Визуализация в режиме реального времени акросомальной динамики кальция и экзоцитоза в живых сперматозоидах мышей

Резюме

Мышиная модель AcroSensE и описанные здесь методы визуализации живых клеток обеспечивают новый подход к изучению динамики кальция в субклеточном компартменте акросомы сперматозоида и того, как они регулируют промежуточные этапы, ведущие к слиянию мембран и экзоцитозу акросом.

Аннотация

Экзоцитоз акросом (АЭ), при котором единственный экзоцитотический везикул сперматозоида сливается с плазматической мембраной, является сложным, кальций-зависимым процессом, необходимым для оплодотворения. Тем не менее, наше понимание того, как кальциевая сигнализация регулирует АЭ, все еще не завершено. В частности, взаимосвязь между внутриакросомальной динамикой кальция и промежуточными стадиями, ведущими к НЯ, четко не определена. Здесь мы описываем метод, который дает пространственное и временное представление о акросомальной динамике кальция и ее связи со слиянием мембран и последующим экзоцитозом акросомного везикулы. В методе используется новая трансгенная мышь, экспрессирующая сенсор экзоцитоза, нацеленный на акросомы (AcroSensE). Датчик сочетает в себе генетически кодируемый кальциевый индикатор (GCaMP), смешанный с mCherry. Этот гибридный белок был специально разработан для одновременного наблюдения за акросомальной динамикой кальция и событиями слияния мембран. Мониторинг акросомальной динамики кальция и АЭ в живых сперматозоидах AcroSensE в режиме реального времени достигается с помощью комбинации визуализации с высокой частотой кадров и системы доставки стимулятора, которая может быть нацелена на один сперматозоид. Этот протокол также содержит несколько примеров основных методов количественной оценки и анализа необработанных данных. Поскольку модель AcroSensE является генетически закодированной, ее научная значимость может быть увеличена за счет использования легкодоступных генетических инструментов, таких как скрещивание с другими генетическими моделями мышей или методы, основанные на редактировании генов (CRISPR). С помощью этой стратегии можно решить роль дополнительных сигнальных путей в капажировании и оплодотворении сперматозоидов. Таким образом, описанный здесь метод представляет собой удобный и эффективный инструмент для изучения динамики кальция в специфическом субклеточном компартменте – акросоме сперматозоида – и того, как эта динамика регулирует промежуточные этапы, ведущие к слиянию мембран и экзоцитозу акросом.

Введение

Сперматозоиды приобретают способность к оплодотворению во время процесса, называемого капациацией¹. Одной из конечных точек этого процесса является то, что сперматозоиды приобретают способность подвергаться НЯ. Данные, собранные за два десятилетия, подтверждают наличие сложной, многоступенчатой модели НЯ в сперматозоидах млекопитающих (обобщенная в ^2,3). Однако изучение НЯ в живых сперматозоидах является сложной задачей, а имеющиеся в настоящее время методы мониторинга этого процесса с адекватным разрешением громоздки и требуют нескольких подготовительных этапов⁴....

протокол

Все процедуры на животных были выполнены в соответствии с рекомендациями и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Корнелльском университете (#2002-0095). Для настоящего исследования были использованы мыши AcroSensE² в возрасте 8-10 недель. Запросы на получение информации о наличии мышей AcroSensE могут быть отправлены соответствующему автору.

1. Сбор и промывка спермы

1. Соберите сперматозоиды придатка яичка хвоста (подробнее об этой процедуре приведены в¹¹) у мышей AcroSensE. Выплавайте в течение 15 минут в чашке для культуры тканей диаметром 3,5....

Результаты

На рисунке 2 представлена упрощенная иллюстрация, показывающая последовательность изменений флуоресценции, ожидаемых после успешной стимуляции сперматозоидов. Верхняя панель рисунка 2 иллюстрирует изменения интенсивности флуоресценции GCaMP3, где сигн?.......

Обсуждение

В данной работе описан метод, основанный на микроскопии, использующий недавно сгенерированную модель мыши AcroSensE для мониторинга отдельных клеток в режиме реального времени и анализа взаимодействия между акросомальной динамикой кальция и промежуточными этапами, ведущими к АЭ. Вместе ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III