活小鼠精子顶体钙动力学和胞吐作用的实时成像

摘要

这里描述的AcroSensE小鼠模型和活细胞成像方法为研究精子顶体亚细胞区室中的钙动力学以及它们如何调节导致膜融合和顶体胞吐作用的中间步骤提供了一种新方法。

摘要

顶体胞吐作用 （AE） 是精子的单个胞吐囊泡与质膜融合，是一个复杂的、依赖钙的过程，对受精至关重要。然而，我们对钙信号转导如何调节 AE 的理解仍然不完整。特别是，顶体内钙动力学与导致 AE 的中间步骤之间的相互作用尚不明确。在这里，我们描述了一种方法，该方法提供了对顶体钙动力学及其与膜融合和随后顶体囊泡胞吐作用的关系的空间和时间见解。该方法利用一种新型转基因小鼠，表达顶体靶向胞吐传感器（AcroSensE）。该传感器结合了与 mCherry 融合的基因编码钙指示剂 （GCaMP）。这种融合蛋白专门设计用于同时观察顶体钙动力学和膜融合事件。实时监测活体 AcroSensE 精子中的顶体钙动力学和 AE 是使用高帧率成像和可靶向单个精子的兴奋剂递送系统实现的。该协议还提供了几个用于量化和分析原始数据的基本方法示例。由于 AcroSensE 模型是基因编码的，因此可以通过使用现成的遗传工具（例如与其他小鼠遗传模型杂交或基于基因编辑 （CRISPR） 的方法）来增强其科学意义。通过这种策略，可以解决其他信号通路在精子获能和受精中的作用。总之，这里描述的方法提供了一种方便有效的工具来研究特定亚细胞区室（精子顶体）中的钙动力学，以及这些动力学如何调节导致膜融合和顶体胞吐作用的中间步骤。

引言

精子在称为获能¹ 的过程中获得受精能力。这个过程的一个终点是精子获得经历AE的能力。超过二十年的数据支持哺乳动物精子中存在复杂的多步骤AE模型（^总结于2,3）。然而，研究活精子中的AE具有挑战性，目前可用的以足够分辨率监测这一过程的方法很麻烦，需要多个制备步骤⁴，仅限于检测AE的最后一步（例如，使用PNA⁵），仅限于测量胞质钙的变化（与顶体钙动力学相反）， 或仅限于细胞溶质钙动力学或 AE⁶ 的测量。

为了克服生理条件下实时AE研究的一些关键局限性，并能够研究钙动力学和AE之间的相互作用，生成了一个独特的小鼠模型。在该小鼠模型中，由基因编码的 Ca²⁺ 传感器 （GCaMP3） 和 mCherry 组成的融合蛋白被表达并使用 acrosin 启动子和信号转导肽² 靶向顶体。靶向双GCaMP3-mCherry传感器能够使用显微镜和单细胞兴奋剂递送系统，在生理条件下同时实时测量活精子中的钙浓度和顶体内容物状态（图1）。作为顶体基质的一个组成部分，膜....

研究方案

所有动物程序均根据指南进行，并得到康奈尔大学机构动物护理和使用委员会 （#2002-0095） 的批准。本研究使用 8-10 周龄的 AcroSensE 小鼠² 。有关AcroSensE鼠标可用性的信息请求可以提交给通讯作者。

1.精子收集和清洗

1. 从AcroSensE小鼠中收集附睾尾精子（有关此程序的更多详细信息在¹¹中提供）。在37°C下含有0.5mL改良Whitten培养基（MW）的3.5cm组织培养皿中允许15分钟的游出程序。 培养皿应被覆盖以减少MW的蒸发，并且应倾斜，使培养基有足够的深度来覆盖附睾尾部。
   注意：改良的Whitten培养基（分子量）包括22mM HEPES，1.2mM MgCl 2,100mM NaCl，4.7mM KCl，1mM丙酮酸，4.8mM乳酸hemi-Ca²⁺盐，pH 7.35。葡萄糖（5.5mM），NaHCO₃（10mM）和2-羟丙基环糊精（CD;3mM）根据需要补充（见材料表）以诱导获能，并且可以针对特定实验修改浓度。此外，可以使用替代甾醇受体代替克罗恩病（例如，牛血清白蛋白或高密度脂蛋白）。
2. 使用细镊子，从游泳收集皿中取出任何附睾组织。将含有精子的培养基转移到15m....

讨论

在这里，描述了一种基于显微镜的方法，利用新生成的 AcroSensE 小鼠模型进行实时单细胞监测和分析顶体钙动力学与导致 AE 的中间步骤之间的相互作用。与现成的遗传方法（例如与其他小鼠遗传模型杂交或基因编辑）一起，该模型和方法提供了一个强大的系统来研究参与与获能、AE 和受精相关的精子信号通路的各种成分和途径的作用。

关键步骤
在所有精子处?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III