Enriquecimento rápido e eficiente da microglia medular de camundongos

Resumo

As microglias são consideradas algumas das células mais versáteis do organismo, capazes de adaptação morfológica e funcional. Sua heterogeneidade e multifuncionalidade possibilitam a manutenção da homeostase cerebral, além de estarem ligadas a diversas patologias neurológicas. Aqui, uma técnica para purificar a microglia da medula espinhal é descrita.

Resumo

A coluna vertebral define um vertebrado e molda o canal vertebral, uma cavidade que encerra e protege a medula espinhal. O desenvolvimento e a função adequados do sistema nervoso central de mamíferos dependem significativamente da atividade de macrófagos residentes conhecidos como microglia. A microglia apresenta heterogeneidade e multifuncionalidade, permitindo expressão gênica e comportamento distintos dentro da medula espinhal e do cérebro. Numerosos estudos têm explorado a função da microglia cerebral, detalhando extensivamente os métodos de purificação. No entanto, a purificação da micróglia da medula espinhal em camundongos carece de uma descrição abrangente. Em contraste, a utilização de uma colagenase altamente purificada, em oposição a um extrato não refinado, carece de relatos nos tecidos do sistema nervoso central. Neste estudo, a coluna vertebral e a medula espinhal foram excisadas de camundongos C57BL/6 com 8-10 semanas de idade. A digestão subsequente empregou uma colagenase altamente purificada, e a purificação da micróglia utilizou um gradiente de densidade. As células foram submetidas à coloração por citometria de fluxo, avaliando-se viabilidade e pureza através das colorações CD11b e CD45. Os resultados mostraram viabilidade média de 80% e pureza média de 95%. Em conclusão, a manipulação da micróglia de camundongos envolveu digestão com colagenase altamente purificada, seguida de gradiente de densidade. Essa abordagem efetivamente produziu populações substanciais de microglia medular.

Introdução

A característica definidora dos vertebrados é a coluna vertebral ou coluna vertebral, na qual a notocorda foi substituída por uma sequência de ossos segmentados chamados vértebras, divididos por discos intervertebrais. Essa sucessão de material ósseo forma o canal vertebral, uma cavidade que envolve e protege a medula espinhal¹. No gênero Rodentia, a coluna vertebral é geralmente formada por sete vértebras cervicais, treze vértebras torácicas, seis vértebras lombares e um número variável de vértebras^caudais2,3. O comprimento da medula espinhal é semelhante ao da coluna vertebra....

Protocolo

O estudo foi conduzido de acordo com a norma oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999 e o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório. O estudo foi aprovado pelos Comitês de Pesquisa, Ética e Biossegurança do Hospital Infantil do México (HIM/2023/006) e do Comitê de Pesquisa e Bioética do Hospital Geral do México Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Três camundongos C57BL/6 com idades entre 6 e 8 semanas foram obtidos do Hospital Infantil do México, onde foram criados em condições isoladas em racks ventilados, de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados e uso de animais.

1. Preparação de materiais e reagentes

Discussão

Inúmeros protocolos têm sido desenvolvidos para o estudo da micróglia devido à sua importância na homeostase cerebral. Nesses métodos, as microglias são tipicamente originadas dos hemisférios cerebrais de ratos embrionários ou neonatais e camundongos¹⁷. Um número limitado de estudos abordou a purificação da micróglia da medula espinhal de camundongos adultos^13,14. Essas técnicas envolvem digestão enzimática usando colagenas.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining