Enriquecimiento rápido y eficiente de la microglía de la médula espinal de ratón

Resumen

La microglía está considerada como una de las células más versátiles del cuerpo, capaz de adaptarse morfológica y funcionalmente. Su heterogeneidad y multifuncionalidad permiten el mantenimiento de la homeostasis cerebral, a la vez que se relacionan con diversas patologías neurológicas. Aquí se describe una técnica para purificar la microglía de la médula espinal.

Resumen

La columna vertebral define a un vertebrado y da forma al canal espinal, una cavidad que encierra y protege la médula espinal. El desarrollo y la función adecuados del sistema nervioso central de los mamíferos dependen en gran medida de la actividad de los macrófagos residentes conocidos como microglía. La microglía muestra heterogeneidad y multifuncionalidad, lo que permite una expresión génica y un comportamiento distintos dentro de la médula espinal y el cerebro. Numerosos estudios han explorado la función de la microglía cerebral, detallando ampliamente los métodos de purificación. Sin embargo, la purificación de la microglía de la médula espinal en ratones carece de una descripción completa. Por el contrario, la utilización de una colagenasa altamente purificada, a diferencia de un extracto sin refinar, carece de información dentro de los tejidos del sistema nervioso central. En este estudio, se extirpó la columna vertebral y la médula espinal de ratones C57BL/6 de 8-10 semanas de edad. La digestión posterior empleó una colagenasa altamente purificada, y la purificación de la microglía utilizó un gradiente de densidad. Las células se sometieron a tinción para citometría de flujo, evaluando la viabilidad y pureza a través de la tinción de CD11b y CD45. Los resultados arrojaron una viabilidad media del 80% y una pureza media del 95%. En conclusión, la manipulación de la microglía de ratón implicó la digestión con una colagenasa altamente purificada, seguida de un gradiente de densidad. Este enfoque produjo efectivamente poblaciones sustanciales de microglía de la médula espinal.

Introducción

La característica definitoria de los vertebrados es la columna vertebral o columna vertebral, en la que la notocorda ha sido reemplazada por una secuencia de huesos segmentados llamados vértebras, divididos por discos intervertebrales. Esta sucesión de material óseo da forma al canal espinal, una cavidad que encierra y protege la médula espinal¹. En el género Rodentia, la columna vertebral suele estar formada por siete vértebras cervicales, trece vértebras torácicas, seis vértebras lumbares y un número variable de vértebras caudales ^2,3. La longitud de la médula espinal es similar a la de la columna vertebral, y el filum terminal es una estructura no nerviosa que ancla la médula espinal al sacro. Además, las fibras nerviosas salen a través del agujero intervertebral¹.

El desarrollo y el funcionamiento adecuado del sistema nervioso central en los mamíferos dependen críticamente de la actividad de los macrófagos residentes del sistema nervioso, llamados microglía⁴. A pesar de que las microglías fueron descritas inicialmente como fagocitos residentes en el cerebro, investigaciones recientes han atribuido muchas funciones dinámicas a estas células ^5,6. El tamaño de la microglía varía de 7 a 10 μm en homeostasis; Se consideran entre las células más versátiles del cuerpo y pueden adaptarse morfológica y funcionalmente a su entorno en constante cambio⁷. Estas células exhiben una alta heterogeneidad tanto en la etapa embrionaria como en la adulta^8,9, mientras que en la etapa adulta también presentan una heterogeneidad funcional compleja basada en su contexto espacio-temporal¹⁰. La heterogeneidad y las múltiples funciones de la microglía permiten la expresión génica diferencial y el comportamiento en la médula espinal y el cerebro. Se ha demostrado que la expresión de CD11b, CD45, CD86 y CCR9 es mayor en la médula espinal en comparación con el cerebro ^8,9.

Existen múltiples protocolos para el aislamiento de microglía cerebral^11,12; sin embargo, solo existen unos pocos para la microglía de la médula espinal^13,14. La optimización de un método para purificar la microglía de la médula espinal facilita el desarrollo de múltiples estudios centrados en el descubrimiento de la fisiología de la microglía. Este protocolo tiene como objetivo describir una extracción simple y altamente reproducible de la médula espinal del ratón y la purificación de la microglía (Figura 1).

Protocolo

El estudio se realizó de acuerdo con la norma oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999 y la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El estudio fue aprobado por los Comités de Investigación, Ética y Bioseguridad del Hospital Infantil de México (HIM/2023/006) y por el Comité de Investigación y Bioética del Hospital General de México Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Se obtuvieron tres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad del Hospital Infantil de México, donde fueron criados en condiciones aisladas en racks ventilados, de acuerdo con las pautas institucionales de cuidado y uso de animales.

1. Preparación de materiales y reactivos

1. Precalentar PBS libres de Ca 2+ y Mg²⁺, así como la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 37 °C.
2. Complementar la solución de HBSS con 100 μg/ml de liberasa y 4 μg/ml de DNasa (HBSS-LD). Asegúrese de que la solución mantenga un pH fisiológico de 7,4.
   NOTA: Será necesario 1 ml de solución de trabajo por médula espinal.
3. Preparar una solución isotónica al 90% para centrifugación en gradiente de densidad (disponible comercialmente, ver Tabla de Materiales) y precalentarla a 37 °C.
4. Prepare el tampón de tinción combinando suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 5% con PBS y almacene la mezcla en hielo.
5. Precalentar la glucosa media-alta (1 g/L) (DMEM) de Dulbecco Modified Eagle a 37 °C.
6. Suplementar el medio DMEM con FBS al 10%, 2 mM de L-glutamina, 200 U/mL de penicilina, 200 μg/mL de estreptomicina y 500 pg/mL de anfotericina B (ver Tabla de materiales) para preparar DMEM-S.

2. Disección y preparación de la médula espinal

1. Eutanasia del ratón con una sobredosis intraperitoneal de pentobarbital a una dosis de 150 mg/kg. Esterilizar el tórax y la espalda del ratón con etanol al 70%.
   NOTA: Confirme que la eutanasia fue exitosa antes de proceder con la disección con ratón.
2. Afeitar la región toracolumbar y fijar las extremidades a la tabla de disección con cinta adhesiva.
3. Con un bisturí, haga una incisión cuidadosa a lo largo de la línea media dorsal desde el occipital hasta la región sacra (Figura 2).
4. Con la ayuda de un microscopio quirúrgico estereoscópico, diseccionar en capas hasta llegar a la columna lumbar e identificar el último arco costal.
   NOTA: Los 13 arcos costales están articulados en las vértebras torácicas; cuando se disecan, se vuelven visibles superiores a la vértebra L1².
5. Determine la última vértebra cervical y el sacro, luego haga un corte para separar la columna vertebral (Figura 2).
6. Utilizando pinzas de disección, realice una laminectomía dorsal de las vértebras para extraer la médula espinal (Figura 3A-D).
   NOTA: A excepción de las dos primeras vértebras cervicales (atlas y axis), todas las vértebras móviles comparten un diseño morfológico común en varias regiones (cervical, torácica o lumbar). Cada vértebra móvil típica presenta un cuerpo vertebral cilíndrico en su extremo anterior. Unida a la parte posterior del cuerpo hay un arco óseo conocido como arco vertebral (arco neural), que consta de láminas y apófisis espinosas. Entre estas estructuras se encuentra el agujero vertebral¹⁵.
7. Extirpar los nervios que emergen a través de los forámenes (raíces dorsales y ventrales) que constituyen el sistema nervioso periférico y que pueden contener macrófagos infiltrados (Figura 3D).
   NOTA: No es necesario eliminar la piamadre o las meninges, ya que el medio de gradiente de densidad elimina eficazmente los astrocitos contaminantes. Además, la retención de las meninges reduce el tiempo de purificación y mejora la viabilidad.

3. Digestión tisular y aislamiento de la microglía

1. Coloque la médula espinal en la tabla de disección y, con unas tijeras Vannas, corte la médula espinal en trozos de 2 mm, obteniendo un promedio de 10 trozos.
2. Transfiera las secciones de la médula espinal a un microtubo de fondo plano de 2 ml (Figura 3E, F).
3. Añadir 1 ml de la solución de trabajo HBSS-LD (paso 1.2). Incubar a 37 °C durante 25 min, vórtice vigorosamente cada 5 min.
4. Pasar el contenido de cada digestión por un colador de 40 μm, y luego añadir 7 mL de HBSS con 2% de FBS para neutralizar la digestión.
5. Triture el tejido restante con un émbolo de jeringa de 1 ml. Centrifugar la suspensión en un tubo cónico de 50 ml durante 5 min a 220 x g, 4 °C.
6. Deseche el sobrenadante con una micropipeta de 1 mL y vuelva a suspender el gránulo en 2 mL de HBSS con FBS al 2% en un tubo cónico de 15 mL. Combinar con 2 mL de medio de gradiente de densidad isotónica al 90%. Centrifugar durante 25 min a 160 x g, 18 °C.
   NOTA: Utilice una aceleración lenta y evite usar el freno.
7. Utilice una pipeta de transferencia para recuperar la interfaz y transferirla a un tubo cónico de 15 ml. Lavar las células con 10 ml de PBS y centrifugar durante 5 min a 220 x g, 4 °C.
8. Vuelva a suspender las células en DMEM-S (paso 1.6) y manténgalas almacenadas en hielo.

4. Determinación de la pureza/viabilidad

1. Para cuantificar las células viables utilizando una cámara de hemocitómetro, emplee una tinción de azul de tripano al 0,4% (consulte la tabla de materiales).
   NOTA: En promedio, un solo ratón proporciona de 4 a 6 millones de células.
2. Para cuantificar las células viables a través de un citómetro de flujo, emplee la tinción con colorante fluorescente reactivo a las aminas disponible en el mercado (consulte la tabla de materiales).
   1. Transfiera 1 millón de células a un tubo de poliestireno de fondo redondo (FACS) de 5 ml. Diluir el colorante fluorescente con PBS en una proporción de 1:1000 (creando la solución de trabajo de viabilidad).
   2. Incubar las muestras con la solución de viabilidad en la oscuridad a 4 °C durante 30 min. Lave las celdas con PBS helado dos veces. Vuelva a suspender las células en 400 μL de tampón de tinción (paso 1.4).
   3. Bloquear las células con 2.4G2 anti-FcRIII/I (ver Tabla de Materiales) en el tampón de tinción helado durante 15 min a 4 °C.
   4. Formule el cóctel de tinción de anticuerpos añadiendo los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia CD45-PerCP y CD11b-eFluor 450 al tampón de tinción (a una dilución de 1:300) (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Si bien ambas técnicas están disponibles, elija la que mejor se alinee con el protocolo posterior.
   5. Incubar las muestras con el cóctel de tinción de anticuerpos en la oscuridad a 4 °C durante 30 min. Lave las células con tampón de tinción helado dos veces. Resuspender las células en 400 μL de tampón de tinción.
   6. Adquiera 250.000 eventos en un citómetro de flujo, como se describe en la estrategia de compuerta en el paso 6 (Figura 4).

5. Tinción inmunofluorescente

1. Coloque un cubreobjetos pretratado en un pocillo de una placa de 6 pocillos.
   NOTA: Para tratar los cubreobjetos, colóquelos en una placa de Petri con 500 μL de solución de L-polilisina (0,01 mg/mL, consulte la Tabla de Materiales) e incube durante 1 h. Después, lávalos tres veces con agua destilada y déjalos secar.
2. Siembre 200.000 células en el cubreobjetos tratado utilizando 500 μL de solución de DMEM-S. Incubar durante 24 h.
3. Retire los cubreobjetos y fije las celdas con paraformaldehído (PFA) al 3,7% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave los cubreobjetos tres veces con PBS helado.
4. Permeabilizar las células con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente, lave los cubreobjetos tres veces con PBS frío. Bloquee las células con 0,2% de BSA en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
5. Diluir los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia (con una dilución de 1:300, ver Tabla de Materiales) en la solución de bloqueo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Lave los cubreobjetos tres veces con PBS helado.
6. Aplique un medio de montaje que contenga DAPI en la guía y luego séllela con un cubreobjetos.
   NOTA: Los portaobjetos pueden analizarse inmediatamente con un microscopio de fluorescencia o confocal, o pueden almacenarse hasta 3 meses a -20 °C.

6. Estrategia de activación de la microglía de la médula espinal

1. Genere un diagrama de puntos y establezca una puerta para aislar células viables en función de la tinción de viabilidad y un canal fluorescente vacío¹⁶. Excluir las células no viables.
2. Produzca otro gráfico utilizando parámetros de dispersión frontal y lateral para eliminar los escombros¹⁶.
3. Desarrollar un diagrama de puntos adicional y analizar la expresión de CD11b y CD45 para diferenciar la microglía.

Resultados

Utilizando tejido de la médula espinal de ratón, la digestión enzimática se realizó utilizando una mezcla altamente enriquecida con colagenasa y termolisina. El tejido digerido resultante se sometió a un paso a través de un filtro de 40 μm para eliminar el material no digerido. Las células colectadas se enriquecieron a través de un gradiente de densidad de Percoll, con un 90% en la parte inferior y un 45% en la parte superior. A continuación, las células enriquecidas con microglía dentro de la interfaz se ti...

Discusión

Se han desarrollado numerosos protocolos para el estudio de la microglía debido a su importancia en la homeostasis cerebral. En estos métodos, la microglía se obtiene típicamente de los hemisferios cerebrales de ratas y ratones embrionarios o neonatos¹⁷. Un número limitado de estudios han abordado la purificación de la microglía de la médula espinal de ratones adultos^13,14. Estas técnicas implican la digestión enzimática utiliza...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining