Imaging in tempo reale della dinamica del calcio acrosomiale e dell'esocitosi in spermatozoi di topo vivi

Riepilogo

Il modello murino AcroSensE e i metodi di imaging di cellule vive qui descritti forniscono un nuovo approccio allo studio della dinamica del calcio nel compartimento subcellulare dell'acrosoma spermatico e di come regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all'esocitosi dell'acrosoma.

Abstract

L'esocitosi acrosomica (AE), in cui la singola vescicola esocitotica dello spermatozoo si fonde con la membrana plasmatica, è un processo complesso e calcio-dipendente essenziale per la fecondazione. Tuttavia, la nostra comprensione di come la segnalazione del calcio regoli l'AE è ancora incompleta. In particolare, l'interazione tra la dinamica del calcio intra-acrosomiale e le fasi intermedie che portano all'AE non è ben definita. Qui, descriviamo un metodo che fornisce approfondimenti spaziali e temporali sulla dinamica del calcio acrosomiale e sulla loro relazione con la fusione di membrana e la successiva esocitosi della vescicola acrosomiale. Il metodo utilizza un nuovo topo transgenico che esprime un sensore per l'esocitosi mirato all'acrosoma (AcroSensE). Il sensore combina un indicatore di calcio geneticamente codificato (GCaMP) fuso con mCherry. Questa proteina di fusione è stata specificamente progettata per consentire l'osservazione simultanea della dinamica del calcio acrosomiale e degli eventi di fusione della membrana. Il monitoraggio in tempo reale della dinamica del calcio acrosomiale e dell'AE negli spermatozoi vivi AcroSensE si ottiene utilizzando una combinazione di imaging ad alta frequenza di fotogrammi e un sistema di somministrazione stimolante in grado di colpire singoli spermatozoi. Questo protocollo fornisce anche diversi esempi di metodi di base per quantificare e analizzare i dati grezzi. Poiché il modello AcroSensE è geneticamente codificato, il suo significato scientifico può essere aumentato utilizzando strumenti genetici prontamente disponibili, come l'incrocio con altri modelli genetici murini o metodi basati sull'editing genetico (CRISPR). Con questa strategia, è possibile risolvere il ruolo di ulteriori vie di segnalazione nella capacitazione e nella fecondazione degli spermatozoi. In sintesi, il metodo qui descritto fornisce uno strumento conveniente ed efficace per studiare la dinamica del calcio in uno specifico compartimento subcellulare - l'acrosoma spermatico - e come tali dinamiche regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all'esocitosi dell'acrosoma.

Introduzione

Gli spermatozoi acquisiscono la capacità di fecondare durante un processo chiamato capacitazione¹. Un endpoint di questo processo è che gli spermatozoi acquisiscono la capacità di sottoporsi a AE. Oltre due decenni di dati supportano la presenza di un modello complesso e multi-step di AE negli spermatozoi dei mammiferi (riassunto in ^2,3). Tuttavia, lo studio dell'AE negli spermatozoi vivi è impegnativo e i metodi attualmente disponibili per monitorare questo processo con una risoluzione adeguata sono ingombranti e richiedono più fasi di preparazione⁴, sono limitati al rilevamento della fase finale dell'AE (ad esempio, utilizzando PNA⁵), sono limitati alle misurazioni dei cambiamenti nel calcio citosolico (in contrasto con la dinamica del calcio acrosomiale), o sono limitati alle misurazioni della dinamica del calcio citosolico o dell'AE⁶.

Per superare alcuni dei limiti chiave degli studi di eventi avversi in tempo reale in condizioni fisiologiche e per consentire lo studio dell'interazione tra la dinamica del calcio e l'evento avverso, è stato generato un modello murino unico. In questo modello murino, una proteina di fusione composta dal sensore Ca²⁺ geneticamente codificato (GCaMP3) e mCherry viene espressa e indirizzata all'acrosoma utilizzando un promotore dell'acrosina e un peptide^{di segnalazione 2}. Il doppio sensore GCaMP3-mCherry consente di misurare simultaneamente in tempo reale le concentrazioni di calcio e lo stato del contenuto acrosomiale negli spermatozoi vivi in condizioni fisiologiche utilizzando la microscopia e un sistema di somministrazione di stimolanti a singola cellula (Figura 1). Come componente della matrice acrosomiale, la fusione della membrana e l'AE comporterebbero la perdita della fluorescenza fotostabile e insensibile al pH mCherry dallo sperma, poiché questa proteina si diffonde fuori dalla vescicola acrosomiale. A questo proposito, la capacità del modello di riflettere la tempistica e l'occorrenza dell'AE è simile ai benefici della linea^murina GFP mirata all'acrosoma ^7,8,9.

La variante GCaMP3 utilizzata in questa linea di topi transgenici ha un KD approssimativo di 400 μM e un intervallo dinamico per Ca²⁺ di 10-4-10-3 M¹⁰, che è adatto a questa vescicola. Abbiamo dimostrato che questa combinazione di caratteristiche di GCaMP3 potrebbe rivelare la formazione di pori di fusione tra la membrana plasmatica e la membrana acrosomiale esterna (OAM)². Il rilevamento dei pori di fusione è il risultato del fatto che la dimensione dei pori è troppo piccola per consentire alla proteina AcroSensE di disperdersi fuori dall'acrosoma (attraverso la perdita di contenuto dell'acrosoma), fornendo al contempo un "canale" di membrana che consente l'afflusso di ioni Ca²⁺ nel lume dell'acrosoma, portando ad un aumento dell'intensità di fluorescenza del GCaMP3.

La proteina fluorescente mCherry, luminosa, monomerica e non sensibile al calcio, supporta la visualizzazione dell'acrosoma mentre il segnale GCaMP3 è debole (ad esempio, prima del legame con Ca²⁺ , Figura 2) e, soprattutto, consente anche l'identificazione di spermatozoi intatti dell'acrosoma adatti per l'imaging.

Il seguente protocollo descrive l'utilizzo dell'esclusivo modello murino AcroSensE e i metodi per la microscopia utilizzati sperimentalmente per studiare la dinamica degli eventi avversi e del calcio degli spermatozoi con un'elevata risoluzione spaziale e temporale.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le linee guida e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Cornell University (#2002-0095). Per il presente studio sono stati utilizzati topi AcroSensE² di 8-10 settimane. Le richieste di informazioni sulla disponibilità dei topi AcroSensE possono essere inoltrate all'autore corrispondente.

1. Raccolta e lavaggio degli spermatozoi

1. Raccogliere gli spermatozoi dell'epididimo della cauda (maggiori dettagli su questa procedura sono forniti in¹¹) da topi AcroSensE. Lasciare la procedura di swim-out di 15 minuti in una piastra di coltura tissutale da 3,5 cm contenente 0,5 mL di terreno di Whitten modificato (MW) a 37 °C. La piastra deve essere coperta per ridurre l'evaporazione del MW e deve essere inclinata in modo che il mezzo abbia una profondità sufficiente per coprire la cauda epididimi.
   NOTA: Il terreno di Whitten modificato (MW) include 22 mM di HEPES, 1,2 mM di MgCl₂, 100 mM di NaCl, 4,7 mM di KCl, 1 mM di acido piruvico, 4,8 mM di sale di acido lattico hemi-Ca²⁺ , pH 7,35. Il glucosio (5,5 mM), il NaHCO₃ (10 mM) e la 2-idrossipropil--ciclodestrina (CD; 3 mM) sono integrati (vedi Tabella dei materiali) secondo necessità per l'induzione della capacitazione e le concentrazioni possono essere modificate per esperimenti specifici. Inoltre, accettori di steroli alternativi potrebbero essere utilizzati al posto della CD (ad esempio, albumina sierica bovina o lipoproteine ad alta densità).
2. Utilizzando una pinza fine, rimuovere l'eventuale tessuto dell'epididimo dalla capsula di raccolta swim-out. Trasferire il terreno contenente lo sperma in una provetta conica da 15 mL e centrifugare la sospensione a 100 x g per 1 minuto in un rotore a secchiello oscillante a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta di plastica, rimuovere il surnatante MW contenente lo sperma da eventuali detriti di tessuto grossolano che si saranno pellettati in questa fase.
3. Portare il surnatante MW contenente gli spermatozoi ad un volume totale di 3 mL aggiungendo MW a 37 °C. Centrifugare a 400 x g per 8 minuti (a temperatura ambiente) in una provetta a fondo tondo. Rimuovere lentamente il surnatante di MW dallo sperma debolmente pellettato.
4. Se vitale, lo sperma dovrebbe apparire come una pallina dall'aspetto "soffice". Risospendere delicatamente lo sperma mediante triturazione con una pipetta di trasferimento di grande diametro o tramite delicati picchietti manuali sulla provetta ("finger flicking"). Una volta risospesi in modo uniforme, trasferirli in un nuovo tubo a fondo tondo. Utilizzare 10-20 μL di sospensione spermatica per contare e valutare la motilità. Diluire gli spermatozoi in MW per l'uso.
   NOTA: Per la maggior parte degli esperimenti che coinvolgono la capacitazione degli spermatozoi di topo, viene utilizzata una concentrazione finale di 5-10 milioni di spermatozoi/mL MW. Il protocollo di imaging qui descritto non richiede la capacitazione degli spermatozoi, sebbene sia necessario che gli spermatozoi acquisiscano la capacità di subire l'esocitosi dell'acrosoma fisiologicamente rilevante. Si potrebbe studiare l'esocitosi patologica o l'esocitosi indotta attraverso reagenti come uno ionoforo di calcio senza capacitare lo sperma. Inoltre, si potrebbero esplorare i potenziali cambiamenti nel calcio acrosomiale nelle cellule non capacitate in risposta a vari stimoli.
5. Utilizzare gli spermatozoi entro 3-5 ore dal prelievo, mantenendo il tempo il più breve possibile e coerente tra le prove sperimentali.
6. Eseguire tutte le fasi di raccolta e lavaggio a 37 °C utilizzando un mezzo MW, impiegando metodi per ridurre al minimo i danni alla membrana. Ciò include l'uso di pipette di trasferimento in plastica di grande diametro o puntali per pipette a orifizio largo, che sono raccomandati per l'uso durante tutte le fasi della procedura.

2. Rivestimento in poli-D-lisina di piastre coprioggetti per imaging

NOTA: I piatti a base di poli-D-lisina (PDL) devono essere preparati freschi prima di ogni esperimento.

1. Erogare una gocciolina da 0,5 μL di PDL (0,5 mg/mL, vedere Tabella dei materiali) al centro di un vetrino coprioggetto.
2. Utilizzando una punta graduata da 10 μL, spalmare la gocciolina PDL sul vetrino coprioggetto (schema incrociato come mostrato nella Figura 1B).
3. Lasciare asciugare a 37 °C per 10 min. Tenere le stoviglie rivestite in PDL coperte e a 37 °C fino all'uso.

3. Trazione capillare, caricamento per sbuffo

1. Tirare i capillari in vetro borosilicato (D.E., 2 mm, D.I., 1.56 mm, vedere la tabella dei materiali) utilizzando le seguenti impostazioni: Calore: 330, Tirare: 250, Velocità: 250 e Tempo: 70. Questo passaggio deve essere ottimizzato per l'estrattore specifico in uso.
2. Prima di ogni esperimento, caricare un singolo capillare con la soluzione stimolante contenente 3-5 volte la concentrazione dello stimolante (per tenere conto della rapida diffusione della soluzione durante la boccata). Prima di riempire, utilizzare una pinzetta fine per aprire la punta capillare a circa 1-2 mm dall'estremità. Questo dovrebbe produrre un diametro di apertura di ∼5 μm. Non è necessaria la lucidatura a caldo.
3. Utilizzando una sottile pipetta di trasferimento in plastica, iniettare lentamente la soluzione stimolante nel capillare fino a riempire i tre quarti della sua lunghezza.
4. Rimuovere eventuali bolle d'aria formatesi durante il riempimento muovendo delicatamente il capillare.
5. Montare il capillare riempito sul micromanipolatore (vedi Tabella dei materiali).

4. Preparazione dell'erogazione della stimolazione per il soffio

NOTA: Per ridurre al minimo il rischio di lesioni all'utente, è necessario indossare occhiali di sicurezza durante l'operazione della procedura di sbuffo.

1. Impostare le impostazioni del sistema di erogazione a cella singola per fornire un impulso di 10 s a 5 psi.
2. Collegare il capillare in borosilicato al portapipetta del sistema di erogazione a cella singola. Assicurarsi che le guarnizioni siano ermetiche.
3. Osservando la punta capillare, applicare un breve soffio di 2 s a 20 psi per assicurarsi che la soluzione venga effettivamente erogata attraverso l'estremità della punta (una piccola goccia dovrebbe essere evidente all'estremità della punta).

5. Microscopia e acquisizione di immagini

NOTA: Sono disponibili e possono essere utilizzati microscopi di diverse marche; Tuttavia, è auspicabile un frame rate minimo di 3 fotogrammi/s. Per quanto riguarda la temperatura e il controllo ambientale, si prega di notare che la temperatura effettiva del mezzo nel piatto deve essere confermata, ad esempio, utilizzando un termometro a infrarossi senza contatto.

1. Aggiungere 80 μL di spermatozoi diluiti al centro di un vetrino coprioggetti da 35 mm rivestito in poli-D-lisina. Per la maggior parte degli esperimenti che coinvolgono la capacitazione degli spermatozoi di topo, viene utilizzata una concentrazione finale di 5-10 milioni di spermatozoi/mL.
2. Aggiungere lentamente allo sperma 3 mL di terreno di base caldo (37 °C) MW integrato con 10 mM di CaCl₂.
   NOTA: Si potrebbero eseguire esperimenti a temperatura ambiente per rallentare i processi cellulari, ma è importante notare che, poiché la capacitazione è mediata dagli scambi lipidici e dalla fluidità dei micro e macro domini, è necessario tenere presente che la capacitazione fisiologicamente rilevante e l'esocitosi dell'acrosoma sono processi dipendenti dalla temperatura.
3. Montare la capsula con lo sperma sul microscopio (preriscaldato a 37 °C).
4. Eccita il GCaMP3 utilizzando una linea laser da 488 nm e visualizza con un filtro passa-banda (BP) da 505-550 nm. Eccita l'mCherry utilizzando una linea laser da 555 nm e visualizza con un filtro BP da 575-615 nm.
5. Utilizzando un micromanipolatore (si consiglia di fissare il manipolatore al tavolo d'aria su cui è stato installato il microscopio), posizionare la punta del capillare a circa 100 μm di lato e 5-10 μm sopra il piano della cella di interesse.
   NOTA: Le soluzioni stimolanti sono prodotte a 3-5 volte la concentrazione normale per compensare la rapida diffusione che si verifica nel volume tra il capillare e la cellula.
6. Avviare la sequenza di imaging al microscopio.
7. Immagine di spermatozoi a una frequenza di fotogrammi elevata, preferibilmente >10 fotogrammi/s. In questo caso, è stato utilizzato uno scanner risonante che consente l'imaging a 33 ms/fotogramma.
8. Dieci secondi dopo aver avviato l'acquisizione dell'immagine al microscopio, attivare il sistema di rilascio a cellula singola per avviare il soffio di 10 secondi di stimolante.
9. Celle di immagine per una durata di 10-15 min.
10. Utilizzando il sistema di somministrazione a cella singola, è possibile acquisire l'immagine di più cellule da una singola parabola in base alle posizioni fornite nella Figura 1B.
    NOTA: Gli spermatozoi non trattati/non stimolati al microscopio dovrebbero apparire per lo più rossi, con una bassa intensità del segnale verde. Le teste degli spermatozoi devono essere attaccate al vetrino coprioggetti e gli spermatozoi vivi possono essere identificati dalle loro code in movimento. Negli spermatozoi sottoposti a AE, il segnale verde GCaMP3 inizialmente aumenta e sia il segnale rosso mCherry che il segnale verde GCaMP3 scompaiono se l'AE è completa, come illustrato nella Figura 2. La riduzione della fluorescenza mCherry fornisce un indicatore più specifico del momento in cui inizia l'AE perché i cambiamenti nelle concentrazioni di Ca²⁺ causeranno continuamente cambiamenti nell'intensità della fluorescenza GCaMP3.

6. Analisi delle immagini e dei dati

NOTA: L'analisi delle immagini offline viene eseguita utilizzando ImageJ (vedere Tabella dei materiali). In precedenza, sono stati riportati diversi passaggi intermedi nel processo che porta all'AE, tra cui l'aumento acrosomiale del calcio (ACR) e la fusione completa della membrana. Quest'ultimo porta alla perdita di fluorescenza mCherry e quindi rappresenta un AE completo. In alcune cellule, si osservano segnali simili agli eventi pre-spike foot (PSF) quando si utilizzano approcci amperometrici negli studi di esocitosi (per maggiori dettagli, vedere²). Sono disponibili diversi metodi opzionali per analizzare i dati grezzi di AcroSensE per quantificare ACR, AE e i relativi passaggi intermedi. Di seguito vengono descritti alcuni dei metodi analitici di base.

1. A seconda dell'estensione specifica del file di sistema del microscopio, utilizzare lo strumento Dividi canale (Immagine > Colori > Dividi canali) per generare finestre individuali per i canali GCaMP3 e mCherry.
2. Sincronizza le singole finestre utilizzando lo strumento "Sincronizza finestra" (Analizza > Strumenti > Sincronizza finestre).
3. Selezionare una regione di interesse (ROI) attorno alla testa dello spermatozoo nel canale rosso per includere la regione dell'acrosoma (Figura 3A,B). Lo strumento di sincronizzazione consente di applicare automaticamente la stessa selezione dell'area sul canale verde, in cui gli spermatozoi sono ancora troppo deboli per essere visibili.
4. Scegli il plug-in "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) o "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) per tracciare la variazione dell'intensità della fluorescenza in funzione dei fotogrammi/tempo per ciascuno dei due canali.
5. Copiare i dati in un software per fogli di calcolo (ad esempio, Microsoft Excel) per la creazione di grafici e ulteriori analisi.
   NOTA: una volta copiati i dati in un foglio di calcolo, è possibile estrarre più parametri per l'analisi, inclusi i seguenti, come illustrato nella Figura 4.
   1. Tempo di inizio del poro di fusione (FP): misura il tempo dal punto di tempo 0 al punto di tempo in cui il segnale GCaMP3 inizia a salire. Questo parametro indica il ritardo tra la stimolazione e la risposta ACR degli spermatozoi.
   2. Ora di inizio AE: misura il tempo dal punto di tempo 0 al punto di tempo in cui il segnale mCherry inizia a decadere. Questo parametro indica il ritardo tra la stimolazione e la risposta AE degli spermatozoi. Questo parametro potrebbe anche essere utilizzato per calcolare il ritardo tra la formazione di FP e la risposta AE.
   3. Ampiezza FP di picco: misura il segnale di fluorescenza dalla base al picco dell'aumento del segnale GCaMP3. Questo parametro indica l'aumento totale della risposta del Registro Azure Container.
   4. Tasso di perdita di mCherry: determinare questo parametro mediante un adattamento lineare o esponenziale sulla sezione della perdita di segnale di mCherry (come indicato da "pendenza" nella Figura 4B).
      NOTA: In alternativa, determinare il tasso di decadimento con il metodo del segnale residuo (R) in vari punti temporali (ad es. R60: tempo di durata in secondi a un segnale residuo del 60% dalla linea di base del segnale mCherry). Questo parametro può essere utilizzato per quantificare la velocità con cui il contenuto acrosomiale viene disperso durante l'AE.
   5. Diminuzione del segnale per la perdita di mCherry: determinare la differenza di ampiezza tra l'intensità di fluorescenza di mCherry al basale e il segnale successivo all'AE. Questo parametro indica la quantità totale di contenuto acrosomiale disperso su AE.
   6. Tracciare le variazioni di fluorescenza (F) per entrambi i canali rosso e verde come dati grezzi, oppure normalizzarle in base alla fluorescenza iniziale (F0) ed esprimerle come ΔF/F0. Quest'ultimo fornisce una migliore visualizzazione delle variazioni sia in rosso che in verde su un singolo grafico (ad esempio, vedere la Figura 3D e la Figura 3H).
      NOTA: Infine, i diversi parametri misurati possono essere confrontati tra diverse condizioni per determinare la relazione tra le variazioni della concentrazione acrosomiale di calcio e l'AE. Per esempi di vari confronti di condizioni sperimentali, vedere il riferimento².

Risultati

La Figura 2 fornisce un'illustrazione semplificata che mostra la sequenza di cambiamenti di fluorescenza previsti dopo la stimolazione riuscita degli spermatozoi. Il pannello superiore della Figura 2 illustra i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza GCaMP3, dove il segnale è inizialmente debole (le concentrazioni di calcio acrosomiale al basale sono inferiori a GCaMP3 KD) e all'ingresso di ioni calcio attraverso i pori di fusione, la fluorescen...

Discussione

Qui, viene descritto un metodo basato sulla microscopia per utilizzare il modello murino AcroSensE appena generato per il monitoraggio in tempo reale di una singola cellula e l'analisi dell'interazione tra la dinamica del calcio acrosomiale e i passaggi intermedi che portano all'AE. Insieme ad approcci genetici prontamente disponibili, come l'incrocio con altri modelli genetici murini o l'editing genetico, questo modello e metodo forniscono un potente sistema per studiare il ruolo di vari componenti e percorsi che prendo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III