מודל Ex Vivo של סרטן השחלות גרורות פריטוניאליות באמצעות Omentum אנושי

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הקמתו של מודל אקס ויו תלת-ממדי (3D) של אינטראקציה בין תאים סרטניים ל-omentum. המודל מספק פלטפורמה להבהרת מנגנונים מעודדי גידול בתוך נישת השומן ולבדיקת טיפולים חדשניים.

Abstract

סרטן השחלות הוא הממאירות הגינקולוגית הקטלנית ביותר. האומנטום ממלא תפקיד מפתח במתן מיקרו-סביבה תומכת לתאי סרטן שחלות גרורתיים, כמו גם אותות מודולריים חיסוניים המאפשרים סבילות לגידול. עם זאת, יש לנו מודלים מוגבלים המחקים באופן הדוק את האינטראקציה בין תאי סרטן השחלות ורקמות עשירות בשומן. כדי להבין עוד יותר את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבאמצעותם האומנטום מספק מיקרו-סביבה פרו-גידולית, פיתחנו מודל 3D ex vivo ייחודי של אינטראקציה בין תאים סרטניים לאומנטום (omentum). באמצעות אומנטום אנושי, אנו מסוגלים לגדל תאי סרטן שחלות בתוך מיקרו-סביבה עשירה בשומן זו ולנטר את הגורמים האחראים לצמיחת הגידול ולוויסות מערכת החיסון. בנוסף למתן פלטפורמה לחקר מיקרו-סביבה סרטנית עשירה בשומן, המודל מספק פלטפורמה מצוינת לפיתוח והערכה של גישות טיפוליות חדשניות למיקוד תאי סרטן גרורתיים בנישה זו. המודל המוצע קל ליצור, זול וישים לחקירות תרגומיות.

Introduction

סרטן השחלות הוא הממאירות הגינקולוגית הקטלנית ביותר בעולם¹. הסיכון לכל החיים לפתח סרטן זה הוא כ -1 ל -70, כאשר הגיל החציוני של האבחנה הוא 63 שנים². ממאירויות שחלות ראשוניות מסווגות היסטולוגית כאפיתל או לא אפיתל. סרטן שחלות אפיתל (EOC) מייצג מעל 90% מהגידולים, ותת-הסוג הנפוץ ביותר הוא קרצינומה סרוטית בדרגה גבוהה (HGSC), המהווה כ-70%-80% ממקרי EOC. נכון לעכשיו, אין שיטות סינון יעילות כדי לזהות מחלה מוקדם. אז רוב החולים מאובחנים בשלב מתקדם (כלומר, Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] שלב III או IV) לאחר שהסרטן התפשט בכל חלל הצפק².

טיפול סטנדרטי בקו החזית הוא ניתוח ציטורדוקטיבי להסרת כל המחלה המקרוסקופית הנראית לעין, ואחריו כימותרפיה מבוססת פלטינה אדג'ובנטית כדי להרוס כל מחלה מיקרוסקופית שיורית. בעוד שבשני העשורים האחרונים חלה התקדמות רבה בטיפול בסרטן השחלות, כ-70% מהחולות עם מחלה מתקדמת יחזרו תוך 3 שנים מהטיפול³. בהתחשב בפרוגנוזה הגרועה הכוללת של חולים אלה, מאמצי מחקר תרגומיים מתמשכים ועתידיים ב- EOC שואפים לזהות סמנים ביולוגיים לגילוי מוקדם, למנוע גרורות, לשפר את הטיפולים הנוכחיים כדי להתחמק מעמידות ולפתח טיפולים מותאמים אישית חדשים לסרטן.

גרורות כלליות בתוך חלל הצפק והעמידות הכימותרפית הנלווית אליו הן שתיים מהמגבלות העיקריות לשיפור הטיפול בחולות עם סרטן השחלות ^4,5. האומנטום, מבנה דמוי סינר שומני התלוי מהקיבה מעל המעיים, הוא האתר העיקרי של גרורות סרטן השחלות ^6,7. בנוסף לתפקודו כמחסום פיזי, האומנטום הוכח כבעל יכולות התחדשות ואנגיוגניות ובעל פעילות חיסונית, אשר יחד מקדמים את כלי הדם, מאיצים ריפוי פצעים ומגבילים זיהום⁸. הוא מכיל ריכוז גבוה של תאי גזע שיכולים להתמיין לסוגי תאים שונים ויכולים לסייע בתיקון רקמות פגועות. omentum יכול להיות מודלק בתגובה לפציעה או זיהום, אשר מפעיל את ההגירה של תאים חיסוניים לאתר של פציעה⁹. תאי חיסון אלה משחררים גורמי גדילה ומולקולות אחרות המסייעות לקדם את התיקון וההתחדשות של רקמות פגועות. תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים, לימפוציטים ותאי פלזמה, הממוקמים באומנטום הם מבנים המכונים "כתמים חלביים", האחראים על איתור ותקיפה של פתוגנים וויסות חסינות הצפק. כמו כן, הוכח כי האומנטום ממלא תפקיד בגרימת סבילות חיסונית¹⁰, שהיא היכולת של מערכת החיסון לסבול אנטיגנים עצמיים ולא לתקוף רקמות בריאות. עם זאת, אותן פעילויות הקשורות למערכת החיסון מעורבות גם בתגובות פתולוגיות, כגון צמיחת גידולים אומנטליים, גרורות ובריחה ממעקב חיסוני ^9,11. מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו ואחרים הדגימו תפקיד ייחודי ופעיל של מיקרו-סביבת השומן בעיכוב תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות וברכישת עמידות לכימותרפיה^12,13,14. למרבה הצער, יש לנו מידע מוגבל על המנגנונים התאיים והמולקולריים שבאמצעותם האומנטום מספק מיקרו-סביבה פרו-גידולית.

כדי להבין טוב יותר את יחסי הגומלין בין תאים סרטניים לבין האומנטום, פותחה מערכת תרבית תלת-ממדית המורכבת מתאי סרטן שחלות אנושיים וצמחי אומנטום שמקורם במטופלות. הפרוטוקול המתואר כאן מייצג מודל אקס ויו חדשני של קרצינומטוזיס פריטוניאלי. מודל זה מחקה את ההתקדמות הטבעית של גידולי סרטן השחלות ברקמה עשירה בשומן. המודל המוצע קל לייצור, זול ועשוי להיות ישים למחקרים תרגומיים בחקר סרטן השחלות.

Protocol

פרוטוקול המחקר הבא נבדק ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת וויין סטייט (IRB). הסכמה מדעת התקבלה מכל המטופלים לפני הניתוח. איור 1 ממחיש את שלושת השלבים הכלליים בפרוטוקול זה.

1. הכנת רקמת omentum האנושי

1. הכינו תרבית אומנטום (DMEM/F12 + 10% סרום בקר עוברי + 1% פניצילין-סטרפטומיצין) ואחסנו בטמפרטורה של 4°C. Aliquot 30-40 מ"ל של מדיה זו לתוך סטרילי 50 מ"ל צינור חרוטי או מיכל דגימה כירורגית.
2. קבל דגימות כירורגיות מביופסיה אומנטלית או ניתוח omentectomy. יש לטבול את הדגימה הסטרילית בתרבית אומנטום מיד לאחר ההסרה בחדר הניתוח. אם זרימת העבודה אינה מאפשרת זאת, מקם את הדגימה במדיה של תרבית omentum בהקדם האפשרי. מעבירים את הדגימה על ידי הנחתה על קרח ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד.
   הערה: גודל דגימת האומנטום שהוסרה יקבע את כמות הרקמה הניתנת לעבודה.
3. עבד את דגימת omentum בתוך 1-2 שעות של איסוף באמצעות מכסה מנוע זרימה למינרית. ודא שכל החומרים והכלים סטריליים או מעוקרים.
4. מוציאים את האומנטום ממיכל האיסוף ומעבירים לצלחת תרבית בקוטר 100 מ"מ. יש לטבול את הדגימה במי מלח חוצצי פוספט 1x (1x PBS) ולשטוף בעדינות את הדגימה כדי להסיר קרישי דם או פסולת.
5. חותכים את הרקמה לחתיכות (0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ או 100-200 מ"ג; איור 2A) באמצעות מספריים כירורגיים קטנים או אזמל 10-15 מ"מ. השתמש מלקחיים כירורגיים קטנים כדי לעזור לתפעל את הרקמה ולמנוע ריסוק omentum. אם נעשה שימוש במכשיר אנרגיה כדי להסיר בניתוח את דגימת האומנטום, הימנע משימוש ברקמה המעוותת בקצה האטום.
6. הניחו כל פיסת אומנטום חתוכה בבארות נפרדות של צלחת תרבית בת 24 בארות ומלאו את הבארות ב-500 מיקרוליטר של מצע תרבית אומנטום או בנפח שמספיק כדי לכסות את האומנטום מבלי לאפשר לחתיכת האומנטום לצוף מעל רצפת הבאר (איור 2B).
7. אחסנו חתיכות אומנטום במצע תרבית טרי בטמפרטורה של 4°C עד להזרקה.

2. הכנת תאי סרטן השחלות

1. תרבית תאי סרטן שחלות אנושיים בבקבוק תרבית^של 75 ס"מ 2 ב 37 ° C ו 5% CO₂ לפחות 75% מפגש עד יום איסוף omentum.
   הערה: פרוטוקול זה משתמש בתאי סרטן שחלות אנושיים מסוג OCSC1-F2 חיוביים ל-mCherry שתוארו בעבר^{כ-15,16,17,18}. ניתן לשנות אותו לכל קו תאים סרטניים המתויג באות פלואורסצנטי.
2. הכינו תאים בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית מיד לאחר איסוף דגימת האומנטום. ודא שכל החומרים והכלים סטריליים או מעוקרים.
3. הוסף 10 מ"ל של PBS סטרילי 1x PBS לבקבוק התרבית ושטוף את התאים על ידי נדנוד עדין של הצלוחית. הסר את 1x PBS ולאחר מכן הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA.
4. נענעו בעדינות את בקבוק התרבית כדי לצפות את כל התאים, ולאחר מכן הניחו את הבקבוק באינקובטור (37°C ו-5% CO₂) למשך לא יותר מ-5 דקות. הקש על בקבוק התרבית כדי לנתק לחלוטין את התאים, ולאחר מכן נטרל טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיה תרבית omentum.
5. מערבבים את תרחיף התא על ידי פיפטינג, ולאחר מכן מעבירים את התרחיף לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את המתלים למשך 5 דקות ב-1,200 x גרם ב-24°C. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 6 מ"ל של מדיה תרבית omentum טרי.
6. ספור את התאים באמצעות hemacytometer. לדלל את תרחיף התא לפחות 100,000 תאים לכל 100-200 μL של תרחיף. זהו נפח ההזרקה לכל חתיכת אומנטום חתוכה.
7. העבר מספר מתאים של תאים לבקבוק תרבית חדש כדי להמשיך את מעבר התא.

3. הזרקת תאי סרטן השחלות

1. השתמש מזרק 1 מ"ל כדי לצייר את השעיית התא, ולאחר מכן לחבר מחט 26-G. אין לצייר את השעיית התא באמצעות המחט, שכן זה יכול לשבור את התאים.
2. השתמש במלקחיים כירורגיים קטנים כדי להרים חתיכת omentum חתוך. מעבירים את האומנטום לצלחת סטרילית נפרדת כדי להקל על ההזרקה. ניקבו בעדינות את האומנטום עם קצה המחט והזריקו נפח קטן של תרחיף תאים לתוך הרקמה (איור 2C).
3. הזרקה חוזרת על פני מספר אזורים של omentum לנפח כולל של לפחות 100 μL או 100,000 תאים. שימו לב שחלק גדול מתרחיף התא עשוי להיראות כאילו הוא מצטבר סביב הדגימה. אם יש חשש לגבי איכות ההזרקה, יש לחזור על הזריקה או להזריק נפח גדול יותר של תרחיף תאים לדגימה.
4. מחזירים את דגימות האומנטום המוזרקות לכל באר של צלחת תרבית בת 24 בארות. שימו לב שנפח המדיה של תרבות האומנטום הוא ברמה שמכסה את האומנטום מבלי לאפשר לו לצוף. בזהירות לטפל בצלחת ולהניח אותו בתוך אינקובטור (37 ° C ו 5% CO₂).
5. אופציונלי: השתמש במטריג'ל (מטריצת קרום מרתף) כדי להשהות רקמת אומנטום במטריצה מוצקה כדי לאפשר הזרקה קלה יותר ותרחיף תאים מרוכז יותר.
   1. הפשירו את מטריצת קרום המרתף בטמפרטורה של 4°C וערבבו ביחס של 1:1 עם מדיית תרבית אומנטום מיד לפני השימוש. אחסנו את תערובת מטריצת קרום המרתף על קרח או בטמפרטורה של 4°C עד להזרקה. מלאו בארות ריקות בתערובת מטריצת קרום מרתף מספיק כדי לטבול חתיכת omentum חתוך.
   2. מניחים דגימות לתוך תערובת מטריצת קרום המרתף ולאחר מכן מניחים את צלחת תרבית 24 בארות באינקובטור (37 ° C ו 5% CO₂) במשך 20 דקות. לאחר שהתערובת התמצקה, המשיכו בהזרקה כמתואר לעיל.
6. ודא הזרקה מוצלחת באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. ודאו שפס של אות פלואורסצנטי מוצג באופן חזותי באתרי ההזרקה (איור 2D). שים לב כי מספר התאים בפועל מחובר omentum לאחר ההזרקה הוא בלתי צפוי.

4. תרבות משותפת של omentum אנושי ותאי סרטן השחלות

1. שנה מדיה כל 48-72 שעות על ידי הוספת 500-2000 μL של מדיה תרבותית omentum טרי. אין לצנרת מדיה ישירות על גבי רקמת omentum, שכן זה עלול לעקור תאים סרטניים. שים לב שאם צבע המדיה הופך לצהוב, שנה את המדיה.
   הערה: תדירות שינוי המדיה תהיה תלויה בנפח המדיה בשימוש ובמסלול צמיחת התאים הסרטניים. ברגע שהתאים הסרטניים זרעו את האומנטום, כבר לא חשוב אם חתיכת האומנטום צפה או לא.
2. אופציונלי: אם נעשה שימוש במטריצת קרום מרתף, המטריצה בדרך כלל תתמוסס בזמן שינוי המדיה הראשון.
3. עקוב אחר הצמיחה של גידולים סרטניים בשחלות באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. תדירות ההדמיה נתונה לשיקול דעתו של החוקר. צפו עדויות לגידולים קטנים בכ-14 יום (איור 3A-C). התוצאות עשויות להשתנות בהתאם לאיכות ההזרקה.
4. סיים את הניסוי בהתבסס על נקודת הקצה של הניסוי.
   הערה: צמיחת הגידול ושלמות רקמת האומנטום נצפו ב-50 הימים האחרונים.

תוצאות

התבססות מוצלחת של תאי סרטן השחלות לתוך דגימות omentum נראתה בערך ביום ה-14 (איור 3A-C). לפחות 24 עותקים משוכפלים הוכנו והוזרקו לכל דגימה שנאספה כדי לאפשר ניסויים נוספים. צמיחת הגידול נוטרה על-ידי צילום תמונות פלואורסצנטיות (איור 3D,E). תמונ...

Discussion

באמצעות פרוטוקול זה, פותח מודל פרה-קליני של קרצינומטוזיס פריטוניאלי לסרטן השחלות תוך שימוש בשילוב של טכניקות בסיסיות במבחנה ואקס ויוו. גידול גידול מתקדם נצפה לאורך 50 יום של תרבית משותפת לאחר זריעת דגימות omentum עם mCherry+ OCSC1-F2 תאי סרטן שחלות אנושיים. שיטה זו פותחה ועברה אופטימיזציה ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo