Enriquecimiento rápido y eficiente de la microglía de la médula espinal de ratón

Resumen

La microglía está considerada como una de las células más versátiles del cuerpo, capaz de adaptarse morfológica y funcionalmente. Su heterogeneidad y multifuncionalidad permiten el mantenimiento de la homeostasis cerebral, a la vez que se relacionan con diversas patologías neurológicas. Aquí se describe una técnica para purificar la microglía de la médula espinal.

Resumen

La columna vertebral define a un vertebrado y da forma al canal espinal, una cavidad que encierra y protege la médula espinal. El desarrollo y la función adecuados del sistema nervioso central de los mamíferos dependen en gran medida de la actividad de los macrófagos residentes conocidos como microglía. La microglía muestra heterogeneidad y multifuncionalidad, lo que permite una expresión génica y un comportamiento distintos dentro de la médula espinal y el cerebro. Numerosos estudios han explorado la función de la microglía cerebral, detallando ampliamente los métodos de purificación. Sin embargo, la purificación de la microglía de la médula espinal en ratones carece de una descripción completa. Por el contrario, la utilización de una colagenasa altamente purificada, a diferencia de un extracto sin refinar, carece de información dentro de los tejidos del sistema nervioso central. En este estudio, se extirpó la columna vertebral y la médula espinal de ratones C57BL/6 de 8-10 semanas de edad. La digestión posterior empleó una colagenasa altamente purificada, y la purificación de la microglía utilizó un gradiente de densidad. Las células se sometieron a tinción para citometría de flujo, evaluando la viabilidad y pureza a través de la tinción de CD11b y CD45. Los resultados arrojaron una viabilidad media del 80% y una pureza media del 95%. En conclusión, la manipulación de la microglía de ratón implicó la digestión con una colagenasa altamente purificada, seguida de un gradiente de densidad. Este enfoque produjo efectivamente poblaciones sustanciales de microglía de la médula espinal.

Introducción

La característica definitoria de los vertebrados es la columna vertebral o columna vertebral, en la que la notocorda ha sido reemplazada por una secuencia de huesos segmentados llamados vértebras, divididos por discos intervertebrales. Esta sucesión de material óseo da forma al canal espinal, una cavidad que encierra y protege la médula espinal¹. En el género Rodentia, la columna vertebral suele estar formada por siete vértebras cervicales, trece vértebras torácicas, seis vértebras lumbares y un número variable de vértebras caudales ^2,3. La longitud de la médula espinal es simi....

Protocolo

El estudio se realizó de acuerdo con la norma oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999 y la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El estudio fue aprobado por los Comités de Investigación, Ética y Bioseguridad del Hospital Infantil de México (HIM/2023/006) y por el Comité de Investigación y Bioética del Hospital General de México Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Se obtuvieron tres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad del Hospital Infantil de México, donde fueron criados en condiciones aisladas en racks ventilados, de acuerdo con las pautas institucionales de cuidado y uso de animales.

1. Preparación de materiales y reac....

Discusión

Se han desarrollado numerosos protocolos para el estudio de la microglía debido a su importancia en la homeostasis cerebral. En estos métodos, la microglía se obtiene típicamente de los hemisferios cerebrales de ratas y ratones embrionarios o neonatos¹⁷. Un número limitado de estudios han abordado la purificación de la microglía de la médula espinal de ratones adultos^13,14. Estas técnicas implican la digestión enzimática utiliza.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining