نموذج خارج الجسم الحي للورم الخبيث البريتوني لسرطان المبيض باستخدام الثرب البشري

Summary

يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي للتفاعل بين الخلايا السرطانية والثرب. يوفر النموذج منصة لتوضيح الآليات المؤيدة للورم داخل المكانة الدهنية ولاختبار العلاجات الجديدة.

Abstract

سرطان المبيض هو أكثر الأورام الخبيثة النسائية فتكا. يلعب الثرب دورا رئيسيا في توفير بيئة دقيقة داعمة لخلايا سرطان المبيض النقيلي بالإضافة إلى الإشارات المعدلة المناعية التي تسمح بتحمل الورم. ومع ذلك ، لدينا نماذج محدودة تحاكي عن كثب التفاعل بين خلايا سرطان المبيض والأنسجة الغنية بالدهون. لمزيد من الفهم للآليات الخلوية والجزيئية التي يوفر بها الثرب بيئة دقيقة مؤيدة للورم ، قمنا بتطوير نموذج 3D ex vivo فريد من نوعه للتفاعل بين الخلايا السرطانية والثرب. باستخدام الثرب البشري ، نحن قادرون على زراعة خلايا سرطان المبيض داخل هذه البيئة المكروية الغنية بالدهون ومراقبة العوامل المسؤولة عن نمو الورم وتنظيم المناعة. بالإضافة إلى توفير منصة لدراسة هذه البيئة المكروية الغنية بالورم الدهني ، يوفر النموذج منصة ممتازة لتطوير وتقييم مناهج علاجية جديدة لاستهداف الخلايا السرطانية النقيلي في هذا المجال. النموذج المقترح سهل الإنشاء وغير مكلف وقابل للتطبيق على التحقيقات الانتقالية.

Introduction

سرطان المبيض هو أكثر الأورام الخبيثة النسائية فتكا في جميع أنحاء العالم¹. يبلغ خطر الإصابة بهذا السرطان مدى الحياة حوالي 1 من كل 70 ، مع متوسط عمر التشخيص عند 63 عاما². تصنف أورام المبيض الخبيثة الأولية نسيجيا على أنها إما ظهارية أو غير ظهارية. تمثل سرطانات المبيض الظهارية (EOC) أكثر من 90٪ من الأورام ، والنوع الفرعي الأكثر شيوعا هو السرطان المصلي عالي الدرجة (HGSC) ، والذي يمثل حوالي 70٪ -80٪ من EOCs. حاليا ، لا توجد طرق فحص فعالة للكشف عن المرض مبكرا. لذلك يتم تشخيص معظم المرضى في مرحلة متقدمة (أي الاتحاد الدولي لأمراض النساء والتوليد [FIGO] المرحلة الثالثة أو الرابعة) بعد انتشار السرطان في جميع أنحاء التجويف البريتوني².

العلاج القياسي في الخطوط الأمامية هو الجراحة الخلوية لإزالة جميع الأمراض العيانية المرئية ، يليها العلاج الكيميائي المساعد القائم على البلاتين لتدمير أي مرض مجهري متبقي. في حين كان هناك العديد من التطورات في علاج سرطان المبيض على مدى العقدين الماضيين ، فإن ما يقرب من 70 ٪ من المرضى الذين يعانون من مرض متقدم سوف ينتكسون في غضون 3 سنوات من العلاج³. بالنظر إلى التشخيص السيئ العام لهؤلاء المرضى ، تهدف الجهود البحثية الانتقالية الجارية والمستقبلية في EOC إلى تحديد المؤشرات الحيوية للكشف المبكر ، ومنع ورم خبيث ، وتحسين العلاجات الحالية لتجنب المقاومة وتطوير علاجات شخصية جديدة للسرطان.

ورم خبيث معمم داخل التجويف البريتوني والمقاومة الكيميائية المرتبطة به هما من القيود الرئيسية لتحسين علاج المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض ^4,5. الثرب ، وهو هيكل يشبه المريلة الدهنية يتدلى من المعدة فوق الأمعاء ، هو الموقع الرئيسي لورم خبيث لسرطان المبيض ^6,7. بالإضافة إلى وظيفته كحاجز مادي ، فقد ثبت أن الثرب له قدرات متجددة وعائية ويمتلك أنشطة مناعية ، والتي تعزز معا الأوعية الدموية ، وتسريع التئام الجروح ، والحد من العدوى⁸. يحتوي على تركيز عال من الخلايا الجذعية التي يمكن أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ويمكن أن تساعد في إصلاح الأنسجة التالفة. يمكن أن يلتهب الثرب استجابة للإصابة أو العدوى ، مما يؤدي إلى هجرة الخلايا المناعية إلى موقع الإصابة⁹. تطلق هذه الخلايا المناعية عوامل النمو والجزيئات الأخرى التي تساعد على تعزيز إصلاح وتجديد الأنسجة التالفة. الخلايا المناعية ، مثل الضامة والخلايا الليمفاوية وخلايا البلازما ، المترجمة في الثرب هي هياكل تعرف باسم "البقع اللبنية" ، وهي المسؤولة عن اكتشاف مسببات الأمراض ومهاجمتها وتنظيم المناعة البريتونية. كما ثبت أن الثرب يلعب دورا في تحفيز التحمل المناعي¹⁰ ، وهو قدرة الجهاز المناعي على تحمل المستضدات الذاتية وعدم مهاجمة الأنسجة السليمة. ومع ذلك ، فإن نفس الأنشطة المتعلقة بالمناعة تشارك أيضا في الاستجابات المرضية ، مثل نمو الأورام الأذنية ، ورم خبيث ، والهروب من المراقبة المناعية ^9,11. أظهرت الدراسات السابقة من مختبرنا وغيره دورا فريدا ونشطا للبيئة المكروية الدهنية في تثبيط الاستجابات المناعية المضادة للأورام وفي اكتساب المقاومة الكيميائية¹²،^13،14. لسوء الحظ ، لدينا معلومات محدودة عن الآليات الخلوية والجزيئية التي يوفر بها الثرب بيئة دقيقة مؤيدة للورم.

لفهم التفاعلات بين الخلايا السرطانية والثرب بشكل أفضل ، تم تطوير نظام ثقافة 3D يتكون من خلايا سرطان المبيض البشري ونباتات الثرب المشتقة من المريض. يمثل البروتوكول الموصوف هنا نموذجا جديدا خارج الجسم الحي للسرطان البريتوني. يحاكي هذا النموذج التطور الطبيعي لتكوين أورام سرطان المبيض في هذا النسيج الغني بالدهون. النموذج المقترح سهل التوليد وغير مكلف ويحتمل أن يكون قابلا للتطبيق على التحقيقات الانتقالية في أبحاث سرطان المبيض.

Protocol

تمت مراجعة بروتوكول البحث التالي والموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة واين ستيت (IRB). تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المرضى قبل الجراحة. يوضح الشكل 1 الخطوات العامة الثلاث في هذا البروتوكول.

1. إعداد أنسجة الثرب البشري

1. تحضير وسائط زراعة الثرب (DMEM / F12 + 10٪ مصل بقري جنيني + 1٪ بنسلين ستربتومايسين) وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. القسمة 30-40 مل من هذه الوسائط في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل أو حاوية عينة جراحية.
2. الحصول على عينات جراحية من خزعة الأذن أو جراحة استئصال الثرب. اغمر العينة المعقمة في وسائط زراعة الثرب فور إزالتها في غرفة العمليات. إذا كان سير العمل لا يسمح بذلك ، فضع العينة في وسائط ثقافة الثرب في أسرع وقت ممكن. انقل العينة عن طريق وضعها على الثلج وتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية حتى المعالجة.
   ملاحظة: سيحدد حجم عينة الثرب التي تمت إزالتها كمية الأنسجة العملية.
3. قم بمعالجة عينة الثرب في غضون 1-2 ساعة من التجميع باستخدام غطاء التدفق الرقائقي. تأكد من أن جميع المواد والأدوات معقمة أو معقمة.
4. أخرج الثرب من حاوية التجميع وانقله إلى طبق استزراع 100 مم. اغمر العينة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (1x PBS) واغسل العينة برفق لإزالة أي جلطات دموية أو حطام.
5. قطع الأنسجة إلى قطع (0.5 سم × 0.5 سم أو 100-200 ملغ. الشكل 2 أ) باستخدام مقص جراحي صغير أو مشرط 10-15 ملم. استخدم ملقط جراحي صغير للمساعدة في معالجة الأنسجة وتجنب سحق الثرب. إذا تم استخدام جهاز طاقة لإزالة عينة الثرب جراحيا ، فتجنب استخدام الأنسجة المشوهة عند الحافة المختومة.
6. ضع كل قطعة من الثرب المقطوع في آبار فردية من صفيحة استزراع مكونة من 24 بئرا واملأ الآبار ب 500 ميكرولتر من وسائط استزراع الثرب أو بحجم يكفي لتغطية الثرب دون السماح لقطعة الثرب بالطفو فوق أرضية البئر (الشكل 2 ب).
7. قم بتخزين قطع الثرب في وسائط استزراع طازجة على حرارة 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للحقن.

2. تحضير خلايا سرطان المبيض

1. زراعة خلايا سرطان المبيض البشري في قارورة مزرعة 75 سم 2 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ إلى التقاء 75٪ على الأقل بحلول يوم جمع الثرب.
   ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول خلايا سرطان المبيض البشري OCSC1-F2 الإيجابية mCherry الموصوفة سابقا¹⁵،^16،17،18. يمكن تعديله إلى أي خط خلية سرطانية موسوم بإشارة مضان.
2. تحضير الخلايا داخل غطاء التدفق الصفحي مباشرة بعد جمع عينة الثرب. تأكد من أن جميع المواد والأدوات معقمة أو معقمة.
3. أضف 10 مل من 1x PBS المعقم إلى قارورة الثقافة واغسل الخلايا عن طريق هز القارورة برفق. قم بإزالة 1x PBS ثم أضف 3 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA.
4. هز قارورة الثقافة برفق لتغطية جميع الخلايا ، ثم ضع القارورة في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO₂) لمدة لا تزيد عن 5 دقائق. اضغط على قارورة الثقافة لفصل الخلايا تماما ، ثم قم بتحييد التربسين بإضافة 3 مل من وسائط زراعة الثرب.
5. امزج تعليق الخلية عن طريق السحب ، ثم انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي التعليق لمدة 5 دقائق عند 1200 × جم عند 24 درجة مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 6 مل من وسائط زراعة الثرب الطازجة.
6. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. تمييع تعليق الخلية إلى ما لا يقل عن 100000 خلية لكل 100-200 ميكرولتر من التعليق. هذا هو حجم الحقن في كل قطعة قطع من الثرب.
7. نقل عدد مناسب من الخلايا إلى دورق مزرعة جديد لمواصلة مرور الخلية.

3. حقن خلايا سرطان المبيض

1. استخدم حقنة سعة 1 مل لسحب تعليق الخلية ، ثم قم بتوصيل إبرة 26-G. لا تقم بسحب تعليق الخلية باستخدام الإبرة ، لأن هذا يمكن أن يجزئ الخلايا.
2. استخدم ملقط جراحي صغير لالتقاط قطعة من الثرب المقطوع. انقل الثرب إلى طبق معقم منفصل لتسهيل الحقن. اخترق الثرب برفق بطرف الإبرة وحقن كمية صغيرة من تعليق الخلية في الأنسجة (الشكل 2C).
3. كرر الحقن على عدة مناطق من الثرب إلى حجم إجمالي لا يقل عن 100 ميكرولتر أو 100000 خلية. لاحظ أن الكثير من تعليق الخلية قد يبدو أنه يتجمع حول العينة. إذا كان هناك قلق بشأن جودة الحقن ، فكرر الحقن أو حقن كمية أكبر من تعليق الخلية في العينة.
4. أعد عينات الثرب المحقونة في كل بئر من صفيحة استزراع 24 بئرا. لاحظ أن حجم وسائط زراعة الثرب يصل إلى مستوى يغطي الثرب دون السماح له بالطفو. تعامل بعناية مع اللوحة وضعها داخل حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO₂).
5. اختياري: استخدم Matrigel (مصفوفة الغشاء القاعدي) لتعليق أنسجة الثرب في مصفوفة صلبة للسماح بحقن أسهل وتوصيل معلق خلوي أكثر تركيزا.
   1. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي عند 4 درجات مئوية واخلطها بنسبة 1: 1 مع وسائط زراعة الثرب مباشرة قبل الاستخدام. يخزن خليط مصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج أو على حرارة 4 درجات مئوية حتى الحقن. املأ الآبار الفارغة بما يكفي من خليط مصفوفة الغشاء القاعدي لغمر قطعة مقطوعة من الثرب.
   2. ضع العينات في خليط مصفوفة الغشاء القاعدي ثم ضع صفيحة استزراع البئر 24 في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO₂) لمدة 20 دقيقة. بمجرد أن يتجمد الخليط ، استمر في الحقن كما هو موضح أعلاه.
6. تأكيد الحقن الناجح باستخدام التصوير بالفلورسنت. تأكد من تصور خط من إشارة الفلورسنت في مواقع الحقن (الشكل 2D). لاحظ أن العدد الفعلي للخلايا المرتبطة بالثرب بعد الحقن لا يمكن التنبؤ به.

4. الزراعة المشتركة للثرب البشري وخلايا سرطان المبيض

1. قم بتغيير الوسائط كل 48-72 ساعة بإضافة 500-2000 ميكرولتر من وسائط زراعة الثرب الطازجة. لا تقم بسحب الوسائط مباشرة فوق أنسجة الثرب ، لأن هذا قد يحل محل الخلايا السرطانية. لاحظ أنه إذا تحول لون الوسائط إلى اللون الأصفر ، فقم بتغيير الوسائط.
   ملاحظة: يعتمد تواتر تغيير الوسائط على حجم الوسائط المستخدمة ومسار نمو الخلايا السرطانية. بمجرد أن تزرع الخلايا السرطانية الثرب ، لم يعد من المهم ما إذا كانت قطعة الثرب عائمة أم لا.
2. اختياري: إذا تم استخدام مصفوفة غشاء القاعدية ، عادة إذابة المصفوفة بحلول وقت تغيير الوسائط الأول.
3. مراقبة نمو أورام سرطان المبيض باستخدام التصوير بالفلورسنت. تواتر التصوير هو حسب تقدير المحقق. توقع وجود أورام صغيرة بحوالي 14 يوما (الشكل 3A-C). قد تختلف النتائج حسب جودة الحقن.
4. قم بإنهاء التجربة استنادا إلى نقطة نهاية التجربة.
   ملاحظة: لوحظ نمو الورم وسلامة أنسجة الثرب بعد 50 يوما.

النتائج

كان التأسيس الناجح لخلايا سرطان المبيض في عينات الثرب واضحا بحلول اليوم 14 تقريبا (الشكل 3A-C). تم تحضير ما لا يقل عن 24 نسخة مكررة وحقنها لكل عينة تم جمعها للسماح بإجراء مزيد من التجارب. تمت مراقبة نمو الورم عن طريق التقاط صور الفلورسنت (الشكل 3D

Discussion

باستخدام هذا البروتوكول ، تم تطوير نموذج قبل السريري لسرطان الصفاق لسرطان المبيض باستخدام مزيج من التقنيات الأساسية في المختبر وخارج الجسم الحي. لوحظ نمو تدريجي للورم على مدار 50 يوما من الثقافة المشتركة بعد بذر عينات الثرب بخلايا سرطان المبيض البشري mCherry + OCSC1-F2. تم تطوير هذه الطر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo