Enrichissement rapide et efficace de la microglie de la moelle épinière de souris

Résumé

Les microglies sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme, capables d’adaptation morphologique et fonctionnelle. Leur hétérogénéité et leur multifonctionnalité permettent le maintien de l’homéostasie cérébrale, tout en étant liées à diverses pathologies neurologiques. Ici, une technique de purification de la microglie de la moelle épinière est décrite.

Résumé

La colonne vertébrale définit un vertébré et façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière. Le bon développement et le bon fonctionnement du système nerveux central des mammifères dépendent en grande partie de l’activité des macrophages résidents connus sous le nom de microglies. Les microglies présentent une hétérogénéité et une multifonctionnalité, permettant une expression et un comportement géniques distincts dans la moelle épinière et le cerveau. De nombreuses études ont exploré la fonction de la microglie cérébrale, détaillant abondamment les méthodes de purification. Cependant, la purification de la microglie de la moelle épinière chez la souris manque d’une description complète. En revanche, l’utilisation d’une collagénase hautement purifiée, par opposition à un extrait non raffiné, manque de rapports dans les tissus du système nerveux central. Dans cette étude, la colonne vertébrale et la moelle épinière ont été excisées chez des souris C57BL/6 âgées de 8 à 10 semaines. La digestion subséquente a utilisé une collagénase hautement purifiée, et la purification de la microglie a utilisé un gradient de densité. Les cellules ont subi une coloration pour la cytométrie en flux, évaluant la viabilité et la pureté par coloration CD11b et CD45. Les résultats ont donné une viabilité moyenne de 80 % et une pureté moyenne de 95 %. En conclusion, la manipulation de la microglie de souris a impliqué une digestion avec une collagénase hautement purifiée, suivie d’un gradient de densité. Cette approche a effectivement produit d’importantes populations de microglies de la moelle épinière.

Introduction

La caractéristique déterminante des vertébrés est la colonne vertébrale ou colonne vertébrale, dans laquelle la notochorde a été remplacée par une séquence d’os segmentés appelés vertèbres, divisés par des disques intervertébraux. Cette succession de matière osseuse façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière¹. Dans le genre Rodentia, la colonne vertébrale est généralement formée de sept vertèbres cervicales, treize vertèbres thoraciques, six vertèbres lombaires et un nombre variable de vertèbres caudales ^2,3. La longueur de la moelle épinière est similaire à celle de la colonne vertébrale et le filum terminal est une structure non nerveuse qui ancre la moelle épinière au sacrum. De plus, les fibres nerveuses sortent par le foramen intervertébral¹.

Le développement et le bon fonctionnement du système nerveux central chez les mammifères dépendent de manière critique de l’activité des macrophages résidents du système nerveux, appelés microglie⁴. Bien que les microglies aient été initialement décrites comme des phagocytes résidents du cerveau, des recherches récentes ont attribué de nombreuses fonctions dynamiques à ces cellules ^5,6. La taille de la microglie varie de 7 à 10 μm en homéostasie ; Elles sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme et peuvent s’adapter morphologiquement et fonctionnellement à leur environnement en constante évolution⁷. Ces cellules présentent une forte hétérogénéité au stade embryonnaire et au stade adulte^8,9, tandis qu’au stade adulte^, elles présentent également une hétérogénéité fonctionnelle complexe en fonction de leur contexte spatio-temporel¹⁰. L’hétérogénéité et les multiples fonctions de la microglie permettent une expression et un comportement différentiels des gènes dans la moelle épinière et le cerveau. Il a été démontré que l’expression de CD11b, CD45, CD86 et CCR9 est plus élevée dans la moelle épinière que dans le cerveau ^8,9.

Il existe plusieurs protocoles pour l’isolement de la microglie cérébrale^11,12 ; cependant, il n’en existe que quelques-uns pour la microglie de la moelle épinière^13,14. L’optimisation d’une méthode de purification de la microglie de la moelle épinière facilite le développement de multiples études axées sur la découverte de la physiologie de la microglie. Ce protocole vise à décrire une extraction simple et hautement reproductible de la moelle épinière de souris et la purification de la microglie (Figure 1).

Protocole

L’étude a été menée conformément à la norme officielle mexicaine NOM-062-ZOO-1999 et au guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. L’approbation de l’étude a été obtenue auprès des comités de recherche, d’éthique et de biosécurité de l’hôpital pour enfants de Mexico (HIM/2023/006) et du comité de recherche et de bioéthique de l’hôpital général de Mexico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Trois souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines ont été obtenues de l’hôpital pour enfants de Mexico, où elles ont été élevées dans des conditions isolées dans des racks ventilés, conformément aux directives institutionnelles en matière de soins et d’utilisation des animaux.

1. Préparation des matériaux et des réactifs

1. Préchauffer le PBS sans Ca 2+ et Mg²⁺ ainsi que la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 37 °C.
2. Compléter la solution HBSS avec 100 μg/mL de Liberase et 4 μg/mL de DNase (HBSS-LD). Assurez-vous que la solution maintient un pH physiologique de 7,4.
   REMARQUE : 1 mL de solution de travail par moelle épinière sera nécessaire.
3. Préparez une solution isotonique à 90 % pour la centrifugation à gradient de densité (disponible dans le commerce, voir le tableau des matériaux) et préchauffez-la à 37 °C.
4. Préparez le tampon de coloration en combinant du sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS) à 5 % avec du PBS et conservez le mélange sur de la glace.
5. Préchauffer le Modified Eagle’s de Dulbecco à une glycémie moyennement élevée (1 g/L) (DMEM) à 37 °C.
6. Complétez le milieu DMEM avec 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 200 U/mL de pénicilline, 200 μg/mL de streptomycine et 500 pg/mL d’amphotéricine B (voir le tableau des matériaux) pour préparer le DMEM-S.

2. Dissection et préparation de la moelle épinière

1. Euthanasier la souris avec un surdosage intrapéritonéal de pentobarbital à une dose de 150 mg / kg. Stérilisez le thorax et le dos de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
   REMARQUE : Confirmer que l’euthanasie a réussi avant de procéder à la dissection chez la souris.
2. Rasez la région thoraco-lombaire et fixez les extrémités à la planche de dissection à l’aide de ruban adhésif.
3. À l’aide d’un scalpel, faites une incision soigneuse le long de la ligne médiane dorsale, de la région occipitale à la région sacrée (figure 2).
4. À l’aide d’un microscope chirurgical stéréoscopique, disséquer en couches jusqu’à atteindre la colonne lombaire et identifier la dernière arcade costale.
   REMARQUE : Les 13 arcs costaux sont articulés dans les vertèbres thoraciques ; lorsqu’elles sont disséquées, elles deviennent visibles supérieures à la vertèbre L1².
5. Déterminez la dernière vertèbre cervicale et le sacrum, puis faites une incision pour séparer la colonne vertébrale (Figure 2).
6. À l’aide d’une pince à disséquer, effectuer une laminectomie dorsale des vertèbres pour extraire la moelle épinière (figure 3A-D).
   REMARQUE : À l’exception des deux premières vertèbres cervicales (atlas et axe), toutes les vertèbres mobiles partagent une conception morphologique commune dans diverses régions (cervicale, thoracique ou lombaire). Chaque vertèbre mobile typique présente un corps vertébral cylindrique à son extrémité antérieure. Attaché à l’arrière du corps se trouve un arc osseux connu sous le nom d’arc vertébral (arc neural), composé de lames et d’apophyses épineuses. Entre ces structures se trouve le foramen vertébral¹⁵.
7. Enlever les nerfs émergeant à travers les foramens (racines dorsale et ventrale) qui constituent le système nerveux périphérique et peuvent contenir des macrophages infiltrés (Figure 3D).
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’enlever la pie-mère ou les méninges car le milieu de gradient de densité élimine efficacement les astrocytes contaminants. De plus, la conservation des méninges réduit le temps de purification et améliore la viabilité.

3. Digestion tissulaire et isolement de la microglie

1. Placez la moelle épinière sur la planche à disséquer et, à l’aide de ciseaux Vannas, coupez la moelle épinière en morceaux de 2 mm, ce qui donne une moyenne de 10 morceaux.
2. Transférez les sections de la moelle épinière dans un microtube à fond plat de 2 ml (figures 3E et F).
3. Ajouter 1 mL de la solution de travail HBSS-LD (étape 1.2). Incuber à 37 °C pendant 25 min, en vortex vigoureusement toutes les 5 min.
4. Passer le contenu de chaque digestion dans une passoire de 40 μm, puis ajouter 7 mL d’HBSS avec 2 % de FBS pour neutraliser la digestion.
5. Écraser le reste du tissu à l’aide d’un piston de seringue de 1 ml. Centrifuger la suspension dans un tube conique de 50 mL pendant 5 min à 220 x g, 4 °C.
6. Jeter le surnageant à l’aide d’une micropipette de 1 mL et remettre le pastille en suspension dans 2 mL d’HBSS avec 2 % de FBS dans un tube conique de 15 mL. Mélanger avec 2 mL de milieu à gradient de densité isotonique à 90 %. Centrifuger pendant 25 min à 160 x g, 18 °C.
   REMARQUE : Utilisez une accélération lente et évitez d’utiliser le frein.
7. À l’aide d’une pipette de transfert, récupérer l’interface et la transférer dans un tube conique de 15 mL. Laver les cellules avec 10 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 220 x g, 4 °C.
8. Remettre les cellules en suspension dans DMEM-S (étape 1.6) et les conserver sur de la glace.

4. Détermination de la pureté et de la viabilité

1. Pour quantifier les cellules viables à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre, utilisez une coloration au bleu trypan à 0,4 % (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : En moyenne, une seule souris fournit 4 à 6 millions de cellules.
2. Pour quantifier les cellules viables à l’aide d’un cytomètre en flux, utilisez un colorant fluorescent réactif aux amines disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
   1. Transférez 1 million de cellules dans un tube de 5 ml en polystyrène à fond rond (FACS). Diluer le colorant fluorescent avec du PBS dans un rapport de 1 :1000 (pour créer la solution de travail de viabilité).
   2. Incuber les échantillons avec la solution de viabilité dans l’obscurité à 4 °C pendant 30 min. Lavez les cellules avec du PBS glacé deux fois. Remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon de coloration (étape 1.4).
   3. Bloquer les cellules avec de l’anti-FcRIII/I 2.4G2 (voir tableau des matériaux) dans le tampon de coloration glacé pendant 15 min à 4 °C.
   4. Formuler le cocktail de coloration des anticorps en ajoutant les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence CD45-PerCP et CD11b-eFluor 450 au tampon de coloration (à une dilution de 1 :300) (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE : Bien que les deux techniques soient disponibles, choisissez celle qui correspond le mieux au protocole suivant.
   5. Incuber les échantillons avec le cocktail de coloration d’anticorps dans l’obscurité à 4 °C pendant 30 min. Lavez deux fois les cellules avec un tampon de coloration glacé. Remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon de coloration.
   6. Acquérir 250 000 événements sur un cytomètre en flux, comme indiqué dans la stratégie de déclenchement à l’étape 6 (Figure 4).

5. Coloration immunofluorescente

1. Placez une lamelle prétraitée dans un puits d’une plaque à 6 puits.
   REMARQUE : Pour traiter les lamelles, les placer dans une boîte de Pétri avec 500 μL de solution de L-polylysine (0,01 mg/mL, voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 1 h. Ensuite, lavez-les trois fois avec de l’eau distillée et laissez-les sécher.
2. Ensemencer 200 000 cellules sur la lamelle traitée à l’aide de 500 μL de solution DMEM-S. Incuber pendant 24 h.
3. Retirez les lamelles et fixez les cellules à l’aide de paraformaldéhyde (PFA) à 3,7 % pendant 20 min à température ambiante. Lavez les lamelles trois fois avec du PBS glacé.
4. Perméabiliser les cellules avec 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, lavez les lamelles trois fois avec du PBS froid. Bloquer les cellules avec 0,2 % de BSA dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
5. Diluer les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence (à une dilution de 1 :300, voir tableau des matériaux) dans la solution bloquante et incuber pendant 1 h à température ambiante. Lavez les lamelles trois fois avec du PBS glacé.
6. Appliquez un support de montage contenant du DAPI sur la lame, puis scellez-la avec une lamelle.
   REMARQUE : Les lames peuvent être immédiatement analysées à l’aide d’un microscope à fluorescence ou confocal, ou elles peuvent être stockées jusqu’à 3 mois à -20°C.

6. Stratégie de déclenchement pour la microglie de la moelle épinière

1. Générez un diagramme à points et établissez une porte pour isoler les cellules viables en fonction de la coloration de la viabilité et d’un canal fluorescent vide¹⁶. Exclure les cellules non viables.
2. Produire un autre tracé en utilisant les paramètres de diffusion vers l’avant et sur les côtés pour éliminer les débris¹⁶.
3. Développer un diagramme à points supplémentaire et analyser l’expression de CD11b et CD45 pour différencier la microglie.

Résultats

En utilisant du tissu de moelle épinière de souris, la digestion enzymatique a été réalisée à l’aide d’un mélange hautement enrichi en collagénase et en thermolysine. Le tissu digéré qui en résulte passe à travers un filtre de 40 μm pour éliminer les matières non digérées. Les cellules collectées ont été enrichies par un gradient de densité de Percoll, avec 90 % dans la partie inférieure et 45 % dans la partie supérieure. Les cellules enrichies en microglie à l’intérieur de l’interface o...

Discussion

De nombreux protocoles ont été développés pour l’étude de la microglie en raison de leur importance dans l’homéostasie cérébrale. Dans ces méthodes, les microglies proviennent généralement des hémisphères cérébraux de rats et de souris embryonnaires ou néonatals¹⁷. Un nombre limité d’études ont porté sur la purification de la microglie de la moelle épinière de souris adultes^13,14. Ces techniques impliquent une di...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining