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Resumo

O modelo de camundongo AcroSensE e os métodos de imagem de células vivas descritos aqui fornecem uma nova abordagem para estudar a dinâmica do cálcio no compartimento subcelular do acrossoma espermático e como eles regulam etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e exocitose acrossomal.

Resumo

A exocitose acrossômica (AE), na qual a única vesícula exocitótica do espermatozoide se funde com a membrana plasmática, é um processo complexo, cálcio-dependente, essencial para a fecundação. No entanto, nossa compreensão de como a sinalização do cálcio regula o EA ainda é incompleta. Em particular, a interação entre a dinâmica intra-acrossomal do cálcio e as etapas intermediárias que levam ao EA não é bem definida. Aqui, descrevemos um método que fornece informações espaciais e temporais sobre a dinâmica do cálcio acrossomal e sua relação com a fusão de membrana e subsequente exocitose da vesícula acrossomal. O método utiliza um novo camundongo transgênico expressando um sensor para exocitose (AcroSensE) direcionado a um acrossoma. O sensor combina um indicador de cálcio codificado geneticamente (GCaMP) fundido com mCherry. Esta proteína de fusão foi projetada especificamente para permitir a observação simultânea da dinâmica do cálcio acrossomal e eventos de fusão de membrana. O monitoramento em tempo real da dinâmica do cálcio acrossomal e AE em espermatozoides vivos AcroSensE é obtido usando uma combinação de imagens de alta taxa de quadros e um sistema de entrega de estimulantes que pode atingir um único espermatozoide. Este protocolo também fornece vários exemplos de métodos básicos para quantificar e analisar os dados brutos. Como o modelo AcroSensE é codificado geneticamente, seu significado científico pode ser aumentado usando ferramentas genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou métodos baseados em edição genética (CRISPR). Com essa estratégia, os papéis de vias de sinalização adicionais na capacitação e fertilização espermática podem ser resolvidos. Em resumo, o método descrito aqui fornece uma ferramenta conveniente e eficaz para estudar a dinâmica do cálcio em um compartimento subcelular específico - o acrossoma espermático - e como essas dinâmicas regulam as etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e à exocitose acrossomal.

Introdução

Os espermatozoides adquirem a capacidade de fecundar durante um processo chamado capacitação1. Um ponto final desse processo é que os espermatozoides adquirem a capacidade de sofrer EA. Mais de duas décadas de dados suportam a presença de um modelo complexo e de várias etapas de EA em espermatozoides de mamíferos (resumido em 2,3). No entanto, estudar EA em espermatozoides vivos é um desafio, e os métodos atualmente disponíveis para monitorar esse processo com resolução adequada são complicados e requerem várias etapas de preparação4, são limitados à detecção da ....

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Cornell (#2002-0095). Camundongos AcroSensE2 com 8-10 semanas de idade foram utilizados para o presente estudo. Pedidos de informação sobre a disponibilidade dos ratos AcroSensE podem ser submetidos ao autor correspondente.

1. Coleta e lavagem de espermatozoides

  1. Coletar espermatozoides epididimais caudais (mais detalhes sobre este procedimento são fornecidos em11) de camundongos AcroSensE. Permitir 15 mi....

Resultados Representativos

A Figura 2 fornece uma ilustração simplificada mostrando a sequência de mudanças de fluorescência esperadas após a estimulação bem-sucedida dos espermatozoides. O painel superior da Figura 2 ilustra as mudanças na intensidade da fluorescência do GCaMP3, onde o sinal é inicialmente fraco (as concentrações basais de cálcio acrossomal são menores que o GCaMP3 KD), e na entrada de íons cálcio através dos poros de fusão, a fluorescência a.......

Discussão

Aqui, um método baseado em microscopia é descrito para utilizar o modelo de camundongo AcroSensE recém-gerado para monitoramento em tempo real, de célula única e análise da interação entre a dinâmica do cálcio acrossomal e as etapas intermediárias que levam ao EA. Juntamente com abordagens genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou edição de genes, este modelo e método fornecem um sistema poderoso para estudar o papel de vários componentes e vias qu.......

Divulgações

Não há conflitos de interesse a relatar relacionados a este trabalho.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health R01-HD093827 e R03-HD090304 (A.J.T).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100x oil objective Olympus JapanUPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin SigmaC0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thicknessMatTek Corp. P35G-1.5-20-C 
5 mL round-bottomed tubeFalcon352054
Borosilicate glass capilarriesSutter Instrument Co. CA USAB200-156-10
CaCl2SigmaC4901
Confocal microscopeOlympus JapanOlympus FluoView 
Glucose SigmaG7528
Graduated tip TipOne, USA Scientific
HEPESSigmaH7006
ImageJ National Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KClSigmaP9541
Lactic acidSigmaG5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems TOKAI HIT Shizuoka, JapanModel STX
MgCl2SigmaM8266
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. CA USAModel P-97
NaClSigmaS3014
NaHCO3SigmaS6297
Plastic transfer pipette FisherBrand 13-711-6M
Poly-D-lysine SigmaP7280
Pyruvic acidSigma107360
Single cell delivery systemParker, Hauppauge, NYPicospritzer III

Referências

  1. Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
  2. Cohen, R., et al. A genetically targeted senso....

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