Un modèle ex vivo de métastases péritonéales du cancer de l’ovaire à l’aide d’un épiploon humain

Résumé

Ce protocole décrit l’établissement d’un modèle tridimensionnel (3D) ex vivo de l’interaction cellule-épiploon cancéreux. Le modèle fournit une plate-forme pour élucider les mécanismes pro-tumoraux dans la niche adipeuse et pour tester de nouvelles thérapies.

Résumé

Le cancer de l’ovaire est la tumeur maligne gynécologique la plus mortelle. L’épiploon joue un rôle clé en fournissant un microenvironnement favorable aux cellules cancéreuses de l’ovaire métastatiques ainsi que des signaux immunomodulateurs qui permettent la tolérance tumorale. Cependant, nous disposons de modèles limités qui imitent étroitement l’interaction entre les cellules cancéreuses de l’ovaire et les tissus riches en tissu adipeux. Pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’épiploon fournit un microenvironnement pro-tumoral, nous avons développé un modèle 3D ex vivo unique de l’interaction cellule-épiploon cancéreux. À l’aide de l’épiploon humain, nous sommes en mesure de cultiver des cellules cancéreuses de l’ovaire dans ce microenvironnement riche en graisse et de surveiller les facteurs responsables de la croissance tumorale et de la régulation immunitaire. En plus de fournir une plate-forme pour l’étude de ce microenvironnement tumoral riche en graisse, le modèle fournit une excellente plate-forme pour le développement et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques pour cibler les cellules cancéreuses métastatiques dans cette niche. Le modèle proposé est facile à générer, peu coûteux et applicable aux investigations translationnelles.

Introduction

Le cancer de l’ovaire est la tumeur maligne gynécologique la plus mortelle dans le monde¹. Le risque de développer ce cancer au cours de la vie est d’environ 1 sur 70, l’âge médian du diagnostic étant de 63 ans². Les tumeurs malignes primitives de l’ovaire sont classées histologiquement comme épithéliales ou non épithéliales. Les cancers épithéliaux de l’ovaire (COE) représentent plus de 90 % des tumeurs, et le sous-type le plus courant est le carcinome séreux de haut grade (HGSC), qui représente environ 70 à 80 % des COE. À l’heure actuelle, il n’existe aucune méthode de dépistage efficace pour détecter la maladie à un stade précoce. Ainsi, la plupart des patients sont diagnostiqués à un stade avancé (c’est-à-dire le stade III ou IV de la Fédération internationale de gynécologie et d’obstétrique [FIGO]) après que le cancer se soit propagé dans toute la cavité péritonéale².

Le traitement de première ligne standard est la chirurgie cytoréductrice pour enlever toutes les maladies macroscopiques visibles, suivie d’une chimiothérapie adjuvante à base de platine pour détruire toute maladie microscopique résiduelle. Bien qu’il y ait eu de nombreux progrès dans le traitement du cancer de l’ovaire au cours des deux dernières décennies, environ 70 % des patientes atteintes d’une maladie avancée rechuteront dans les 3 ans suivant le traitement³. Compte tenu du mauvais pronostic global de ces patients, les efforts de recherche translationnelle en cours et à venir dans le cadre de l’EOC visent à identifier des biomarqueurs pour une détection précoce, à prévenir les métastases, à améliorer les thérapies actuelles pour échapper à la résistance et à développer de nouveaux traitements personnalisés contre le cancer.

Les métastases généralisées dans la cavité péritonéale et la chimiorésistance qui leur est associée sont deux des principales limites à l’amélioration du traitement des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire ^4,5. L’épiploon, une structure graisseuse en forme de tablier qui pend de l’estomac au-dessus des intestins, est l’un des principaux sites de métastases du cancer de l’ovaire ^6,7. En plus de sa fonction de barrière physique, il a été démontré que l’épiploon a des capacités régénératrices et angiogéniques et possède des activités immunitaires qui, ensemble, favorisent la vascularisation, accélèrent la cicatrisation des plaies et limitent l’infection⁸. Il contient une forte concentration de cellules souches qui peuvent se différencier en différents types de cellules et peuvent aider à réparer les tissus endommagés. L’épiploon peut s’enflammer en réponse à une blessure ou à une infection, ce qui déclenche la migration des cellules immunitaires vers le site de la blessure⁹. Ces cellules immunitaires libèrent des facteurs de croissance et d’autres molécules qui aident à favoriser la réparation et la régénération des tissus endommagés. Les cellules immunitaires, telles que les macrophages, les lymphocytes et les plasmocytes, localisées dans l’épiploon sont des structures connues sous le nom de « taches laiteuses », qui sont responsables de la détection et de l’attaque des agents pathogènes et de la régulation de l’immunité péritonéale. Il a également été démontré que l’épiploon joue un rôle dans l’induction de la tolérance immunitaire¹⁰, c’est-à-dire la capacité du système immunitaire à tolérer les auto-antigènes et à ne pas attaquer les tissus sains. Cependant, les mêmes activités liées au système immunitaire sont également impliquées dans les réponses pathologiques, telles que la croissance des tumeurs omentales, les métastases et l’échappement de la surveillance immunitaire ^9,11. Des études antérieures de notre laboratoire et d’autres ont démontré un rôle unique et actif du microenvironnement adipeux dans l’inhibition des réponses immunitaires anti-tumorales et dans l’acquisition de la chimiorésistance^12,13,14. Malheureusement, nous disposons de peu d’informations sur les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’épiploon fournit un microenvironnement pro-tumoral.

Pour mieux comprendre les interactions entre les cellules cancéreuses et l’épiploon, un système de culture 3D composé de cellules cancéreuses de l’ovaire humain et d’explants d’épiploon dérivés de patientes a été développé. Le protocole décrit ici représente un nouveau modèle ex vivo de carcinose péritonéale. Ce modèle imite la progression naturelle de la tumorigenèse du cancer de l’ovaire dans ce tissu riche en graisse. Le modèle proposé est facile à générer, peu coûteux et potentiellement applicable aux recherches translationnelles dans la recherche sur le cancer de l’ovaire.

Protocole

Le protocole de recherche suivant a été examiné et approuvé par le Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Le consentement éclairé de tous les patients a été obtenu avant la chirurgie. La figure 1 illustre les trois étapes générales de ce protocole.

1. Préparation du tissu de l’épiploon humain

1. Préparer les milieux de culture de l’épiploon (DMEM/F12 + 10 % de sérum de veau fœtal + 1 % de pénicilline-streptomycine) et les conserver à 4 °C. Aliquote 30 à 40 mL de ce milieu dans un tube conique stérile de 50 mL ou un récipient pour échantillon chirurgical.
2. Obtenir des échantillons chirurgicaux provenant d’une biopsie omentale ou d’une chirurgie d’omentectomie. Immerger l’échantillon stérile dans un milieu de culture d’épiploon immédiatement après le retrait dans la salle d’opération. Si le flux de travail ne le permet pas, placez l’échantillon dans un milieu de culture d’épiploon dès que possible. Transférez l’échantillon en le plaçant sur de la glace et conservez-le à 4 °C jusqu’au traitement.
   REMARQUE : La taille de l’échantillon d’épiploon retiré déterminera la quantité de tissu exploitable.
3. Traitez l’échantillon d’épiploon dans les 1 à 2 heures suivant le prélèvement à l’aide d’une hotte à flux laminaire. Assurez-vous que tous les matériaux et outils sont stériles ou stérilisés.
4. Retirez l’épiploon du récipient de collecte et transférez-le dans une boîte de culture de 100 mm. Plongez l’échantillon dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) et lavez doucement l’échantillon pour éliminer tout caillot sanguin ou débris.
5. Coupez le tissu en morceaux (0,5 cm x 0,5 cm ou 100-200 mg ; Graphique 2A) à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux ou d’un scalpel de 10 à 15 mm. Utilisez de petites pinces chirurgicales pour aider à manipuler le tissu et éviter d’écraser l’épiploon. Si un dispositif énergétique a été utilisé pour retirer chirurgicalement l’échantillon d’épiploon, évitez d’utiliser le tissu déformé au bord scellé.
6. Placer chaque morceau d’épiploon coupé dans les puits individuels d’une plaque de culture à 24 puits et remplir les puits avec 500 μL de milieu de culture d’épiploon ou jusqu’à un volume suffisant pour recouvrir l’épiploon sans permettre au morceau d’épiploon de flotter au-dessus du fond du puits (figure 2B).
7. Conserver les morceaux d’épiploon dans des milieux de culture frais à 4 °C jusqu’au moment de l’injection.

2. Préparation des cellules cancéreuses de l’ovaire

1. Cultiver des cellules cancéreuses de l’ovaire humain dans un flacon de culture de 75^cm2 à 37 °C et 5 % de CO₂ jusqu’à une confluence d’au moins 75 % le jour du prélèvement de l’épiploon.
   REMARQUE : Ce protocole utilise des cellules cancéreuses de l’ovaire humaines OCSC1-F2 mCherry-positives précédemment décrites^15,16,17,18. Il peut être modifié en n’importe quelle lignée cellulaire cancéreuse marquée avec un signal de fluorescence.
2. Préparez les cellules à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire immédiatement après le prélèvement de l’échantillon d’épiploon. Assurez-vous que tous les matériaux et outils sont stériles ou stérilisés.
3. Ajouter 10 mL de PBS stérile 1x dans le flacon de culture et laver les cellules en balançant doucement le flacon. Retirez le 1x PBS, puis ajoutez 3 mL de trypsine-EDTA à 0,05 %.
4. Basculez doucement le flacon de culture pour enrober toutes les cellules, puis placez le flacon dans un incubateur (37 °C et 5 % de CO₂) pendant 5 minutes maximum. Tapotez le flacon de culture pour détacher complètement les cellules, puis neutralisez la trypsine en ajoutant 3 mL de milieu de culture d’épiploon.
5. Mélangez la suspension cellulaire par pipetage, puis transférez la suspension dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger la suspension pendant 5 min à 1 200 x g à 24 °C. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 6 mL de milieu de culture d’épiploon frais.
6. Comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre. Diluer la suspension cellulaire à au moins 100 000 cellules par 100-200 μL de suspension. Il s’agit du volume d’injection dans chaque morceau d’épiploon coupé.
7. Transférez un nombre approprié de cellules dans un nouveau flacon de culture pour poursuivre le passage des cellules.

3. Injection de cellules cancéreuses de l’ovaire

1. À l’aide d’une seringue de 1 ml, aspirer la suspension cellulaire, puis fixer une aiguille de 26 G. Ne tirez pas la suspension cellulaire à l’aide de l’aiguille, car cela pourrait fragmenter les cellules.
2. Utilisez une petite pince chirurgicale pour ramasser un morceau d’épiploon coupé. Transférez l’épiploon dans une boîte stérile de travail séparée pour faciliter l’injection. Percez doucement l’épiploon avec la pointe de l’aiguille et injectez un petit volume de suspension cellulaire dans le tissu (Figure 2C).
3. Répétez l’injection sur plusieurs zones de l’épiploon jusqu’à un volume total d’au moins 100 μL ou 100 000 cellules. Notez qu’une grande partie de la suspension cellulaire peut sembler s’accumuler autour de l’échantillon. S’il y a des doutes concernant la qualité de l’injection, répétez l’injection ou injectez un plus grand volume de suspension cellulaire dans l’échantillon.
4. Remettez les échantillons d’épiploon injectés dans chaque puits d’une plaque de culture à 24 puits. Notez que le volume du milieu de culture de l’épiploon est à un niveau qui recouvre l’épiploon sans le laisser flotter. Manipulez délicatement l’assiette et placez-la dans un incubateur (37 °C et 5 % de CO₂).
5. FACULTATIF : Utilisez Matrigel (matrice de membrane basale) pour suspendre le tissu de l’épiploon dans une matrice solide afin de faciliter l’injection et d’administrer une suspension cellulaire plus concentrée.
   1. Décongeler la matrice de la membrane basale à 4 °C et mélanger dans un rapport de 1 :1 avec un milieu de culture d’épiploon immédiatement avant l’utilisation. Conserver le mélange de matrice de membrane basale sur de la glace ou à 4 °C jusqu’à l’injection. Remplissez les puits vides avec suffisamment de mélange de matrice de membrane basale pour immerger un morceau coupé d’épiploon.
   2. Placer les échantillons dans le mélange de matrice membranaire basale, puis placer la plaque de culture à 24 puits dans un incubateur (37 °C et 5 % de CO₂) pendant 20 min. Une fois le mélange solidifié, continuez avec l’injection comme décrit ci-dessus.
6. Confirmez la réussite de l’injection à l’aide de l’imagerie par fluorescence. Assurez-vous qu’une traînée de signal fluorescent est visualisée aux sites d’injection (Figure 2D). Notez que le nombre réel de cellules attachées à l’épiploon après l’injection est imprévisible.

4. Co-culture de cellules cancéreuses de l’épiploon humain et de l’ovaire

1. Changez de milieu toutes les 48 à 72 h en ajoutant 500 à 2000 μL de milieu de culture d’épiploon frais. Ne pas pipeter le milieu directement sur le tissu de l’épiploon, car cela pourrait déplacer les cellules cancéreuses. Notez que si la couleur du support devient jaune, changez le support.
   REMARQUE : La fréquence des changements de milieu dépend du volume de milieu utilisé et de la trajectoire de croissance des cellules cancéreuses. Une fois que les cellules cancéreuses ont ensemencé l’épiploon, il n’est plus important de savoir si le morceau d’épiploon flotte ou non.
2. FACULTATIF : Si une matrice de membrane basale a été utilisée, la matrice sera généralement dissoute au moment du premier changement de milieu.
3. Surveiller la croissance des tumeurs cancéreuses de l’ovaire à l’aide de l’imagerie fluorescente. La fréquence de l’imagerie est laissée à la discrétion de l’investigateur. Anticipez les signes de petites tumeurs d’environ 14 jours (Figure 3A-C). Les résultats peuvent varier en fonction de la qualité de l’injection.
4. Mettez fin à l’expérience en fonction du point de terminaison de l’expérience.
   REMARQUE : La croissance tumorale et l’intégrité du tissu de l’épiploon ont été observées après 50 jours.

Résultats

L’établissement réussi de cellules cancéreuses de l’ovaire dans les échantillons d’épiploon était évident vers le 14e jour (figure 3A-C). Au moins 24 répétitions ont été préparées et injectées par échantillon prélevé pour permettre d’autres expériences. La croissance tumorale a été surveillée par la prise d’images fluorescentes (Figure 3D,E). Les images devaient être interprétée...

Discussion

À l’aide de ce protocole, un modèle préclinique de carcinose péritonéale pour le cancer de l’ovaire a été développé en utilisant une combinaison de techniques de base in vitro et ex vivo. Une croissance tumorale progressive a été observée au cours des 50 jours de co-culture après l’ensemencement d’échantillons d’épiploon avec des cellules cancéreuses de l’ovaire humaines mCherry+ OCSC1-F2. Cette méthode a été développée et optimisée au cours de plusieurs essais expérim...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo