Быстрое и эффективное обогащение микроглии спинного мозга мышей

Резюме

Микроглия считается одной из самых универсальных клеток в организме, способных к морфологической и функциональной адаптации. Их гетерогенность и многофункциональность позволяют поддерживать гомеостаз мозга, а также связаны с различными неврологическими патологиями. Здесь описана методика очищения микроглии спинного мозга.

Аннотация

Позвоночный столб определяет позвоночное животное и формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг. Правильное развитие и функционирование центральной нервной системы млекопитающих в значительной степени зависят от активности резидентных макрофагов, известных как микроглия. Микроглия проявляет гетерогенность и многофункциональность, обеспечивая различную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. В многочисленных исследованиях изучалась функция церебральной микроглии, подробно описывались методы очистки. Однако очищение микроглии от спинного мозга у мышей не имеет исчерпывающего описания. В отличие от этого, использование высокоочищенной коллагеназы, в отличие от нерафинированного экстракта, не находит отклика в тканях центральной нервной системы. В этом исследовании позвоночный столб и спинной мозг были вырезаны у 8-10-недельных мышей C57BL/6. В последующем расщеплении использовалась высокоочищенная коллагеназа, а в очистке микроглии использовался градиент плотности. Клетки подвергались окрашиванию для проточной цитометрии, оценивая жизнеспособность и чистоту с помощью окрашивания CD11b и CD45. Результаты показали среднюю жизнеспособность 80% и среднюю чистоту 95%. В заключение, манипуляции с микроглией мыши включали в себя пищеварение высокоочищенной коллагеназой с последующим градиентом плотности. Этот подход эффективно привел к созданию значительных популяций микроглии спинного мозга.

Введение

Определяющей характеристикой позвоночных является позвоночный столб или позвоночник, в котором хорда заменена последовательностью сегментированных костей, называемых позвонками, разделенных межпозвоночными дисками. Эта последовательность костного материала формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг¹. У рода Rodentia позвоночник обычно образован семью шейными позвонками, тринадцатью грудными позвонками, шестью поясничными позвонками и переменным числом хвостовых позвонков ^2,3. Длина спинного мозга аналогична длине позвоночника, а концевая нить является ненервной структурой, которая прикрепляет спинной мозг к крестцу. Кроме того, нервные волокна выходят через межпозвонковое отверстие¹.

Развитие и правильное функционирование центральной нервной системы у млекопитающих в решающей степени зависит от активности резидентных макрофагов нервной системы, называемых микроглией⁴. Хотя микроглия первоначально описывалась как резидентные фагоциты мозга, недавние исследования приписывают этим клеткам множество динамических функций ^5,6. Размер микроглии колеблется от 7 до 10 мкм в гомеостазе; Они считаются одними из самых универсальных клеток в организме и могут морфологически и функционально адаптироваться к постоянно меняющейся окружающей среде⁷. Эти клетки демонстрируют высокую гетерогенность как на эмбриональной, так и на взрослой стадиях^8,9, в то время как на взрослой стадии они также демонстрируют сложную функциональную гетерогенность^, основанную на их пространственно-временном контексте¹⁰. Гетерогенность и множественность функций микроглии обеспечивают дифференцированную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. Показано, что экспрессия CD11b, CD45, CD86 и CCR9 выше в спинном мозге^по сравнению с головным мозгом ^8,9.

Существует несколько протоколов для выделения церебральной микроглии^11,12; Однако для микроглии спинного мозга^13,14 существует лишь несколько. Оптимизация метода очистки микроглии от спинного мозга способствует развитию многочисленных исследований, направленных на изучение физиологии микроглии. Этот протокол направлен на описание простого и высоковоспроизводимого извлечения спинного мозга мыши и очистки микроглии (рис. 1).

протокол

Исследование проводилось в соответствии с официальным мексиканским стандартом NOM-062-ZOO-1999 и руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Одобрение на проведение исследования было получено от комитетов по исследованиям, этике и биобезопасности Детской больницы Мексики (HIM/2023/006) и Комитета по исследованиям и биоэтике Больницы общего профиля Мексики имени Эдуардо Лисеаги (DI/21/501/04/62). Три мыши C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель были получены из Детской больницы Мексики, где они выращивались в изолированных условиях в вентилируемых стойках в соответствии с рекомендациями по уходу за животными и их использованию.

1. Подготовка материалов и реагентов

1. Предварительно прогрейте до 37 °C свободный от Ca 2+ и Mg²⁺ PBS, а также сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS).
2. Дополните раствор HBSS 100 мкг/мл либеразы и 4 мкг/мл ДНКазы (HBSS-LD). Следите за тем, чтобы раствор поддерживал физиологический рН 7,4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо 1 мл рабочего раствора на спинной мозг.
3. Приготовьте изотонический 90%-ный раствор для центрифугирования с градиентом плотности (имеется в продаже, см. Таблицу материалов) и подогрейте его до 37 °C.
4. Приготовьте буфер для окрашивания, смешав 5% инактивированную при нагревании фетальную бычью сыворотку (FBS) с PBS, и храните смесь на льду.
5. Предварительно нагрейте Modified Eagle's Medium-high глюкозы Dulbecco (1 г/л) (DMEM) до 37 °C.
6. Для получения DMEM-S добавляют в среду DMEM 10% FBS, 2 мМ L-глютамина, 200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 500 пг/мл амфотерицина B (см. таблицу материалов).

2. Рассечение и препарирование спинного мозга

1. Усыпляют мышь внутрибрюшинной передозировкой пентобарбитала в дозе 150 мг/кг. Стерилизуйте грудную клетку и спину мыши, используя 70% этанол.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эвтаназия прошла успешно, прежде чем приступать к вскрытию мыши.
2. Побрейте грудопоясничную область и закрепите конечности на доске для препарирования с помощью клейкой ленты.
3. С помощью скальпеля сделайте аккуратный надрез вдоль дорсальной средней линии от затылочной до крестцовой области (рисунок 2).
4. С помощью стереоскопического хирургического микроскопа рассекают послойно, пока не дойдете до поясничного отдела позвоночника и не определите последнюю реберную дугу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 13 реберных дуг сочленяются в грудных позвонках; при рассечении они становятся видимыми выше L1 позвонка².
5. Определите последний шейный позвонок и крестец, затем сделайте надрез для отделения позвоночника (рисунок 2).
6. С помощью рассекающих щипцов выполняют дорсальную ламинэктомию позвонков для извлечения спинного мозга (рис. 3A-D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением первых двух шейных позвонков (атланта и оси), все подвижные позвонки имеют общий морфологический дизайн в различных областях (шейном, грудном или поясничном). Каждый типичный подвижный позвонок имеет цилиндрическое тело позвонка на переднем конце. К задней части тела прикреплена костная дуга, известная как дуга позвонка (невральная дуга), состоящая из пластинок и остистых отростков. Между этими структурами лежит позвоночное отверстие¹⁵.
7. Удаляют нервы, выходящие через отверстия (дорсальные и вентральные корешки), которые составляют периферическую нервную систему и могут содержать инфильтрированные макрофаги (рис. 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости удалять pia mater или мозговые оболочки, так как среда градиента плотности эффективно устраняет загрязнение астроцитов. Кроме того, сохранение мозговых оболочек сокращает время очистки и повышает жизнеспособность.

3. Расщепление тканей и выделение микроглии

1. Поместите спинной мозг на препарирующую доску и ножницами Vannas разрежьте спинной мозг на кусочки по 2 мм, в среднем получится 10 кусочков.
2. Перенесите участки спинного мозга в плоскодонную микропробирку объемом 2 мл (рис. 3E, F).
3. Добавьте 1 мл рабочего раствора HBSS-LD (шаг 1.2). Инкубируйте при температуре 37 °C в течение 25 минут, энергично взбалтывая каждые 5 минут.
4. Пропускайте содержимое каждого разложения через ситечко 40 мкм, а затем добавляйте 7 мл HBSS с 2% FBS, чтобы нейтрализовать разложение.
5. Измельчите оставшуюся ткань с помощью поршня шприца объемом 1 мл. Центрифугу суспензии в конической пробирке объемом 50 мл в течение 5 мин при 220 x g, 4 °C.
6. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью микропипетки объемом 1 мл и повторно суспендируйте гранулу в 2 мл HBSS с 2% FBS в конической пробирке объемом 15 мл. Смешайте с 2 мл среды с градиентом изотонической плотности 90%. Центрифуга в течение 25 мин при 160 x g, 18 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте медленное ускорение и избегайте использования тормоза.
7. Используйте пипетку для переноса, чтобы извлечь границу раздела и перенести ее в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте клетки 10 мл PBS и центрифугируйте в течение 5 минут при 220 x g, 4 °C.
8. Ресуспендируйте клетки в DMEM-S (шаг 1.6) и храните их на льду.

4. Определение чистоты/жизнеспособности

1. Для количественного определения жизнеспособных клеток с помощью камеры гемоцитометра используют 0,4%-ный краситель трипанового синего (см. таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, одна мышь обеспечивает 4-6 миллионов клеток.
2. Для количественного определения жизнеспособных клеток с помощью проточного цитометра используют коммерчески доступное амино-реактивное окрашивание флуоресцентными красителями (см. таблицу материалов).
   1. Перенесите 1 миллион клеток в полистирольную пробирку с круглым дном (FACS) объемом 5 мл. Флуоресцентный краситель разбавляют ПБС в соотношении 1:1000 (создавая рабочий раствор жизнеспособности).
   2. Инкубируют образцы с раствором жизнеспособности в темноте при 4 °С в течение 30 мин. Промойте клетки ледяным ПБС дважды. Ресуспендируйте клетки в 400 мкл окрашивающего буфера (шаг 1.4).
   3. Заблокируйте ячейки 2.4G2 anti-FcRIII/I (см. таблицу материалов) в ледяном окрашивающем буфере на 15 мин при 4 °C.
   4. Разработайте рецепт для окрашивания антителами, добавив флуоресцентно меченные моноклональные антитела CD45-PerCP и CD11b-eFluor 450 в окрашивающий буфер (в разведении 1:300) (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что доступны оба метода, выберите тот, который лучше всего соответствует последующему протоколу.
   5. Инкубируют образцы с коктейлем из окрашивания антителами в темноте при 4 °C в течение 30 мин. Промойте клетки ледяным красящим буфером дважды. Ресуспендируйте клетки в 400 мкл окрашивающего буфера.
   6. Регистрируйте 250 000 событий на проточном цитометре, как описано в стратегии стробирования на шаге 6 (рис. 4).

5. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Поместите предварительно обработанный покровный листок в углубление 6-луночной пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки покровных стекол поместите их в чашку Петри с 500 мкл раствора L-полилизина (0,01 мг/мл, см. таблицу материалов) и инкубируйте в течение 1 ч. После этого трижды промойте их дистиллированной водой и дайте высохнуть.
2. Высевают 200 000 клеток на обработанное покровное стекло, используя 500 мкл раствора DMEM-S. Инкубируют в течение 24 ч.
3. Снимите покровные стекла и зафиксируйте ячейки с помощью 3,7% параформальдегида (PFA) в течение 20 минут при комнатной температуре. Трижды промойте покровные стекла ледяным ПБС.
4. Пермеабилизацию клеток 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Впоследствии трижды промойте покровные стекла холодной ПБС. Блокируйте клетки 0,2% БСА в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. Флуоресцентно-меченные моноклональные антитела разводят (в разведении 1:300, см. таблицу материалов) в блокирующем растворе и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Трижды промойте покровные стекла ледяным ПБС.
6. Нанесите монтажный материал, содержащий DAPI, на предметное стекло, а затем запечатайте его покровным стеклом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предметные стекла можно сразу же проанализировать с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа, или они могут храниться до 3 месяцев при -20°C.

6. Стратегия стробирования при микроглии спинного мозга

1. Сгенерируйте точечную диаграмму и установите ворота для выделения жизнеспособных клеток на основе окрашивания жизнеспособности и пустого флуоресцентного канала¹⁶. Исключите нежизнеспособные клетки.
2. Постройте еще один график с использованием параметров прямого и бокового рассеяния для устранения мусора¹⁶.
3. Разработайте дополнительную точечную диаграмму и проанализируйте экспрессию CD11b и CD45 для дифференциации микроглии.

Результаты

С использованием тканей спинного мозга мышей ферментативное пищеварение проводили с использованием смеси, сильно обогащенной коллагеназой и термолизином. Полученная переваренная ткань проходила через фильтр 40 мкм для удаления непереваренного материала. Собранные клетки обогащали ?...

Обсуждение

Было разработано множество протоколов для изучения микроглии из-за ее значимости в гомеостазе мозга. В этих методах микроглия обычно поступает из полушарий головного мозга эмбриональных или неонатальных крыс и мышей¹⁷. Ограниченное число исследований было посвящено очис?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining