使用两个基于阻抗的生物传感器测量响应癌细胞和细胞因子的脑内皮屏障完整性的变化

摘要

在这里，我们演示了使用基于阻抗的生物传感器的技术：ECIS 和 cellZscope，用于测量大脑内皮屏障强度。我们详细介绍了向脑内皮的 体外 模型添加各种刺激的准备和技术。我们测量、记录并给出对结果的代表性分析。

摘要

血脑屏障 （BBB） 保护脑实质免受血液中有害病原体的侵害。BBB 由神经血管单位组成，包括周细胞、星形胶质细胞足突和紧密粘附的内皮细胞。在这里，脑内皮细胞形成了抵御血源性病原体的第一道屏障。在癌症和神经炎症等情况下，血液中的循环因子会破坏这种屏障。屏障破坏后疾病进展显着恶化，这允许进入或损害大脑区域。这显着恶化了预后，特别是由于大脑水平可用的治疗选择有限。因此，新兴研究旨在研究可以防止血液中这些有害因子与脑内皮细胞相互作用的潜在治疗方法。

市售的电细胞衬底阻抗传感 （ECIS） 和 cellZscope 仪器可测量细胞单层（如 BBB 内皮细胞）的阻抗，以确定其屏障强度。在这里，我们详细介绍了在添加各种刺激后使用这两种生物传感器来评估脑内皮屏障完整性。至关重要的是，我们强调了它们的高通量能力对于同时研究多个变量和生物处理的重要性。

引言

本文讨论了微血管细胞评估的当前趋势。我们特别详细介绍了使用两个市售平台来测量脑微血管内皮细胞的屏障特性。内皮细胞是面向血液的细胞，排列在血管壁上。然而，脑微血管是独一无二的，因为它们有助于形成保护性血脑屏障 （BBB）^1,2,3。BBB 的功能是调节分子从血液到大脑的运输。影响中枢神经系统 （CNS） 的外周疾病通常与 BBB 的功能衰竭有关 ^4,5。形成 BBB 的解剖结构不存在于身体其他部位的血组织界面⁶。这些解剖结构包括位于脑内皮细胞附近的周细胞，并调节它们的增殖和通透性;星形胶质细胞足突，参与营养洗牌和解剖支持 ^7,8;小胶质细胞是大脑中的常驻巨噬细胞，通常与神经炎症和缺血有关 9,10,11,12，以及脑内皮细胞，它形成单层紧密粘附的细胞，没有开窗

研究方案

1. 使用 ECIS 监测响应各种治疗后大脑内皮屏障完整性的变化

1. 设置软件、阵列工作站和机器
   1. 将 96 孔阵列站连接到机器。将阵列站放入塑料袋中，并在测定前至少 1 小时将其放入培养箱中，使其预热。实验前立即取出塑料袋。
   2. 准备好后，打开机器并在计算机上打开相应的软件。按 Collect Data 选项卡下的 Setup 按钮。该软件将完成连接检查，这将检测连接的适配器类型（例如，96 孔阵列站）并在描绘的板图中显示红色孔。这表示软件检测到适配器，但无法感应到连接的板。该系统现在可用于 96 孔板。
2. 准备 96 孔生物传感器板
   注意：使用 96 孔板布置。每个孔的底部都饰有镀金电极的交叉手指。板装在无菌包装中，只能在无菌罩/生物安全柜中打开。必须首先通过添加 10 mM 半胱氨酸对金电极进行化学稳定，以保持电极电容。
   1. 在无菌槽中制备 10 mM 半胱氨酸，并使用多通道小心地将 100 μL 移液到每个孔中。在室温下孵育半胱氨酸 15 分钟，然后小心吸出，仅在孔的边缘移液，以避免划伤电极。使用相同的移液技术，用无菌去离子水（不是 PBS）洗掉半胱氨酸至少 2 次。
      注：板电极也可以使用 ECIS 设备上的温介质进行电稳定，而不是使用半胱氨酸涂层，如制造商的方案中所述。
   2. 准备 ....

讨论

对影响 BBB 的疾病的治疗研究必须考虑脑内皮屏障完整性和调节的重要性。例如，在癌症从其他解剖部位转移到大脑中，对脑内皮屏障破坏进行了关键研究。这是因为脑内皮形成了对抗循环肿瘤细胞的第一道屏障。如前面所述，关于内皮屏障完整性的 体外 研究需要具有可重复性、无创性、无标记性、定量性， 并尽可能接近 体内环境。在本文中，我们讨论了使用两个关键的生物传感?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
aMEM	Gibco	12561072	Melanoma cell base media
cellZscope array	nanoAnalytics	cellZscope2; software v4.3.1	TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tail	Gibco	A1048301	ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Brain endothelial media supplement
ECIS array	Applied Biophysics	ECIS ZΘ; software v1.2.163.0	Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate	Applied Biophysics	96W20idf	96-well biosensor plate
FBS	Sigma-Aldrich	12203C-500ML
GlutaMAX	Gibco	305050-061	Brain endothelial media supplement
hCMVEC	Applied Biological Materials	T0259	Brain endothelial cell line
hEGF	PeproTech	PTAF10015100	Brain endothelial media supplement
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3393	Brain endothelial media supplement
hFGF	PeproTech	PTAF10018B50	Brain endothelial media supplement
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Brain endothelial media supplement
IL-1β	PeproTech	200-01B	Cytokine
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	11074547001	Melanoma cell media supplement
M199	Gibco	11150-067	Brain endothelial cell base media
MilliQ water			Deionized water
PBS 1x	Gibco	10010-023
TNFα	PeproTech	300-01A	Cytokine
Transwell insert	Corning	CLS3464	Porous membrane insert
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Dissociation reagent