الإثراء السريع والفعال للخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي للفأر

Summary

تعتبر الخلايا الدبقية الصغيرة من أكثر الخلايا تنوعا في الجسم ، وهي قادرة على التكيف المورفولوجي والوظيفي. يتيح عدم تجانسها وتعدد وظائفها الحفاظ على توازن الدماغ ، بينما ترتبط أيضا بأمراض عصبية مختلفة. هنا ، يتم وصف تقنية لتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي.

Abstract

يحدد العمود الفقري الفقاريات ويشكل القناة الشوكية ، وهي تجويف يحيط بالحبل الشوكي ويحميه. يعتمد التطور السليم ووظيفة الجهاز العصبي المركزي للثدييات بشكل كبير على نشاط الضامة المقيمة المعروفة باسم الخلايا الدبقية الصغيرة. تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة عدم التجانس وتعدد الوظائف ، مما يتيح التعبير الجيني المتميز والسلوك داخل الحبل الشوكي والدماغ. استكشفت العديد من الدراسات وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة الدماغية ، مع تفصيل طرق التنقية على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي في الفئران تفتقر إلى وصف شامل. في المقابل ، فإن استخدام كولاجيناز عالي النقاء ، على عكس المستخلص غير المكرر ، يفتقر إلى الإبلاغ داخل أنسجة الجهاز العصبي المركزي. في هذه الدراسة ، تم استئصال العمود الفقري والحبل الشوكي من الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8-10 أسابيع. استخدم الهضم اللاحق كولاجيناز عالي النقاء ، واستخدمت تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة تدرج الكثافة. خضعت الخلايا لتلطيخ لقياس التدفق الخلوي ، وتقييم الجدوى والنقاء من خلال تلطيخ CD11b و CD45. أسفرت النتائج عن متوسط صلاحية 80٪ ومتوسط نقاء 95٪. في الختام ، تضمن التلاعب بالخلايا الدبقية الصغيرة للفأر عملية الهضم باستخدام كولاجيناز عالي النقاء ، يليه تدرج الكثافة. أنتج هذا النهج بشكل فعال أعدادا كبيرة من الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي.

Introduction

السمة المميزة للفقاريات هي العمود الفقري أو العمود الفقري ، حيث تم استبدال notochord بسلسلة من العظام المجزأة تسمى الفقرات ، مقسومة على أقراص الفقرية. هذا التعاقب من المواد العظمية يشكل القناة الشوكية ، وهو تجويف يحيط ويحمي الحبل الشوكي¹. في جنس Rodentia ، يتكون العمود الفقري عادة من سبع فقرات عنق الرحم ، وثلاثة عشر فقرة صدرية ، وست فقرات قطنية ، وعدد متغير من الفقرات الذيلية ^2,3. طول الحبل الشوكي مشابه لطول العمود الفقري، والخيط الطرفي هو تركيب غير عصبي يثبت الحبل الشوكي بالعجز. بالإضافة إلى ذلك ، تخرج الألياف العصبية من خلال الثقبة الفقرية¹.

Protocol

أجريت الدراسة وفقا للمعيار المكسيكي الرسمي NOM-062-ZOO-1999 ودليل رعاية واستخدام المختبر. تم الحصول على الموافقة على الدراسة من لجان البحث والأخلاقيات والسلامة البيولوجية في مستشفى المكسيك للأطفال (HIM/2023/006) ولجنة البحوث وأخلاقيات البيولوجيا في المستشفى العام في المكسيك إدواردو ليسياغا (DI/21/501/04/62). تم الحصول على ثلاثة فئران C57BL / 6 تتراوح أعمارهم بين 6 و 8 أسابيع من مستشفى مكسيكو للأطفال ، حيث تم تربيتهم في ظروف معزولة في رفوف جيدة التهوية ، وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية واستخدامها.

1. تحضير المواد والكواشف

1. قبل التسخين^Ca 2+ و Mg²⁺ مجانا PBS وكذلك محلول الملح المتوازن من H....

النتائج

باستخدام أنسجة الحبل الشوكي للفأر ، تم إجراء الهضم الأنزيمي باستخدام خليط غني للغاية مع كولاجيناز وثيرموليسين. خضعت الأنسجة المهضومة الناتجة للمرور عبر مرشح 40 ميكرومتر للتخلص من المواد غير المهضومة. تم إثراء الخلايا التي تم جمعها من خلال تدرج كثافة Percoll ، مع 90 ٪ في الجزء السفلي و 45 ٪ في الج.......

Discussion

تم تطوير العديد من البروتوكولات لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة بسبب أهميتها في توازن الدماغ. في هذه الطرق ، يتم الحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة عادة من نصفي الكرة المخية للجرذان والفئران الجنينية أو حديثي الولادة¹⁷. تناول عدد محدود من الدراسات تنقية الخلايا الدبقية الصغي?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining