生きたマウス精子における先体カルシウム動態とエキソサイトーシスのリアルタイムイメージング

要約

ここで説明するAcroSensEマウスモデルおよび生細胞イメージング法は、精子先体細胞の細胞内コンパートメントにおけるカルシウム動態と、それらが膜融合および先体エキソサイトーシスにつながる中間ステップをどのように制御するかを研究するための新しいアプローチを提供します。

要約

精子の単一のエキソサイトーシス小胞が原形質膜と融合する先体エキソサイトーシス(AE)は、受精に不可欠な複雑なカルシウム依存プロセスです。しかし、カルシウムシグナル伝達がどのようにAEを調節するかについての理解はまだ不完全です。特に、先体内カルシウム動態とAEに至る中間段階との相互作用は明確に定義されていません。ここでは、先体カルシウムの動態と、膜融合とその後の先体小胞のエキソサイトーシスとの関係について、空間的および時間的な洞察を提供する方法について説明します。この方法では、アクロソーム標的エキソサイトーシス用センサー(AcroSensE)を発現する新しいトランスジェニックマウスを利用します。このセンサーは、mCherryと融合した遺伝子コードカルシウムインジケーター(GCaMP)を組み合わせています。この融合タンパク質は、アクロソームカルシウム動態と膜融合イベントを同時に観察できるように特別に設計されました。生きたAcroSensE精子の先体カルシウム動態とAEのリアルタイムモニタリングは、高フレームレートイメージングと単一の精子を標的とする刺激剤送達システムの組み合わせを使用して達成されます。このプロトコルは、生データを定量化および分析するための基本的な方法の例もいくつか提供します。AcroSensEモデルは遺伝子コードされているため、他のマウス遺伝子モデルとの交配や遺伝子編集(CRISPR)ベースの方法など、すぐに利用できる遺伝ツールを使用することで、その科学的重要性を高めることができます。この戦略により、精子の受精と受精における追加のシグナル伝達経路の役割を解決できます。要約すると、ここで説明する方法は、特定の細胞内コンパートメント(精子先体)のカルシウム動態と、それらの動態が膜融合と先体エキソサイトーシスにつながる中間ステップをどのように調節するかを研究するための便利で効果的なツールを提供します。

概要

精子は、受精能力1と呼ばれるプロセス中に受精する能力を獲得し^ます。このプロセスの1つのエンドポイントは、精子がAEを受ける能力を獲得することです。20年以上にわたるデータは、哺乳類の精子におけるAEの複雑で多段階的なモデルの存在を支持しています(^2,3に要約)。しかしながら、生精子におけるAEの研究は困難であり、このプロセスを適切な分解能でモニターするために現在利用可能な方法は、煩雑であり、複数の調製ステップ⁴を必要とし、AEの最終ステップの検出に限定され(例えば、PNA⁵を使用)、細胞質カルシウムの変化の測定に限定される(先体カルシウム動態とは対照的に)、 または、細胞質カルシウム動態または AE⁶ のいずれかの測定に限定されます。

生理学的条件下でのリアルタイムAE研究のいくつかの重要な制限を克服し、カルシウム動態とAEの相互作用の調査を可能にするために、独自のマウスモデルを作成しました。このマウスモデルでは、遺伝的にコードされた^Ca2+センサー(GCaMP3)とmCherryからなる融合タンパク質が発現し、アクロシンプロモーターとシグナル伝達ペプチド2を用いて先体に標的化^{されます。}ターゲットデュアルGCaMP3-mCherryセンサーは、顕微鏡検査と単一細胞刺激剤送達システムを使用して、生理学的条件下で生精子中のカルシウム濃度と先体内容物の状態を同時にリアルタイムに測定することを可能にします(図1)。アクロソームマトリックスの成分として、膜融合、およびAEは、このタンパク質が先体小胞から拡散するため、精子からの光安定性とpH非感受性のないmCherry蛍光の損失をもたらします。この点で、AEのタイミングと発生を反映するモデルの能力は、先体標的GFPマウス系統^の利点に類似しています^7,8,9。

このトランスジェニックマウス系統で用いられているGCaMP3変異体は、KDが約400μMで、Ca²⁺のダイナミックレンジが10-4-10-3 M ¹⁰であり、この小胞に適している。我々は、GCaMP3の特徴の組み合わせにより、原形質膜と外先体膜(OAM⁾²の間の融合孔形成を明らかにすることができることを示しました。融合細孔の検出は、細孔径が小さすぎてAcroSensEタンパク質が先体外に分散し(先体含有量の喪失を介して)、Ca²⁺イオンの先体内腔への流入を可能にする膜「チャネル」を提供し、GCaMP3の蛍光強度を増加させる結果です。

明るく、単量体で、カルシウム感受性のない蛍光タンパク質mCherryは、GCaMP3シグナルが微弱な間(例えば、Ca²⁺ 結合前、 図2)の先体可視化をサポートし、重要なことに、イメージングに適した先体無傷の精子細胞の同定も可能にします。

以下のプロトコルでは、独自のAcroSensEマウスモデルの利用と、高い空間分解能と時間分解能でAEおよび精子カルシウムの動態を研究するために実験的に使用された顕微鏡検査法について説明します。

プロトコル

すべての動物処置はガイドラインに基づいて実施され、コーネル大学の動物飼育および使用委員会(#2002-0095)によって承認されました。8〜10週齢のAcroSensEマウス² を本研究に使用しました。AcroSensEマウスの利用可能性に関する情報のリクエストは、対応する著者に提出することができます。

1.精子の採取と洗浄

1. AcroSensEマウスから精巣上体尾精子(この手順の詳細については¹¹に記載)を採取します。0.5 mLの修飾ウィッテン培地(MW)を含む3.5 cmの組織培養皿で、37°Cで15分間のスイムアウト手順を実行します。 皿はMWの蒸発を減らすために覆う必要があり、培地が精巣上体尾を覆うのに十分な深さを持つように傾ける必要があります。
   注:修飾ウィッテン培地(MW)には、22 mM HEPES、1.2 mM MgCl₂、100 mM NaCl、4.7 mM KCl、1 mMピルビン酸、4.8 mM乳酸ヘミ-^Ca2+ 塩、pH 7.35が含まれます。グルコース(5.5 mM)、NaHCO₃ (10 mM)、および2-ヒドロキシプロピル--シクロデキストリン(CD;3 mM)は、容量誘導のために必要に応じて補充され( 材料表を参照)、特定の実験のために濃度を変更することができます。さらに、CDの代わりに代替ステロール受容体(例えば、ウシ血清アルブミンまたは高密度リポタンパク質)を使用することができる。
2. 細かい鉗子を使用して、スイムアウト収集皿から精巣上体組織を取り除きます。精子を含む培地を15 mLのコニカルチューブに移し、懸濁液を100 x g で1分間、室温でスイングバケットローターで1分間遠心分離します。プラスチックピペットを使用して、このステップでペレット化した肉眼組織破片から精子を含むMW上清を取り除きます。
3. 精子を含むMW上清を、MWを37°Cで添加して総量3mLにします。 丸底チューブ内で400 x g で8分間(室温)遠心分離します。ゆるくペレット化した精子からMWの上澄みをゆっくりと取り除きます。
4. 生存可能であれば、精子は「ふわふわした」ペレットとして現れるはずです。大口径トランスファーピペット によるトリチュ レーション、またはチューブを軽く手動で叩く(「指でフリック」) ことで 、精子を静かに再懸濁します。均等に再懸濁したら、それらを新しい丸底チューブに移します。10〜20μLの精子懸濁液を使用して、運動性をカウントおよび評価します。精子をMWで希釈して使用します。
   注:マウスの精子の容量を含むほとんどの実験では、5〜1,000万精子/mL MWの最終濃度が使用されます。本稿に記載のイメージングプロトコルは、精子のキャパシテーションを必要としないが、精子が生理学的に関連する先体エキソサイトーシスを受ける能力を獲得することが必要である。病理学的エキソサイトーシスまたは精子を容量化せずにカルシウムイオノフォアなどの試薬を介して誘発されるエキソサイトーシスを研究することができます。さらに、さまざまな刺激に応答して、非容量性細胞の先体カルシウムの潜在的な変化を調べることができます。
5. 採取から3〜5時間以内に精子を使用し、時間をできるだけ短くし、実験的試行間で一貫性を保ちます。
6. MW培地を使用して37°Cで収集と洗浄のすべてのステップを実行し、膜の損傷を最小限に抑える方法を採用します。これには、大口径のプラスチックトランスファーピペットまたは大口径のピペットチップの使用が含まれ、手順のすべての段階での使用が推奨されます。

2. イメージング用カバーガラス皿のポリ-D-リジンコーティング

注:ポリ-D-リジン(PDL)皿は、各実験の前に新鮮に調製する必要があります。

1. カバーガラス皿の中央に 0.5 μL の PDL 液滴(0.5 mg/mL、 材料表を参照)を分注します。
2. 10 μLの目盛り付きチップを使用して、カバーガラス全体にPDL液滴を塗ります( 図1Bに示すような十字パターン)。
3. 37°Cで10分間乾燥させます。PDLコーティングされたディッシュに蓋をして、使用するまで37°Cに保管してください。

3.毛管引き、パフのためのローディング

1. ホウケイ酸ガラスキャピラリー(外径、2 mm、内径、1.56 mm、 材料表を参照)を、熱:330、引張:250、速度:250、時間:70の設定を使用して引きます。このステップは、使用する特定のプーラーに合わせて最適化する必要があります。
2. 各実験の前に、3〜5倍の濃度の覚醒剤を含む刺激溶液を1つのキャピラリーにロードします(パフ時の溶液の急速な拡散を考慮するため)。充填する前に、細いピンセットを使用して、毛細血管の先端を端から約1〜2mmでこじ開けます。これにより、約5μmの開口径が得られます。熱研磨が不要です。
3. 薄いプラスチック製のトランスファーピペットを使用して、毛細血管の長さの4分の3がいっぱいになるまで、刺激液をゆっくりと毛細血管に注入します。
4. キャピラリーを軽くフリックして、充填中に形成された気泡を取り除きます。
5. 充填されたキャピラリーをマイクロマニピュレーターに取り付けます( 材料表を参照)。

4.パフのための刺激の送達の準備

注意: ユーザーの怪我のリスクを最小限に抑えるために、パフ手順の操作中は安全ゴーグルを着用する必要があります。

1. 5 psi で 10 秒のパルスを供給するようにシングルセルデリバリーシステム設定をセットアップします。
2. ホウケイ酸キャピラリーをシングルセルデリバリーシステムのピペットホルダーに接続します。シールがしっかり締まっていることを確認してください。
3. キャピラリーチップを観察しながら、20 psi で 2 秒の短いパフを塗布して、溶液がチップの端から実際に分注されるようにします(チップの端に小さな滴がはっきりと見えるはずです)。

5. 顕微鏡検査と画像取得

注:複数のブランドの顕微鏡が利用可能であり、使用できます。ただし、最小フレームレートは3フレーム/秒が望ましいです。温度と環境制御については、非接触赤外線温度計などを使用して、皿内の媒体の実際の温度を確認する必要があることに注意してください。

1. 希釈した精子80 μLをポリ-D-リジンでコーティングした35 mmカバーガラス皿の中央に加えます。マウスの精子のキャパシテーションを含むほとんどの実験では、5〜1,000万精子/ mLの最終濃度が使用されます。
2. 10 mM CaCl₂を添加した3 mLの温かい(37°C)MWベース培地を精子にゆっくりと添加します。
   注:細胞プロセスを遅らせるために室温で実験を行うことは可能ですが、容量化は脂質交換とミクロドメインおよびマクロドメインの流動性によって媒介されるため、生理学的に関連する容量化と先体エキソサイトーシスは温度依存性プロセスであることに留意する必要があることに注意することが重要です。
3. 精子を入れた皿を顕微鏡(37°Cに予熱)に取り付けます。
4. 488 nmのレーザーラインを使用してGCaMP3を励起し、505-550 nmのバンドパス(BP)フィルターで観察します。555 nmのレーザーラインを使用してmCherryを励起し、575-615 nmのBPフィルターで観察します。
5. マイクロマニピュレーター(顕微鏡が設置されたエアテーブルにマニピュレーターを取り付けることをお勧めします)を使用して、キャピラリーの先端を目的の細胞の平面の側面に約100μm、5〜10μm上に配置します。
   注:刺激溶液は、毛細血管と細胞の間の体積で発生する急速な拡散を補うために、通常の濃度の3〜5倍で作られています。
6. 顕微鏡でイメージングシーケンスを開始します。
7. 精子細胞を高フレームレート、できれば>10フレーム/秒で画像化します。ここでは、33ms/frameでのイメージングが可能なレゾナントスキャナーを使用しました。
8. 顕微鏡で画像取得を開始してから10秒後に、シングルセルデリバリーシステムを作動させ、10秒間の刺激剤のパフを開始します。
9. 10〜15分間セルを画像化します。
10. シングルセルデリバリーシステムを使用して、 図1Bに示す位置に従って、1つのディッシュから複数の細胞を画像化します。
    注:顕微鏡下での未処理/非刺激の精子は、ほとんどが赤く見え、緑の信号の強度は低いはずです。精子の頭はカバーガラスに取り付ける必要があり、生きている精子は尾が動くことで識別できます。図 2に示すように、AEを受けた精子では、GCaMP3の緑色シグナルが最初に増加し、AEが完了するとmCherryの赤色シグナルとGCaMP3の緑色シグナルの両方が消失します。mCherry蛍光の減少は、^Ca2+ 濃度の変化がGCaMP3蛍光強度の変化を継続的に引き起こすため、AEが始まる時期のより具体的な指標を提供します。

6. 画像・データ解析

注:オフライン画像解析はImageJを使用して行われます( 材料表を参照)。以前は、AEにつながるプロセスにおいて、先体カルシウム上昇(ACR)や完全膜融合など、いくつかの中間ステップが報告されていました。後者はmCherry蛍光の損失につながるため、完全なAEを表します。一部の細胞では、エキソサイトーシスの研究でアンペロメトリックアプローチを使用すると、スパイク前足イベント(PSF)に類似したシグナルが観察されます(詳細については、²を参照してください)。AcroSensE の生データを解析して、ACR、AE、およびその中間ステップを定量化するためのいくつかのオプションメソッドを使用できます。以下では、基本的な分析方法をいくつか紹介します。

1. 特定の顕微鏡システムのファイル拡張子に応じて、チャンネル分割ツール(Image > Colors > Split Channels)を使用して、GCaMP3チャンネルとmCherryチャンネルの個別のウィンドウを生成します。
2. 「ウィンドウの同期」ツール(「>ツールの分析」>「ウィンドウの同期」)を使用して、個々のウィンドウを同期します。
3. 赤チャンネルの精子頭部周辺の関心領域(ROI)を選択して、先体領域を含めます(図3A、B)。同期ツールを使用すると、精子がまだ薄暗くて見えない緑のチャンネルに同じ領域選択を自動的に適用できます。
4. 「Z Profiler」プラグイン(Plugins > Stacks > Z Profiler)または「Time Series Analyzer」(Plugins > Stacks > Time Series Analyzer)を選択して、2つのチャンネルそれぞれのフレーム/時間の関数として蛍光強度の変化をプロットします。
5. データを表計算ソフトウェア(Microsoft Excelなど)にコピーして、プロットや詳細な分析を行います。
   注: データをスプレッドシートにコピーすると、 図 4 に示すように、次のような複数のパラメータを抽出して分析できます。
   1. フュージョンポア(FP)開始時間:時点0からGCaMP3信号が上昇し始める時点までの時間を測定します。このパラメータは、刺激と精子のACR応答の間の遅延を示します。
   2. AE開始時間:時点0からmCherry信号が減衰し始める時点までの時間を測定します。このパラメータは、刺激と精子AE応答の間の遅延を示します。このパラメータは、FP形成とAE応答の間の遅延を計算するためにも使用できます。
   3. ピークFP振幅:GCaMP3シグナルの立ち上がりのベースからピークまでの蛍光シグナルを測定します。このパラメーターは、ACR 応答の合計増加を示します。
   4. mCherryの損失率:このパラメータは、mCherry信号損失のセクション( 図4Bの「傾き」で示されている)の線形または指数近似によって決定されます。
      注:または、さまざまな時点での残留(R)信号法によって減衰率を決定します(例:R60:mCherry信号のベースラインから60%の残留信号までの秒単位の持続時間)。このパラメータは、AE時にアクロソーム含有量が分散する速度を定量化するために使用できます。
   5. mCherry損失のシグナル減少:ベースラインのmCherry蛍光強度とAE後のシグナルの振幅の差を決定します。このパラメータは、AE時に分散した先体含有量の総量を示します。
   6. 赤と緑の両方のチャンネルの蛍光(F)の変化を生データとしてプロットするか、初期蛍光(F0)で正規化し、ΔF/F0として表します。後者は、1つのプロットで赤と緑の両方の変化をよりよく視覚化します(たとえば、 図3D および 図3Hを参照)。
      注:最後に、異なる測定パラメータを異なる条件間で比較して、先体カルシウム濃度の変化とAEの関係を判断できます。さまざまな実験条件の比較の例については、参考文献²を参照してください。

結果

図2 は、精子の刺激が成功した後に予想される蛍光変化のシーケンスを示す簡略化された図を示しています。 図2 の上部パネルは、GCaMP3の蛍光強度の変化を示しており、シグナルは最初は暗く(ベースラインのアクロソームカルシウム濃度はGCaMP3 KDよりも低い)、融合細孔 を介して カルシウムイオンが侵入すると、蛍光の明るさが増します。?...

ディスカッション

ここでは、新たに作製したAcroSensEマウスモデルを用いて、先体カルシウム動態とAEに至る中間ステップの相互作用をリアルタイムでシングルセルモニタリングおよび解析する顕微鏡ベースの手法について紹介します。このモデルと方法は、他のマウス遺伝子モデルとの交配や遺伝子編集など、容易に利用できる遺伝的アプローチとともに、受精、AE、および受精に関連する精子シグナル伝達経...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III