التصوير في الوقت الحقيقي لديناميات الكالسيوم الأكروسومي والإخراج الخلوي في المنوية للفأر الحي

Summary

يوفر نموذج الفأر AcroSensE وطرق تصوير الخلايا الحية الموصوفة هنا نهجا جديدا لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في المقصورة تحت الخلوية للحيوانات المنوية القمية وكيفية تنظيمها للخطوات الوسيطة التي تؤدي إلى اندماج الغشاء وكثرة الخلايا القمي.

Abstract

الإخراج الخلوي القمي (AE) ، حيث تندمج الحويصلة الخارجية المفردة للحيوانات المنوية مع غشاء البلازما ، هي عملية معقدة تعتمد على الكالسيوم ضرورية للتخصيب. ومع ذلك ، فإن فهمنا لكيفية تنظيم إشارات الكالسيوم AE لا يزال غير مكتمل. على وجه الخصوص ، التفاعل بين ديناميكيات الكالسيوم داخل الأكروسوم والخطوات الوسيطة المؤدية إلى AE غير محدد جيدا. هنا ، نصف طريقة توفر رؤى مكانية وزمانية لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية وعلاقتها باندماج الغشاء والإخراج الخلوي اللاحق للحويصلة القمي. تستخدم الطريقة فأرا جديدا معدلا وراثيا يعبر عن مستشعر يستهدف Acrosome للإخراج الخلوي (AcroSensE). يجمع المستشعر بين مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (GCaMP) المنصهر مع mCherry. تم تصميم بروتين الاندماج هذا خصيصا لتمكين المراقبة المتزامنة لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية وأحداث اندماج الغشاء. يتم تحقيق المراقبة في الوقت الفعلي لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية و AE في المنوية الحية AcroSensE باستخدام مزيج من التصوير بمعدل إطارات مرتفع ونظام توصيل المنشطات الذي يمكن أن يستهدف المنوية المفردة. يوفر هذا البروتوكول أيضا العديد من الأمثلة على الطرق الأساسية لتحديد وتحليل البيانات الأولية. نظرا لأن نموذج AcroSensE مشفر وراثيا ، يمكن زيادة أهميته العلمية باستخدام الأدوات الجينية المتاحة بسهولة ، مثل التهجين مع النماذج الجينية الأخرى للفئران أو الأساليب القائمة على تحرير الجينات (CRISPR). باستخدام هذه الاستراتيجية ، يمكن حل أدوار مسارات الإشارات الإضافية في سعة المنوية والإخصاب. باختصار ، توفر الطريقة الموضحة هنا أداة ملائمة وفعالة لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في حجرة تحت خلوية محددة - الجسيم القمي للحيوانات المنوية - وكيف تنظم هذه الديناميات الخطوات الوسيطة التي تؤدي إلى اندماج الغشاء وكثرة الخلايا القمي.

Introduction

تكتسب المنوية القدرة على الإخصاب أثناء عملية تسمى السعة¹. إحدى نقاط النهاية لهذه العملية هي أن المنوية تكتسب القدرة على الخضوع ل AE. أكثر من عقدين من البيانات تدعم وجود نموذج معقد متعدد الخطوات من AE في المنوية للثدييات (ملخصة في^2،3). ومع ذلك ، فإن دراسة AE في المنوية الحية أمر صعب ، والطرق المتاحة حاليا لمراقبة هذه العملية بدقة كافية مرهقة وتتطلب خطوات تحضير متعددة⁴ ، وتقتصر على اكتشاف الخطوة الأخيرة من AE (على سبيل المثال ، باستخدام PNA⁵) ، تقتصر على قياسات التغيرات في الكالسيوم الخلوي (على عكس ديناميكيات الكالسيوم الأكروسومي) ، أو تقتص....

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموجب المبادئ التوجيهية ووافقت عليها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة كورنيل (# 2002-0095). تم استخدام الفئران AcroSensE² البالغة من العمر 8-10 أسابيع في الدراسة الحالية. يمكن تقديم طلبات الحصول على معلومات حول توافر الفئران AcroSensE إلى المؤلف المقابل.

1. جمع المنوية وغسلها

1. جمع المنوية الذيلية البربخية (يتم توفير مزيد من التفاصيل حول هذا الإجراء في¹¹) من الفئران AcroSensE. اترك 15 دقيقة في طبق زراعة الأنسجة 3.5 سم يحتوي على 0.5 مل من وسط ويتن المعدل (MW) عند 37 درجة مئوية. يجب تغطية الطبق لتقليل تبخر MW ، ويجب إمالته بحيث يكو....

النتائج

يقدم الشكل 2 توضيحا مبسطا يوضح تتابع التغيرات الفلورية المتوقعة بعد التحفيز الناجح للحيوانات المنوية. توضح اللوحة العلوية من الشكل 2 التغيرات في شدة مضان GCaMP3 ، حيث تكون الإشارة خافتة في البداية (تركيزات الكالسيوم الأكروسومية الأساسية أقل من GCaMP3 KD) ، وعند دخ.......

Discussion

هنا ، يتم وصف طريقة قائمة على الفحص المجهري لاستخدام نموذج الماوس AcroSensE الذي تم إنشاؤه حديثا للمراقبة في الوقت الفعلي أحادي الخلية وتحليل التفاعل بين ديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية والخطوات الوسيطة المؤدية إلى AE. جنبا إلى جنب مع الأساليب الجينية المتاحة بسهولة ، مثل التهجين مع النماذج.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III