الإثراء السريع والفعال للخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي للفأر

Summary

تعتبر الخلايا الدبقية الصغيرة من أكثر الخلايا تنوعا في الجسم ، وهي قادرة على التكيف المورفولوجي والوظيفي. يتيح عدم تجانسها وتعدد وظائفها الحفاظ على توازن الدماغ ، بينما ترتبط أيضا بأمراض عصبية مختلفة. هنا ، يتم وصف تقنية لتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي.

Abstract

يحدد العمود الفقري الفقاريات ويشكل القناة الشوكية ، وهي تجويف يحيط بالحبل الشوكي ويحميه. يعتمد التطور السليم ووظيفة الجهاز العصبي المركزي للثدييات بشكل كبير على نشاط الضامة المقيمة المعروفة باسم الخلايا الدبقية الصغيرة. تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة عدم التجانس وتعدد الوظائف ، مما يتيح التعبير الجيني المتميز والسلوك داخل الحبل الشوكي والدماغ. استكشفت العديد من الدراسات وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة الدماغية ، مع تفصيل طرق التنقية على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي في الفئران تفتقر إلى وصف شامل. في المقابل ، فإن استخدام كولاجيناز عالي النقاء ، على عكس المستخلص غير المكرر ، يفتقر إلى الإبلاغ داخل أنسجة الجهاز العصبي المركزي. في هذه الدراسة ، تم استئصال العمود الفقري والحبل الشوكي من الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8-10 أسابيع. استخدم الهضم اللاحق كولاجيناز عالي النقاء ، واستخدمت تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة تدرج الكثافة. خضعت الخلايا لتلطيخ لقياس التدفق الخلوي ، وتقييم الجدوى والنقاء من خلال تلطيخ CD11b و CD45. أسفرت النتائج عن متوسط صلاحية 80٪ ومتوسط نقاء 95٪. في الختام ، تضمن التلاعب بالخلايا الدبقية الصغيرة للفأر عملية الهضم باستخدام كولاجيناز عالي النقاء ، يليه تدرج الكثافة. أنتج هذا النهج بشكل فعال أعدادا كبيرة من الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي.

Introduction

السمة المميزة للفقاريات هي العمود الفقري أو العمود الفقري ، حيث تم استبدال notochord بسلسلة من العظام المجزأة تسمى الفقرات ، مقسومة على أقراص الفقرية. هذا التعاقب من المواد العظمية يشكل القناة الشوكية ، وهو تجويف يحيط ويحمي الحبل الشوكي¹. في جنس Rodentia ، يتكون العمود الفقري عادة من سبع فقرات عنق الرحم ، وثلاثة عشر فقرة صدرية ، وست فقرات قطنية ، وعدد متغير من الفقرات الذيلية ^2,3. طول الحبل الشوكي مشابه لطول العمود الفقري، والخيط الطرفي هو تركيب غير عصبي يثبت الحبل الشوكي بالعجز. بالإضافة إلى ذلك ، تخرج الألياف العصبية من خلال الثقبة الفقرية¹.

يعتمد التطور والوظيفة المناسبة للجهاز العصبي المركزي في الثدييات بشكل حاسم على نشاط الضامة المقيمة في الجهاز العصبي ، والتي تسمى الخلايا الدبقية الصغيرة⁴. على الرغم من أن الخلايا الدبقية الصغيرة وصفت في البداية بأنها خلايا بلعمية مقيمة في الدماغ ، فقد عزت الأبحاث الحديثة العديد من الوظائف الديناميكية إلى هذه الخلايا ^5,6. يتراوح حجم الخلايا الدبقية الصغيرة من 7 إلى 10 ميكرومتر في التوازن. تعتبر من بين الخلايا الأكثر تنوعا في الجسم ويمكن أن تتكيف شكليا ووظيفيا مع بيئتها المتغيرة باستمرار⁷. تظهر هذه الخلايا عدم تجانس عالي خلال كل من المرحلتين الجنينية والبالغة ^8,9 ، بينما في مرحلة البلوغ ، فإنها تظهر أيضا عدم تجانس وظيفي معقد بناء على سياقها الزماني المكاني¹⁰. يسمح عدم التجانس والوظائف المتعددة للخلايا الدبقية الصغيرة بالتعبير الجيني التفاضلي والسلوك في الحبل الشوكي والدماغ. لقد ثبت أن تعبير CD11b و CD45 و CD86 و CCR9 أعلى في الحبل الشوكي مقارنة بالدماغ ^8,9.

توجد بروتوكولات متعددة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الدماغية^11,12 ؛ ومع ذلك ، لا يوجد سوى عدد قليل من الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي^13,14. إن تحسين طريقة لتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي يسهل تطوير دراسات متعددة تركز على اكتشاف فسيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة. يهدف هذا البروتوكول إلى وصف استخراج بسيط وقابل للتكرار للغاية للحبل الشوكي للفأر وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 1).

Protocol

أجريت الدراسة وفقا للمعيار المكسيكي الرسمي NOM-062-ZOO-1999 ودليل رعاية واستخدام المختبر. تم الحصول على الموافقة على الدراسة من لجان البحث والأخلاقيات والسلامة البيولوجية في مستشفى المكسيك للأطفال (HIM/2023/006) ولجنة البحوث وأخلاقيات البيولوجيا في المستشفى العام في المكسيك إدواردو ليسياغا (DI/21/501/04/62). تم الحصول على ثلاثة فئران C57BL / 6 تتراوح أعمارهم بين 6 و 8 أسابيع من مستشفى مكسيكو للأطفال ، حيث تم تربيتهم في ظروف معزولة في رفوف جيدة التهوية ، وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية واستخدامها.

1. تحضير المواد والكواشف

1. قبل التسخين^Ca 2+ و Mg²⁺ مجانا PBS وكذلك محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS) إلى 37 درجة مئوية.
2. استكمل محلول HBSS ب 100 ميكروغرام / مل من الليبراز و 4 ميكروغرام / مل من DNase (HBSS-LD). تأكد من أن الحل يحافظ على درجة الحموضة الفسيولوجية من 7.4.
   ملاحظة: 1 مل من محلول العمل لكل الحبل الشوكي ستكون ضرورية.
3. قم بإعداد محلول متساوي التوتر بنسبة 90٪ للطرد المركزي المتدرج الكثافة (متاح تجاريا ، انظر جدول المواد) وقم بتسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
4. قم بإعداد المخزن المؤقت للتلوين عن طريق الجمع بين مصل بقري الجنين المعطل بالحرارة بنسبة 5٪ (FBS) مع برنامج تلفزيوني ، وتخزين الخليط على الثلج.
5. قبل التسخين جلوكوز النسر المعدل من Dulbecco (1 جم / لتر) (DMEM) إلى 37 درجة مئوية.
6. استكمل وسط DMEM ب 10٪ FBS ، 2 mM L-glutamine ، 200 U / mL البنسلين ، 200 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 500 بيكوغرام / مل من الأمفوتريسين B (انظر جدول المواد) لتحضير DMEM-S.

2. تشريح وإعداد الحبل الشوكي

1. القتل الرحيم للفأر بجرعة زائدة داخل الصفاق من بنتوباربيتال بجرعة 150 مجم / كجم. تعقيم الصدر والظهر الماوس باستخدام 70 ٪ من الإيثانول.
   ملاحظة: تأكد من نجاح القتل الرحيم قبل متابعة تشريح الفأر.
2. حلق منطقة الصدر القطني وثبت الأطراف على لوحة التشريح باستخدام شريط لاصق.
3. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق دقيق على طول خط الوسط الظهري من القذالي إلى المنطقة المقدسة (الشكل 2).
4. بمساعدة المجهر الجراحي المجسم ، تشريح في طبقات حتى تصل إلى العمود الفقري القطني وتحديد القوس الساحلي الأخير.
   ملاحظة: الأقواس الساحلية ال 13 مفصلية في الفقرات الصدرية. عند تشريحها ، تصبح مرئية متفوقة على الفقرة L1².
5. حدد آخر فقرة عنق الرحم والعجز ، ثم قم بعمل قطع لفصل العمود الفقري (الشكل 2).
6. باستخدام ملقط التشريح ، قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية الظهرية للفقرات لاستخراج الحبل الشوكي (الشكل 3A-D).
   ملاحظة: باستثناء أول فقرتين من عنق الرحم (الأطلس والمحور) ، تشترك جميع الفقرات المتحركة في تصميم مورفولوجي مشترك في مناطق مختلفة (عنق الرحم أو الصدر أو أسفل الظهر). تتميز كل فقرة متحركة نموذجية بجسم فقري أسطواني في نهايتها الأمامية. يرتبط بالجزء الخلفي من الجسم قوس عظمي يعرف باسم القوس الفقري (القوس العصبي) ، ويتكون من الصفيحات والعمليات الشائكة. بين هذه الهياكل تكمن الثقبة الفقرية¹⁵.
7. إزالة الأعصاب الناشئة من خلال الثقبة (الجذور الظهرية والبطنية) التي تشكل الجهاز العصبي المحيطي وقد تحتوي على بلاعم متسللة (الشكل 3D).
   ملاحظة: ليس من الضروري إزالة الأم الحنون أو السحايا لأن وسط تدرج الكثافة يزيل الخلايا النجمية الملوثة بشكل فعال. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاحتفاظ بالسحايا يقلل من وقت التنقية ويعزز قابلية البقاء.

3. هضم الأنسجة وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة

1. ضع الحبل الشوكي على لوح التشريح ، وباستخدام مقص Vannas ، قم بتقطيع الحبل الشوكي إلى قطع 2 مم ، مما ينتج عنه 10 قطع في المتوسط.
2. انقل أقسام الحبل الشوكي إلى أنبوب دقيق مسطح القاع سعة 2 مل (الشكل 3E ، F).
3. أضف 1 مل من حل العمل HBSS-LD (الخطوة 1.2). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة ، دوامة بقوة كل 5 دقائق.
4. مرر محتويات كل عملية هضم من خلال مصفاة 40 ميكرومتر ، ثم أضف 7 مل من HBSS مع 2٪ FBS لتحييد الهضم.
5. سحق الأنسجة المتبقية باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مل. جهاز طرد مركزي التعليق في أنبوب مخروطي سعة 50 مل لمدة 5 دقائق عند 220 × جم ، 4 درجات مئوية.
6. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة صغيرة سعة 1 مل ، وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من HBSS مع 2٪ FBS في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يمزج مع 2 مل من 90٪ متوسط تدرج الكثافة متساوي التوتر. جهاز طرد مركزي لمدة 25 دقيقة عند 160 × جم ، 18 درجة مئوية.
   ملاحظة: استخدم التسارع البطيء وتجنب استخدام الفرامل.
7. استخدم ماصة نقل لاسترداد الواجهة ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اغسل الخلايا ب 10 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 220 × جم ، 4 درجات مئوية.
8. أعد تعليق الخلايا في DMEM-S (الخطوة 1.6) واحتفظ بها مخزنة على الجليد.

4. تحديد النقاء / الجدوى

1. لتحديد كمية الخلايا القابلة للحياة باستخدام غرفة مقياس الدم ، استخدم صبغة تريبان الزرقاء بنسبة 0.4٪ (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: في المتوسط ، يوفر الماوس الواحد 4-6 ملايين خلية.
2. لتحديد كمية الخلايا القابلة للحياة عبر مقياس التدفق الخلوي ، استخدم تلطيخ صبغة الفلورسنت التفاعلية للأمين المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
   1. انقل 1 مليون خلية إلى أنبوب بوليسترين مستدير القاع (FACS) سعة 5 مل. تمييع صبغة الفلورسنت مع PBS بنسبة 1: 1000 (إنشاء حل العمل الجدوى).
   2. احتضان العينات بمحلول الصلاحية في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني بارد مرتين. أعد تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ (الخطوة 1.4).
   3. قم بسد الخلايا باستخدام 2.4G2 anti-FcRIII / I (انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت للتلطيخ المثلج لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   4. قم بصياغة كوكتيل تلطيخ الأجسام المضادة عن طريق إضافة الأجسام المضادة أحادية النسيلة ذات العلامات الفلورية CD45-PerCP و CD11b-eFluor 450 إلى مخزن التلوين المؤقت (بتخفيف 1: 300) (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: أثناء توفر كلتا الطريقتين ، اختر التقنية التي تتوافق بشكل أفضل مع البروتوكول التالي.
   5. احتضان العينات مع كوكتيل تلطيخ الأجسام المضادة في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا بمحلول تلطيخ بارد مرتين. إعادة تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من العازلة تلطيخ.
   6. احصل على 250000 حدث على مقياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح في استراتيجية البوابة في الخطوة 6 (الشكل 4).

5. تلطيخ المناعي

1. ضع غطاء معالج مسبقا في بئر من 6 آبار.
   ملاحظة: لمعالجة أغطية الغطاء ، ضعها في طبق بتري مع 500 ميكرولتر من محلول L-polylysine (0.01 مجم / مل ، انظر جدول المواد) واحتضانها لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، اغسلها ثلاث مرات بالماء المقطر واتركها حتى تجف.
2. زرع 200000 خلية على غطاء الغطاء المعالج باستخدام 500 ميكرولتر من محلول DMEM-S. احتضان لمدة 24 ساعة.
3. قم بإزالة أغطية الغطاء وإصلاح الخلايا باستخدام 3.7٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل أغطية الغطاء ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد.
4. تتخلل الخلايا بنسبة 0.2٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل أغطية الأغطية ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد. سد الخلايا مع 0.2٪ BSA في PBS لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
5. قم بتخفيف الأجسام المضادة أحادية النسيلة ذات العلامات الفلورية (عند تخفيف 1: 300 ، انظر جدول المواد) في محلول الحجب واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل أغطية الغطاء ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد.
6. ضع وسيط التثبيت الذي يحتوي على DAPI على الشريحة ، ثم أغلقه بغطاء غطاء.
   ملاحظة: يمكن تحليل الشرائح على الفور باستخدام مجهر مضان أو مجهر متحد البؤر ، أو يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 3 أشهر عند -20 درجة مئوية.

6. استراتيجية البوابات للخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي

1. قم بإنشاء مخطط نقطي وإنشاء بوابة لعزل الخلايا القابلة للحياة بناء على تلطيخ الجدوى وقناة الفلورسنت الفارغة¹⁶. استبعاد الخلايا غير القابلة للحياة.
2. إنتاج قطعة أرض أخرى باستخدام معلمات التشتت الأمامية والجانبية لإزالة الحطام¹⁶.
3. قم بتطوير مخطط نقطي إضافي وتحليل تعبير CD11b و CD45 للتمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة.

النتائج

باستخدام أنسجة الحبل الشوكي للفأر ، تم إجراء الهضم الأنزيمي باستخدام خليط غني للغاية مع كولاجيناز وثيرموليسين. خضعت الأنسجة المهضومة الناتجة للمرور عبر مرشح 40 ميكرومتر للتخلص من المواد غير المهضومة. تم إثراء الخلايا التي تم جمعها من خلال تدرج كثافة Percoll ، مع 90 ٪ في الجزء السفلي و 45 ٪ في الج...

Discussion

تم تطوير العديد من البروتوكولات لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة بسبب أهميتها في توازن الدماغ. في هذه الطرق ، يتم الحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة عادة من نصفي الكرة المخية للجرذان والفئران الجنينية أو حديثي الولادة¹⁷. تناول عدد محدود من الدراسات تنقية الخلايا الدبقية الصغي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining