个电极之间。内皮单层在该膜插入物的顶部培养，允许测量跨内皮电阻 （TER）（图 1B 孔;侧视图）。与 ECIS 一样，在该系统中，总阻抗可归因于几个 barrier 分量，具体取决于施加电流的频率⁴⁴。在低频下，电极电容 （C_El） 在系统的总阻抗中占主导地位。或者，在高频下，介质的电阻（R_介质）在总阻抗中占主导地位。因此，最有用的测量位于中频范围 （10 2-10 ⁴ Hz） 内，它提供有关内皮屏障的两个关键组成部分的信息（图 1B 电路图）。首先，在 10^{3-10 4} Hz 时，电池层电容 （C_Cl） 在整体阻抗中占主导地位，因为膜电阻 （R_膜） 足够高，可以忽略不计，并且电流主要流过电容器。因此，C_Cl 表示通过细胞膜的电阻变化。或者，TER 主要在 10^{2-10 3} Hz 处施加总阻抗，其中电流通过相邻细胞之间的连接空间传导，由连接蛋白连接在一起。因此，这提供了有关内皮屏障的细胞旁成分的信息，如之前在 ECIS 上的 Rb 中看到的那样。

图 1C 详细说明了黑色素瘤细胞治疗如何破坏脑内皮的特定区域。生物传感器通过流经细胞旁空间的电流变化（以 Rb 或 TER 测量）来检测这种破坏;基底外侧间隙（以 Alpha 测量）;和细胞膜（以 C_m 或 C_Cl 测量）。我们使用了本介绍中详述的两个生物传感器来测量用各种刺激（如细胞因子或侵袭性黑色素瘤细胞）治疗后的脑内皮屏障变化。如果给定的刺激破坏了内皮屏障，则测得的电阻会降低，从而形成一条阻力最小的路径以允许电流流动。因此，"屏障抵抗力"的降低表明屏障完整性丧失或大脑内皮屏障破坏。在这些分析中，我们通过实时解释耐药性和建模参数来研究这种破坏。ECIS 和 cellZscope 在解决此类研究问题中的应用详见其他部分 39,41,45,46。

体外 研究通过揭示使疾病进展的分子和功能途径来发现关键的疾病机制。然而，这需要在 体外可靠地复制疾病，这与功能正常的身体有很大不同。在理想情况下， 体外 研究应该是可重复的、无创的、无标记的、定量的，并模拟 体内发现的结构影响。在本文中，我们详细介绍了使用这两种竞争技术来测量治疗诱导的脑内皮屏障完整性变化的方法。我们讨论了将他们的结果结合起来的优势，以提供更全面的障碍破坏情况，并分享仍然需要克服的限制。

研究方案

1. 使用 ECIS 监测响应各种治疗后大脑内皮屏障完整性的变化

1. 设置软件、阵列工作站和机器
   1. 将 96 孔阵列站连接到机器。将阵列站放入塑料袋中，并在测定前至少 1 小时将其放入培养箱中，使其预热。实验前立即取出塑料袋。
   2. 准备好后，打开机器并在计算机上打开相应的软件。按 Collect Data 选项卡下的 Setup 按钮。该软件将完成连接检查，这将检测连接的适配器类型（例如，96 孔阵列站）并在描绘的板图中显示红色孔。这表示软件检测到适配器，但无法感应到连接的板。该系统现在可用于 96 孔板。
2. 准备 96 孔生物传感器板
   注意:使用 96 孔板布置。每个孔的底部都饰有镀金电极的交叉手指。板装在无菌包装中，只能在无菌罩/生物安全柜中打开。必须首先通过添加 10 mM 半胱氨酸对金电极进行化学稳定，以保持电极电容。
   1. 在无菌槽中制备 10 mM 半胱氨酸，并使用多通道小心地将 100 μL 移液到每个孔中。在室温下孵育半胱氨酸 15 分钟，然后小心吸出，仅在孔的边缘移液，以避免划伤电极。使用相同的移液技术，用无菌去离子水（不是 PBS）洗掉半胱氨酸至少 2 次。
      注:板电极也可以使用 ECIS 设备上的温介质进行电稳定，而不是使用半胱氨酸涂层，如制造商的方案中所述。
   2. 准备 ECM 底物作为孔底部的基底膜。
      注意:可以根据脑内皮细胞系的要求选择胶原蛋白或层粘连蛋白等 ECM 底物。在这里，我们将胶原蛋白用于人脑微血管内皮细胞系 （hCMVEC）。
   3. 在新鲜、无菌的槽中制备 1 μg/cm² 溶解在 0.02 M 乙酸中的大鼠尾胶原蛋白 I（每孔 100 μL）。将胶原蛋白在无菌罩中在弱光下放置 1 小时，然后用去离子水小心洗涤 2 次并小心移液。
      注意:确保在最后一次洗涤后尽可能小心地去除尽可能多的去离子水，并让板在通风橱中干燥。建议在涂布后立即使用该板;但是，它可以暂时储存在 4 °C 的水中（不到一周）。该板现在可以使用了。
3. 准备脑内皮细胞以接种到 96 孔生物传感器板上
   注:建议首先优化要使用的内皮细胞系的生长期和接种密度。该方案中使用了 hCMVEC 系，在 96 孔板中以每孔 20,000 个细胞接种后，需要 48 小时才能达到汇合。
   1. 使用温和的解离试剂在无菌罩中收获脑内皮细胞，并进行准确的细胞计数。每孔在 100 μL 培养基中使用 20,000 个 hCMVEC，稳定生长期 48 小时。准备多余的脑内皮细胞，以确保所有 96 个孔的最佳移液。
      注:因此，对于 96 孔板，在 10 mL 预热培养基中大约需要 2,000,000 个细胞。
   2. 将脑内皮细胞转移到新鲜的无菌槽中，并使用多通道移液器，每孔小心加入 100 μL（20,000 个细胞）的细胞悬液。定期将细胞轻轻重悬于槽中，以避免内皮细胞随着时间的推移而沉淀。确保 1 个孔中只有培养基，没有细胞，以便进行数学建模（无细胞孔），并且整个板在 30 秒内接种。
4. 开始实验
   1. 将板适配器两侧的红色夹子向外移动，小心地将板连接到培养箱中的适配器上。将板的 A1 孔与适配器的 A1 区域对齐。用一只手轻轻地将板固定到位，然后用另一只手将红色夹子卡回原位。
      注意: 确保板在适配器中稳定。
   2. 关闭培养箱，然后再次按 Setup（设置 ）。在板图中查找绿色孔，指示正确检测到的孔。任何显示红色的井都有连接错误。要解决此问题，请快速重新安装板，
      注意:花费过多时间尝试修复连接不良的孔可能会损害细胞健康。
   3. 按 Check 键重新检查附件是否为绝对阻抗读数。这将需要几分钟时间。
   4. 按板图下方的 箭头 ，确保选择正确的板目录。在本例中，它是 96w20idf。
   5. 按下 多频 按钮，确保在多个交流频率下测量阻抗，以便将来进行数学建模。
   6. 按 Start 开始实验。让细胞增殖 ~48 小时并形成其典型的高电阻单层，通过欧姆的增加来衡量。
5. 在 96 孔板上用癌细胞或细胞因子处理脑内皮细胞
   注:由于 96 孔板允许同时测试多个刺激，因此请准备具有所需治疗方案的清晰板图（补充图 S1-bottom） 的每种治疗都可以而且必须进行 至少 一式三份（三个重复孔）以进行统计分析;但是，4 个仿行显示在 补充图 S1.
   1. 在 48 小时时，检查脑内皮细胞的生长。在准备处理溶液之前，确保达到平台期。
      注意:不同的内皮细胞系可能需要不同的时间长度才能达到平台期。因此，在进行此实验之前，必须优化它们的生长阶段和种子密度。Wells 通常应该在同一小时内趋于稳定。否则，它们可能会受损或移液不准确，因此不得包含在内。
   2. 对于细胞因子处理，在预热的完全培养基中制备适当浓度的细胞因子及其相关的载体和培养基对照。
      1. 制备 2 倍最终所需浓度的细胞因子，因为当添加到每个含有脑内皮细胞的孔中时，它们将被 1:1 稀释。
      2. 为了使每次处理一式三份进行，请准备总体积超过 300 μL（即至少总共 350 μL）的所有细胞因子，每孔添加 100 μL 的处理。
   3. 对于细胞处理，用温和的解离试剂收获细胞（本方案中使用的三种不同的患者来源的黑色素瘤细胞系）并进行准确的细胞计数。以 1:1 的顶部效应器:靶比 （E:T 比率） 进行基于细胞的治疗，其中治疗细胞是效应细胞（例如，黑色素瘤细胞），脑内皮细胞是靶细胞，即每孔向 20,000 个脑内皮细胞中加入 20,000 个黑色素瘤细胞。
      1. 如果需要，连续稀释以获得 1:10 或 1:100 的较小 E:T 比率。为了允许在一式三份孔中进行处理，请对细胞进行计数，并以超过 300 μL 的总体积（即至少 350 μL 总体积）制备它们，每孔添加 100 μL 的处理。
   4. 根据 96 孔板图（补充图 S1-Top），标记 1.1 mL 聚丙烯簇管，其为 8 管联管形式（即 1 mL 联管）。将条带管插入条带管板中，并在实验前对其进行高压灭菌。将处理细胞因子或细胞的总体积（即完整的 350 μL 处理）添加到无菌试管中，并将它们放在培养箱中保温。
   5. 在软件上，按 Pause 暂停实验。这可能需要几秒钟才能完成。暂停后，打开培养箱，用一只手小心地松开两个红色夹子，同时用另一只手稳定板。保持实验暂停，并将板带到无菌罩中。
   6. 从培养箱中取出处理条管。使用多通道移液器，小心地重悬处理条管的内容物，然后将 100 μL 处理液从条管添加到 96 孔板上的正确孔中，不要接触孔底部。小心地将处理添加到所有孔中，仅将培养基添加到无细胞孔中，并在 5 分钟内完成此步骤，以获得完整的 96 孔板，因为过度冷却会影响内皮单层的阻力。
   7. 将处理过的板放回机器中，像以前一样连接，然后按 设置 |检查。
   8. 确保选择了正确的板目录和多频采集设置，然后按 Resume（恢复 ）继续实验。允许实验进行并运行它，直到达到所需的终端节点。
   9. 按 Finish（完成） 完成实验，这将自动保存录制的 abp. 文件。导航到 文件 |导出数据 以将此文件检索为 xls。或 csv.文件进行进一步分析。

2. 使用 cellZscope 监测响应各种治疗后大脑内皮屏障完整性的变化

1. 准备仪器的金属部件、适配器和多孔膜插件
   1. 依次用去离子水、70% 乙醇和 70% 乙醇清洁金属部件，然后再次用去离子水清洁。
   2. 高压灭菌底部电极或"罐"和顶部浸渍电极，并用 70% 乙醇对 Cell Module 的所有其他组件进行消毒。
   3. 在无菌罩中，将所有 24 个底部电极/"罐"拧入电解池模块，安装它们，注意在整个过程中保持无菌。
   4. 向孔中加入 900 μL 基础培养基。
      注:将基础培养基添加到底部孔中，该孔充当内皮的基底隔室。建议不要在这个隔室中使用血清，以更可靠地复制脑内皮的基底环境。
   5. 将浸渍电极磁性连接到池模块盖上，然后盖上孔盖，使浸渍电极插入底部电极罐。
   6. 将 Cell Module 连接到培养箱中的适配器上，并放置至少 1 小时以平衡。在这个阶段，打开软件，在 Layout 选项卡下加载实验板图，从而将处理板图嵌入到文件中，最终将包含数据。
   7. 在需要包被的情况下，使用无菌 24 孔培养板固定内室并将 ECM 底物（例如胶原蛋白）添加到孔的内部，将膜小室包被在无菌罩中，如第 1.2.3 节所述使用单通道移液器小心地将 ECM 底物加载到每个孔中。
2. 准备将脑内皮细胞接种到膜插入物上并开始实验
   1. 根据第 1.3 节收获并计数脑内皮细胞，但在 50 mL 离心管中准备最终所需的细胞滴定。确保收获的细胞在温暖的完全培养基中，包括所有必需的生长因子和血清。
   2. 使用单通道移液器，小心地将脑内皮细胞（本方案中为 80,000 个）接种到 350 μL 完全培养基中的孔插入物的顶端腔中。
   3. 通过将完全培养基仅移液到其中一个插入片段中来包括无细胞孔。
   4. 从培养箱中取出 Cell Module，并将其放入无菌罩中。使用一对镊子将准备好的插件转移到底部电极槽中，以仅处理插件的上部支撑。避免在膜下形成气泡。
   5. 将 Cell Module 放回培养箱中的适配器上。
   6. 在软件的 实验 选项卡的 频谱 部分下，选择 从 1 Hz 开始 和 在 100 kHz 停止 ，以在整个频率范围内采集数据;选择 Fine Steps。
   7. 在 Wait time （等待时间） 下，选择 15 分钟 以允许软件以最快的速度进行连续测量。
   8. 按 "开始" 开始实验，让脑内皮细胞增殖并形成具有高电阻的单层。此步骤大约需要 48 小时。
3. 用膜插入物上的癌细胞和细胞因子处理脑内皮细胞
   1. 在 48 小时时，按照第 1.5 节准备处理细胞因子或细胞（例如，黑色素瘤细胞），包括在适用的情况下进行细胞计数，并收集在 1 mL 条带管或等效管中。
   2. 准备正确浓度的处理液，向每个孔中加入 70 μL（插入）。将处理液放入培养箱中保温。
   3. 由于此处的仪器每 15 分钟进行一次测量，因此请选择在测量完成后立即开始的处理时间。此时，从培养箱中取出 Cell Module，并使用无绒湿巾用 70% 乙醇轻轻擦拭。
   4. 在无菌罩中，打开细胞模块，小心地将 70 μL 处理液移液到相应插入物的顶端腔中。使用单通道移液器执行此操作，并以圆周运动添加，避免气泡。在 10 分钟内完成此步骤，在下次测量开始之前将电池模块放回适配器。
   5. 按 Stop 结束实验。将数据直接导出到 xls。文件 |导出 选项卡。打开此文件后，请适当地命名并保存此文件。

结果

解释 ECIS 阻抗数据

了解最佳实验条件
在这里，可以使用软件直接查看数据（图 2A）或导出以进行分析和图形绘制（图 2B）。 图 2A 显示了实际软件界面上显示的数据示例。左图显示了由于 96 孔生物传感器板不正确地加载到适配器（称为阵列站）中而导致连接中断的示例。通?...

讨论

对影响 BBB 的疾病的治疗研究必须考虑脑内皮屏障完整性和调节的重要性。例如，在癌症从其他解剖部位转移到大脑中，对脑内皮屏障破坏进行了关键研究。这是因为脑内皮形成了对抗循环肿瘤细胞的第一道屏障。如前面所述，关于内皮屏障完整性的 体外 研究需要具有可重复性、无创性、无标记性、定量性， 并尽可能接近 体内环境。在本文中，我们讨论了使用两个关键的生物传感?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
aMEM	Gibco	12561072	Melanoma cell base media
cellZscope array	nanoAnalytics	cellZscope2; software v4.3.1	TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tail	Gibco	A1048301	ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Brain endothelial media supplement
ECIS array	Applied Biophysics	ECIS ZΘ; software v1.2.163.0	Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate	Applied Biophysics	96W20idf	96-well biosensor plate
FBS	Sigma-Aldrich	12203C-500ML
GlutaMAX	Gibco	305050-061	Brain endothelial media supplement
hCMVEC	Applied Biological Materials	T0259	Brain endothelial cell line
hEGF	PeproTech	PTAF10015100	Brain endothelial media supplement
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3393	Brain endothelial media supplement
hFGF	PeproTech	PTAF10018B50	Brain endothelial media supplement
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Brain endothelial media supplement
IL-1β	PeproTech	200-01B	Cytokine
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	11074547001	Melanoma cell media supplement
M199	Gibco	11150-067	Brain endothelial cell base media
MilliQ water			Deionized water
PBS 1x	Gibco	10010-023
TNFα	PeproTech	300-01A	Cytokine
Transwell insert	Corning	CLS3464	Porous membrane insert
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Dissociation reagent