Imagerie en temps réel de la dynamique acrosomique du calcium et de l’exocytose dans les spermatozoïdes de souris vivants

Résumé

Le modèle murin AcroSensE et les méthodes d’imagerie de cellules vivantes décrits ici offrent une nouvelle approche pour étudier la dynamique du calcium dans le compartiment subcellulaire de l’acrosome des spermatozoïdes et comment ils régulent les étapes intermédiaires menant à la fusion membranaire et à l’exocytose de l’acrosome.

Résumé

L’exocytose de l’acrosome (AE), dans laquelle la vésicule exocytotique unique du spermatozoïde fusionne avec la membrane plasmique, est un processus complexe, dépendant du calcium, essentiel à la fécondation. Cependant, notre compréhension de la façon dont la signalisation calcique régule l’AE est encore incomplète. En particulier, l’interaction entre la dynamique calcique intra-acrosomique et les étapes intermédiaires menant à l’EI n’est pas bien définie. Nous décrivons ici une méthode qui fournit des informations spatiales et temporelles sur la dynamique acrosomique du calcium et sa relation avec la fusion membranaire et l’exocytose subséquente de la vésicule acrosomique. La méthode utilise une nouvelle souris transgénique exprimant un capteur d’exocytose ciblant l’acrosome (AcroSensE). Le capteur combine un indicateur de calcium génétiquement codé (GCaMP) fusionné avec mCherry. Cette protéine de fusion a été spécialement conçue pour permettre l’observation simultanée de la dynamique acrosomique du calcium et des événements de fusion membranaire. La surveillance en temps réel de la dynamique acrosomale du calcium et de l’EI dans les spermatozoïdes vivants d’AcroSensE est réalisée à l’aide d’une combinaison d’imagerie à fréquence d’images élevée et d’un système d’administration stimulant qui peut cibler un seul spermatozoïde. Ce protocole fournit également plusieurs exemples de méthodes de base pour quantifier et analyser les données brutes. Étant donné que le modèle AcroSensE est génétiquement codé, son importance scientifique peut être augmentée en utilisant des outils génétiques facilement disponibles, tels que le croisement avec d’autres modèles génétiques de souris ou des méthodes basées sur l’édition de gènes (CRISPR). Grâce à cette stratégie, les rôles des voies de signalisation supplémentaires dans la capacitation et la fécondation des spermatozoïdes peuvent être résolus. En résumé, la méthode décrite ici fournit un outil pratique et efficace pour étudier la dynamique du calcium dans un compartiment subcellulaire spécifique - l’acrosome des spermatozoïdes - et comment cette dynamique régule les étapes intermédiaires menant à la fusion membranaire et à l’exocytose de l’acrosome.

Introduction

Les spermatozoïdes acquièrent la capacité de féconder au cours d’un processus appelé capacitation¹. L’un des points d’évaluation de ce processus est que les spermatozoïdes acquièrent la capacité de subir un EI. Plus de deux décennies de données confirment la présence d’un modèle complexe d’EI en plusieurs étapes dans les spermatozoïdes de mammifères (résumé en ^2,3). Cependant, l’étude de l’EI dans les spermatozoïdes vivants est difficile, et les méthodes actuellement disponibles pour surveiller ce processus avec une résolution adéquate sont lourdes et nécessitent de multiples étapes de préparation⁴, sont limitées à la détection de l’étape finale de l’EI (par exemple, à l’aide de PNA⁵), sont limitées aux mesures des changements dans le calcium cytosolique (contrairement à la dynamique acrosomale du calcium), ou sont limités à des mesures de la dynamique du calcium cytosolique ou de l’AE⁶.

Afin de surmonter certaines des principales limites des études d’EI en temps réel dans des conditions physiologiques et d’étudier l’interaction entre la dynamique du calcium et l’AE, un modèle murin unique a été généré. Dans ce modèle murin, une protéine de fusion composée du capteur Ca²⁺ (GCaMP3) et de mCherry est exprimée et ciblée sur l’acrosome à l’aide d’un promoteur d’acrosine et d’un peptide de signalisation². Le double capteur ciblé GCaMP3-mCherry permet de mesurer simultanément en temps réel les concentrations de calcium et l’état du contenu acrosomique dans les spermatozoïdes vivants dans des conditions physiologiques à l’aide de la microscopie et d’un système d’administration de stimulants unicellulaires (Figure 1). En tant que composant de la matrice acrosomique, la fusion membranaire et l’AE entraîneraient la perte de la fluorescence mCherry photostable et insensible au pH du spermatozoïde, car cette protéine diffuse hors de la vésicule acrosomique. À cet égard, la capacité du modèle à refléter le moment et l’occurrence de l’EI s’apparente aux avantages de la lignée de souris GFP^ciblant l’acrosome ^7,8,9.

La variante GCaMP3 utilisée dans cette lignée de souris transgéniques a un KD approximatif de 400 μM et une plage dynamique pour Ca²⁺ de 10-4-10-3 M¹⁰, ce qui convient à cette vésicule. Nous avons montré que cette combinaison de caractéristiques de GCaMP3 pouvait révéler la formation de pores de fusion entre la membrane plasmique et la membrane acrosomique externe (OAM)². La détection des pores de fusion est le résultat du fait que la taille des pores est trop petite pour permettre à la protéine AcroSensE de se disperser hors de l’acrosome (via la perte de contenu en acrosome) tout en fournissant un « canal » membranaire qui permet l’afflux d’ions Ca²⁺ dans la lumière de l’acrosome, conduisant à une augmentation de l’intensité de fluorescence du GCaMP3.

La protéine fluorescente mCherry, brillante et monomère et non sensible au calcium, permet de visualiser l’acrosome lorsque le signal GCaMP3 est faible (par exemple, avant la liaison au Ca²⁺ , Figure 2) et, surtout, elle permet également d’identifier des spermatozoïdes intacts dans l’acrosome adaptés à l’imagerie.

Le protocole suivant décrit l’utilisation du modèle murin unique AcroSensE et les méthodes de microscopie utilisées expérimentalement pour étudier la dynamique de l’AE et du calcium des spermatozoïdes avec une haute résolution spatiale et temporelle.

Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices et approuvées par le Comité institutionnel sur le soin et l’utilisation des animaux de l’Université Cornell (#2002-0095). Des souris AcroSensE 2 âgées de 8 à 10^{semaines ont été} utilisées pour la présente étude. Les demandes d’informations sur la disponibilité des souris AcroSensE peuvent être adressées à l’auteur correspondant.

1. Collecte et lavage du sperme

1. Prélever des spermatozoïdes épididymaires de la caudale (plus de détails sur cette procédure sont fournis dans^{la section 11}) de souris AcroSensE. Attendre 15 minutes dans une boîte de culture tissulaire de 3,5 cm contenant 0,5 mL de milieu de Whitten modifié (MW) à 37 °C. La parabole doit être couverte pour réduire l’évaporation du MW et doit être inclinée de manière à ce que le milieu ait suffisamment de profondeur pour couvrir les épididymes de la cauda.
   REMARQUE : Le milieu de Whitten modifié (MW) comprend 22 mM de HEPES, 1,2 mM de MgCl₂, 100 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 1 mM d’acide pyruvique, 4,8 mM d’acide lactique hémi-Ca²⁺ , pH 7,35. Le glucose (5,5 mM), le NaHCO₃ (10 mM) et la 2-hydroxypropyl--cyclodextrine (CD ; 3 mM) sont complétés (voir le tableau des matériaux) au besoin pour l’induction de la capacitation, et les concentrations peuvent être modifiées pour des expériences spécifiques. De plus, d’autres accepteurs de stérols pourraient être utilisés à la place de la CD (p. ex., albumine sérique bovine ou lipoprotéines de haute densité).
2. À l’aide d’une pince fine, retirez tout tissu épididymaire de la boîte de collecte. Transvaser le milieu contenant les spermatozoïdes dans un tube conique de 15 mL et centrifuger la suspension à 100 x g pendant 1 min dans un rotor à godets oscillants à température ambiante. À l’aide d’une pipette en plastique, retirez le surnageant MW contenant les spermatozoïdes de tous les débris tissulaires grossiers qui se seront enroulés à cette étape.
3. Porter le surnageant MW contenant les spermatozoïdes à un volume total de 3 mL en ajoutant MW à 37 °C. Centrifuger à 400 x g pendant 8 min (à température ambiante) dans un tube à fond rond. Retirez lentement le surnageant de MW du sperme granulé lâchement.
4. S’il est viable, le sperme devrait apparaître sous la forme d’une pastille d’apparence « duveteuse ». Remettre doucement les spermatozoïdes en suspension par trituration à l’aide d’une pipette de transfert de gros calibre ou en tapotant doucement manuellement sur le tube (« effleurement des doigts »). Une fois remis en suspension uniformément, transférez-les dans un nouveau tube à fond rond. Utilisez 10 à 20 μL de la suspension de spermatozoïdes pour compter et évaluer la motilité. Diluer le sperme dans MW pour l’utiliser.
   REMARQUE : Pour la plupart des expériences impliquant la capacitation de spermatozoïdes de souris, une concentration finale de 5 à 10 millions de spermatozoïdes/mL MW est utilisée. Le protocole d’imagerie décrit ici ne nécessite pas la capacitation des spermatozoïdes, bien qu’il soit nécessaire que les spermatozoïdes acquièrent la capacité de subir une exocytose acrosomique physiologiquement pertinente. On pourrait étudier l’exocytose pathologique ou l’exocytose induite par des réactifs tels qu’un ionophore de calcium sans capaciter les spermatozoïdes. De plus, on pourrait explorer les changements potentiels du calcium acrosomique dans les cellules non capacites en réponse à divers stimuli.
5. Utilisez le sperme dans les 3 à 5 heures suivant le prélèvement, en gardant le temps aussi court que possible et cohérent entre les essais expérimentaux.
6. Effectuer toutes les étapes de collecte et de lavage à 37 °C à l’aide d’un milieu MW, en utilisant des méthodes pour minimiser les dommages à la membrane. Cela inclut l’utilisation de pipettes de transfert en plastique de grand diamètre ou de pointes de pipette à grand orifice, qui sont recommandées pour une utilisation à toutes les étapes de la procédure.

2. Revêtement en poly-D-lysine des plaques de lamelles pour l’imagerie

REMARQUE : Les plats en poly-D-lysine (PDL) doivent être préparés frais avant chaque expérience.

1. Distribuer une gouttelette de 0,5 μL de PDL (0,5 mg/mL, voir le tableau des matériaux) au centre d’une lamelle.
2. À l’aide d’une pointe graduée de 10 μL, étalez la gouttelette PDL sur la lamelle (motif entrecroisé comme illustré à la figure 1B).
3. Laisser sécher à 37 °C pendant 10 min. Conservez la vaisselle recouverte de PDL couverte et à 37 °C jusqu’à utilisation.

3. Tirage capillaire, chargement pour le soufflage

1. Tirez les capillaires en verre borosilicaté (O.D, 2 mm, D.I., 1,56 mm, voir le tableau des matériaux) en utilisant les réglages suivants : Chaleur : 330, Traction : 250, Vitesse : 250 et Temps : 70. Cette étape doit être optimisée pour l’extracteur spécifique utilisé.
2. Avant chaque expérience, chargez un seul capillaire avec la solution stimulante contenant 3 à 5 fois la concentration du stimulant (pour tenir compte de la diffusion rapide de la solution lors de la bouffée). Avant le remplissage, utilisez une pince à épiler fine pour ouvrir l’extrémité capillaire à environ 1-2 mm de l’extrémité. Cela devrait produire un diamètre d’ouverture de ∼5 μm. Le polissage à chaud n’est pas nécessaire.
3. À l’aide d’une fine pipette de transfert en plastique, injectez lentement la solution stimulante dans le capillaire jusqu’à ce que les trois quarts de sa longueur soient pleins.
4. Éliminez les bulles d’air formées lors du remplissage en effleurant doucement le capillaire.
5. Montez le capillaire rempli sur le micromanipulateur (voir le tableau des matériaux).

4. Préparation de la livraison de la stimulation pour la bouffée

REMARQUE : Pour minimiser le risque de blessure de l’utilisateur, des lunettes de sécurité doivent être portées pendant le fonctionnement de la procédure de bouffée.

1. Configurez les paramètres du système de distribution à cellule unique pour fournir une impulsion de 10 s à 5 psi.
2. Connectez le capillaire borosilicaté au porte-pipette du système d’administration à cellule unique. Assurez-vous que les joints sont bien serrés.
3. Tout en observant l’embout capillaire, appliquez une courte bouffée de 2 s à 20 psi pour vous assurer que la solution est bien distribuée par l’extrémité de l’embout (une petite goutte doit être évidente à l’extrémité de l’embout).

5. Microscopie et acquisition d’images

REMARQUE : Plusieurs marques de microscopes sont disponibles et peuvent être utilisées ; Cependant, une fréquence d’images minimale de 3 images/s est souhaitable. En ce qui concerne le contrôle de la température et de l’environnement, veuillez noter que la température réelle du fluide dans la boîte doit être confirmée, par exemple, à l’aide d’un thermomètre infrarouge sans contact.

1. Ajouter 80 μL de spermatozoïdes dilués au centre d’une boîte de lamelles de 35 mm recouverte de poly-D-lysine. Pour la plupart des expériences impliquant la capacitation des spermatozoïdes de souris, une concentration finale de 5 à 10 millions de spermatozoïdes/ml est utilisée.
2. Ajouter lentement au sperme 3 mL de milieu de base MW chaud (37 °C) complété par 10 mM de CaCl₂.
   REMARQUE : On pourrait effectuer des expériences à température ambiante pour ralentir les processus cellulaires, mais il est important de noter que parce que la capacitation est médiée par les échanges lipidiques et la fluidité des micro- et macro-domaines, il faut garder à l’esprit que la capacitation physiologiquement pertinente et l’exocytose de l’acrosome sont des processus dépendants de la température.
3. Montez la boîte avec le sperme sur le microscope (préchauffé à 37 °C).
4. Excitez le GCaMP3 à l’aide d’une ligne laser de 488 nm et visualisez avec un filtre passe-bande (BP) de 505 à 550 nm. Excitez le mCherry à l’aide d’une ligne laser de 555 nm et visualisez avec un filtre BP de 575-615 nm.
5. À l’aide d’un micromanipulateur (il est recommandé de fixer le manipulateur à la table d’air sur laquelle le microscope a été installé), positionnez la pointe du capillaire à environ 100 μm sur le côté et à 5-10 μm au-dessus du plan de la cellule d’intérêt.
   REMARQUE : Les solutions stimulantes sont fabriquées à 3-5 fois la concentration normale pour compenser la diffusion rapide qui se produit dans le volume entre le capillaire et la cellule.
6. Démarrez la séquence d’imagerie sur le microscope.
7. Imagez des spermatozoïdes à une fréquence d’images élevée, de préférence >10 images/s. Ici, un scanner résonant a été utilisé qui permet d’obtenir des images à 33 ms/image.
8. Dix secondes après avoir démarré l’acquisition de l’image sur le microscope, activez le système d’administration de la cellule unique pour initier la bouffée de stimulant de 10 s.
9. Cellules d’image pour une durée de 10 à 15 min.
10. À l’aide du système d’administration à cellule unique, imagez plusieurs cellules d’une seule boîte en fonction des emplacements indiqués à la figure 1B.
    REMARQUE : Les spermatozoïdes non traités/non stimulés au microscope doivent apparaître principalement rouges, avec une faible intensité du signal vert. Les têtes de spermatozoïdes doivent être attachées à la lamelle, et les spermatozoïdes vivants peuvent être identifiés par leurs queues mobiles. Dans les spermatozoïdes qui subissent un AE, le signal vert GCaMP3 augmentera initialement, et le signal rouge mCherry et le signal vert GCaMP3 disparaîtront si l’AE est complet, comme illustré à la figure 2. La réduction de la fluorescence mCherry fournit un indicateur plus précis du moment où l’AE commence, car les changements dans les concentrations de Ca²⁺ entraîneront continuellement des changements dans l’intensité de la fluorescence GCaMP3.

6. Analyse d’images et de données

REMARQUE : L’analyse d’image hors ligne est effectuée à l’aide d’ImageJ (voir le tableau des matériaux). Auparavant, plusieurs étapes intermédiaires ont été rapportées dans le processus menant à l’AE, y compris l’élévation acrosomique du calcium (ACR) et la fusion membranaire complète. Ce dernier conduit à la perte de la fluorescence mCherry et représente donc un AE complet. Dans certaines cellules, des signaux similaires à ceux des événements antérieurs au pied de pointe (PSF) sont observés lors de l’utilisation d’approches ampérométriques dans les études d’exocytose (pour plus de détails, voir²). Plusieurs méthodes optionnelles sont disponibles pour analyser les données brutes d’AcroSensE afin de quantifier l’ACR, l’AE et ses étapes intermédiaires. Ce qui suit décrit quelques-unes des méthodes analytiques de base.

1. En fonction de l’extension de fichier spécifique du système de microscope, utilisez l’outil Split Channel (Image > Colors > Split Channels) pour générer des fenêtres individuelles pour les canaux GCaMP3 et mCherry.
2. Synchronisez les différentes fenêtres à l’aide de l’outil « Synchroniser la fenêtre » (Analyser > Outils > Synchroniser les fenêtres).
3. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) autour de la tête du spermatozoïde dans le canal rouge pour inclure la région de l’acrosome (Figure 3A,B). L’outil de synchronisation permet d’appliquer automatiquement la même sélection de zone sur le canal vert, dans lequel les spermatozoïdes sont encore trop faibles pour être visibles.
4. Choisissez le plugin « Z Profiler » (Plugins > Stacks > Z Profiler) ou « Time Series Analyzer » (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) pour tracer le changement d’intensité de fluorescence en fonction du nombre d’images/temps pour chacun des deux canaux.
5. Copiez les données dans un tableur (p. ex., Microsoft Excel) pour les tracer et les analyser plus en profondeur.
   REMARQUE : Une fois les données copiées dans une feuille de calcul, plusieurs paramètres peuvent être extraits pour l’analyse, notamment les suivants, comme illustré à la figure 4.
   1. Heure de début du pore de fusion (FP) : mesurez le temps entre le point temporel 0 et le moment où le signal GCaMP3 commence à monter. Ce paramètre indique le délai entre la stimulation et la réponse ACR des spermatozoïdes.
   2. Heure de début de l’exposition automatique : mesurez le temps écoulé entre le point temporel 0 et le moment où le signal mCherry commence à se dégrader. Ce paramètre indique le délai entre la stimulation et la réponse AE des spermatozoïdes. Ce paramètre pourrait également être utilisé pour calculer le délai entre la formation de FP et la réponse d’AE.
   3. Amplitude de crête FP : mesure le signal de fluorescence de la base au pic de l’élévation du signal GCaMP3. Ce paramètre indique l’augmentation totale de la réponse de l’ACR.
   4. Taux de perte de mCherry : déterminer ce paramètre par un ajustement linéaire ou exponentiel sur la section de perte de signal mCherry (comme indiqué par « pente » dans la Figure 4B).
      REMARQUE : Vous pouvez également déterminer le taux de décroissance par la méthode du signal résiduel (R) à différents points temporels (par exemple, R60 : durée en secondes jusqu’à un signal résiduel de 60 % par rapport à la ligne de base du signal mCherry). Ce paramètre peut être utilisé pour quantifier la vitesse à laquelle le contenu acrosomique est dispersé lors de l’AE.
   5. Diminution du signal pour la perte de mCherry : déterminer la différence d’amplitude entre l’intensité de fluorescence de base de mCherry et le signal suivant l’AE. Ce paramètre indique la quantité totale de contenu acrosomique dispersée lors de l’AE.
   6. Tracez les changements de fluorescence (F) pour les canaux rouge et vert en tant que données brutes, ou normalisez-les par la fluorescence initiale (F0) et exprimez-les sous la forme ΔF/F0. Ce dernier permet de mieux visualiser les changements en rouge et en vert sur un même graphique (voir par exemple la figure 3D et la figure 3H).
      REMARQUE : Enfin, les différents paramètres mesurés peuvent être comparés entre différentes conditions afin de déterminer la relation entre les changements de la concentration acrosomique de calcium et l’AE. Pour des exemples de comparaisons de conditions expérimentales, voir la référence².

Résultats

La figure 2 fournit une illustration simplifiée montrant la séquence des changements de fluorescence attendus après la stimulation réussie des spermatozoïdes. Le panneau supérieur de la figure 2 illustre les changements dans l’intensité de fluorescence de GCaMP3, où le signal est initialement faible (les concentrations de calcium acrosomique de base sont inférieures à GCaMP3 KD), et lors de l’entrée d’ions calcium par les pores de fusio...

Discussion

Ici, une méthode basée sur la microscopie est décrite pour utiliser le modèle de souris AcroSensE nouvellement généré pour la surveillance et l’analyse en temps réel d’une cellule unique et l’analyse de l’interaction entre la dynamique acrosomique du calcium et les étapes intermédiaires menant à l’AE. Associés à des approches génétiques facilement accessibles, telles que le croisement avec d’autres modèles génétiques murins ou l’édition de gènes, ce modèle et cette méthode fournissent ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III