Arricchimento rapido ed efficiente della microglia del midollo spinale del topo

Riepilogo

Le microglia sono considerate alcune delle cellule più versatili del corpo, capaci di adattamento morfologico e funzionale. La loro eterogeneità e multifunzionalità consente il mantenimento dell'omeostasi cerebrale, pur essendo legata a diverse patologie neurologiche. Qui viene descritta una tecnica per purificare la microglia del midollo spinale.

Abstract

La colonna vertebrale definisce un vertebrato e modella il canale spinale, una cavità che racchiude e protegge il midollo spinale. Il corretto sviluppo e la funzione del sistema nervoso centrale dei mammiferi dipendono in modo significativo dall'attività dei macrofagi residenti noti come microglia. Le microglia mostrano eterogeneità e multifunzionalità, consentendo un'espressione genica e un comportamento distinti all'interno del midollo spinale e del cervello. Numerosi studi hanno esplorato la funzione della microglia cerebrale, descrivendo in dettaglio i metodi di purificazione. Tuttavia, la purificazione della microglia dal midollo spinale nei topi manca di una descrizione completa. Al contrario, l'utilizzo di una collagenasi altamente purificata, al contrario di un estratto non raffinato, manca di segnalazione all'interno dei tessuti del sistema nervoso centrale. In questo studio, la colonna vertebrale e il midollo spinale sono stati asportati da topi C57BL/6 di 8-10 settimane. La successiva digestione ha impiegato una collagenasi altamente purificata e la purificazione della microglia ha utilizzato un gradiente di densità. Le cellule sono state sottoposte a colorazione per citometria a flusso, valutando la vitalità e la purezza attraverso la colorazione CD11b e CD45. I risultati hanno prodotto una vitalità media dell'80% e una purezza media del 95%. In conclusione, la manipolazione della microglia di topo ha comportato la digestione con una collagenasi altamente purificata, seguita da un gradiente di densità. Questo approccio ha effettivamente prodotto consistenti popolazioni di microglia del midollo spinale.

Introduzione

La caratteristica distintiva dei vertebrati è la colonna vertebrale o colonna vertebrale, in cui la notocorda è stata sostituita da una sequenza di ossa segmentate chiamate vertebre, divise da dischi intervertebrali. Questa successione di materiale osseo modella il canale spinale, una cavità che racchiude e protegge il midollo spinale¹. Nel genere Rodentia, la colonna vertebrale è solitamente formata da sette vertebre cervicali, tredici vertebre toraciche, sei vertebre lombari e un numero variabile di vertebre caudali ^2,3. La lunghezza del midollo spinale è simile a quella della colonna vertebrale e il filum terminale è una struttura non nervosa che ancora il midollo spinale all'osso sacro. Inoltre, le fibre nervose escono attraverso il forame intervertebrale¹.

Lo sviluppo e il corretto funzionamento del sistema nervoso centrale nei mammiferi dipendono in modo critico dall'attività dei macrofagi residenti nel sistema nervoso, chiamati microglia⁴. Sebbene le microglia siano state inizialmente descritte come fagociti residenti nel cervello, recenti ricerche hanno attribuito molte funzioni dinamiche a queste cellule ^5,6. La dimensione della microglia varia da 7 a 10 μm in omeostasi; Sono considerate tra le cellule più versatili dell'organismo e possono adattarsi morfologicamente e funzionalmente al loro ambiente in continua evoluzione⁷. Queste cellule mostrano un'elevata eterogeneità sia durante la fase embrionale che adulta^8,9, mentre nella fase adulta mostrano anche una complessa eterogeneità funzionale in base al loro contesto spazio-temporale¹⁰. L'eterogeneità e le molteplici funzioni della microglia consentono l'espressione genica differenziale e il comportamento nel midollo spinale e nel cervello. È stato dimostrato che l'espressione di CD11b, CD45, CD86 e CCR9 è maggiore nel midollo spinale rispetto al cervello ^8,9.

Esistono diversi protocolli per l'isolamento della microglia cerebrale^11,12; tuttavia, ne esistono solo pochi per la microglia del midollo spinale^13,14. L'ottimizzazione di un metodo per la purificazione della microglia dal midollo spinale facilita lo sviluppo di molteplici studi incentrati sulla scoperta della fisiologia della microglia. Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un'estrazione semplice e altamente riproducibile del midollo spinale di topo e la purificazione della microglia (Figura 1).

Protocollo

Lo studio è stato condotto in conformità con lo standard ufficiale messicano NOM-062-ZOO-1999 e la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. L'approvazione per lo studio è stata ottenuta dai Comitati di Ricerca, Etica e Biosicurezza dell'Ospedale Pediatrico del Messico (HIM/2023/006) e dal Comitato di Ricerca e Bioetica dell'Ospedale Generale del Messico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Tre topi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 8 settimane sono stati ottenuti dall'Ospedale Pediatrico del Messico, dove sono stati allevati in condizioni isolate in rack ventilati, in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali.

1. Preparazione dei materiali e dei reagenti

1. Preriscaldare il PBS privo di Ca 2+ e Mg²⁺ e la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 37 °C.
2. Integrare la soluzione di HBSS con 100 μg/mL di Liberase e 4 μg/mL di DNasi (HBSS-LD). Assicurarsi che la soluzione mantenga un pH fisiologico di 7,4.
   NOTA: Sarà necessario 1 mL di soluzione di lavoro per midollo spinale.
3. Preparare una soluzione isotonica al 90% per la centrifugazione in gradiente di densità (disponibile in commercio, vedere la tabella dei materiali) e preriscaldarla a 37 °C.
4. Preparare il tampone colorante combinando il siero fetale bovino inattivato al 5% (FBS) con PBS e conservare la miscela su ghiaccio.
5. Preriscaldare Dulbecco's Modified Eagle's Glucosio medio-alto (1 g/L) (DMEM) a 37 °C.
6. Integrare il terreno DMEM con il 10% di FBS, 2 mM di L-glutammina, 200 U/mL di penicillina, 200 μg/mL di streptomicina e 500 pg/mL di amfotericina B (vedere la tabella dei materiali) per preparare DMEM-S.

2. Dissezione e preparazione del midollo spinale

1. Sopprimere il topo con un sovradosaggio intraperitoneale di pentobarbital alla dose di 150 mg/kg. Sterilizza il torace e la schiena del topo usando etanolo al 70%.
   NOTA: Verificare che l'eutanasia sia andata a buon fine prima di procedere con la dissezione del topo.
2. Radere la regione toracolombare e fissare le estremità alla tavola di dissezione con nastro adesivo.
3. Usando un bisturi, praticare un'incisione accurata lungo la linea mediana dorsale dalla regione occipitale a quella sacrale (Figura 2).
4. Con l'ausilio di un microscopio operatorio stereoscopico, sezionare a strati fino a raggiungere la colonna lombare e identificare l'ultima arcata costale.
   NOTA: Le 13 arcate costali sono articolate nelle vertebre toraciche; una volta sezionati, diventano visibili superiormente alla vertebra^{L1 2}.
5. Determinare l'ultima vertebra cervicale e l'osso sacro, quindi praticare un taglio per separare la colonna vertebrale (Figura 2).
6. Utilizzando una pinza da dissezione, eseguire una laminectomia dorsale delle vertebre per estrarre il midollo spinale (Figura 3A-D).
   NOTA: Ad eccezione delle prime due vertebre cervicali (atlante e asse), tutte le vertebre mobili condividono un disegno morfologico comune in varie regioni (cervicale, toracica o lombare). Ogni tipica vertebra mobile presenta un corpo vertebrale cilindrico alla sua estremità anteriore. Attaccato alla parte posteriore del corpo c'è un arco osseo noto come arco vertebrale (arco neurale), costituito da lamine e processi spinosi. Tra queste strutture si trova il forame vertebrale¹⁵.
7. Rimuovere i nervi che emergono attraverso i forami (radici dorsali e ventrali) che costituiscono il sistema nervoso periferico e possono contenere macrofagi infiltrati (Figura 3D).
   NOTA: Non è necessario rimuovere la pia madre o le meningi poiché il mezzo a gradiente di densità elimina efficacemente gli astrociti contaminanti. Inoltre, il mantenimento delle meningi riduce il tempo di purificazione e migliora la vitalità.

3. Digestione tissutale e isolamento della microglia

1. Posizionare il midollo spinale sulla tavola da dissezione e, usando le forbici Vannas, tagliare il midollo spinale in pezzi di 2 mm, ottenendo una media di 10 pezzi.
2. Trasferire le sezioni del midollo spinale in una microprovetta a fondo piatto da 2 mL (Figura 3E,F).
3. Aggiungere 1 mL della soluzione di lavoro HBSS-LD (passaggio 1.2). Incubare a 37 °C per 25 min, vostrando energicamente ogni 5 min.
4. Passare il contenuto di ogni digestione attraverso un colino da 40 μm, quindi aggiungere 7 mL di HBSS con FBS al 2% per neutralizzare la digestione.
5. Frantumare il tessuto rimanente utilizzando uno stantuffo per siringa da 1 ml. Centrifugare la sospensione in una provetta conica da 50 mL per 5 minuti a 220 x g, 4 °C.
6. Scartare il surnatante utilizzando una micropipetta da 1 mL e risospendere il pellet in 2 mL di HBSS con FBS al 2% in una provetta conica da 15 mL. Combinare con 2 mL di terreno a gradiente di densità isotonica al 90%. Centrifugare per 25 minuti a 160 x g, 18 °C.
   NOTA: Utilizzare un'accelerazione lenta ed evitare di utilizzare il freno.
7. Utilizzare una pipetta di trasferimento per recuperare l'interfaccia e trasferirla in una provetta conica da 15 mL. Lavare le cellule con 10 mL di PBS e centrifugare per 5 minuti a 220 x g, 4 °C.
8. Risospendere le cellule in DMEM-S (passaggio 1.6) e conservarle sul ghiaccio.

4. Determinazione della purezza/vitalità

1. Per quantificare le cellule vitali utilizzando una camera emocitometrica, utilizzare un colorante blu di tripano allo 0,4% (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: In media, un singolo topo fornisce 4-6 milioni di cellule.
2. Per quantificare le cellule vitali tramite un citometro a flusso, utilizzare la colorazione fluorescente reattiva alle ammine disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
   1. Trasferire 1 milione di cellule in una provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL (FACS). Diluire il colorante fluorescente con PBS in un rapporto di 1:1000 (creando la soluzione di lavoro di vitalità).
   2. Incubare i campioni con la soluzione vitale al buio a 4 °C per 30 minuti. Lavare le celle con PBS ghiacciato due volte. Risospendere le cellule in 400 μL di tampone colorante (passaggio 1.4).
   3. Bloccare le cellule con 2.4G2 anti-FcRIII/I (vedere la tabella dei materiali) nel tampone di colorazione ghiacciato per 15 minuti a 4 °C.
   4. Formulare il cocktail di colorazione degli anticorpi aggiungendo gli anticorpi monoclonali marcati con fluorescenza CD45-PerCP e CD11b-eFluor 450 al tampone colorante (a una diluizione di 1:300) (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: Sebbene siano disponibili entrambe le tecniche, scegliere quella che meglio si allinea con il protocollo successivo.
   5. Incubare i campioni con il cocktail colorante anticorpale al buio a 4 °C per 30 minuti. Lavare due volte le cellule con tampone colorante ghiacciato. Risospendere le cellule in 400 μL di tampone colorante.
   6. Acquisire 250.000 eventi su un citometro a flusso, come descritto dalla strategia di gating nel passaggio 6 (Figura 4).

5. Colorazione immunofluorescente

1. Posizionare un vetrino coprioggetto pretrattato in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
   NOTA: Per trattare i vetrini coprioggetti, metterli in una capsula di Petri con 500 μL di soluzione di L-polilisina (0,01 mg/mL, vedere la tabella dei materiali) e incubare per 1 ora. Successivamente, lavali tre volte con acqua distillata e lasciali asciugare.
2. Seminare 200.000 cellule sul vetrino coprioggetto trattato utilizzando 500 μL di soluzione DMEM-S. Incubare per 24 ore.
3. Rimuovere i vetrini coprioggetti e fissare le celle con paraformaldeide (PFA) al 3,7% per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS ghiacciato.
4. Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS freddo. Bloccare le celle con BSA allo 0,2% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
5. Diluire gli anticorpi monoclonali marcati con fluorescenza (a una diluizione di 1:300, vedere la tabella dei materiali) nella soluzione bloccante e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS ghiacciato.
6. Applicare il mezzo di montaggio contenente DAPI sul vetrino, quindi sigillarlo con un vetrino coprioggetti.
   NOTA: I vetrini possono essere immediatamente analizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza o confocale, oppure possono essere conservati per un massimo di 3 mesi a -20°C.

6. Strategia di gating per la microglia del midollo spinale

1. Generare un dot plot e stabilire un gate per isolare le cellule vitali in base alla colorazione di vitalità e a un canale fluorescente vuoto¹⁶. Escludi le cellule non vitali.
2. Produrre un altro grafico utilizzando i parametri di dispersione in avanti e laterale per eliminare i detriti¹⁶.
3. Sviluppare un ulteriore dot plot e analizzare l'espressione di CD11b e CD45 per differenziare la microglia.

Risultati

Utilizzando il tessuto del midollo spinale di topo, la digestione enzimatica è stata eseguita utilizzando una miscela altamente arricchita con collagenasi e termolisina. Il tessuto digerito risultante è stato sottoposto a passaggio attraverso un filtro da 40 μm per eliminare il materiale non digerito. Le cellule raccolte sono state arricchite attraverso un gradiente di densità Percoll, con il 90% nella porzione inferiore e il 45% nella porzione superiore. Le cellule arricchite di microglia all'interno dell'interfacci...

Discussione

Numerosi protocolli sono stati sviluppati per lo studio della microglia a causa della loro importanza nell'omeostasi cerebrale. In questi metodi, le microglia provengono tipicamente dagli emisferi cerebrali di ratti e topi embrionali o neonatali¹⁷. Un numero limitato di studi ha affrontato la purificazione della microglia dal midollo spinale di topi adulti^13,14. Queste tecniche prevedono la digestione enzimatica utilizzando collagenasi e/o...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining