Modelo Ex Vivo de Metástase Peritoneal de Câncer de Ovário Utilizando Omento Humano

Resumo

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo tridimensional (3D) ex vivo de interação célula-omento canceroso. O modelo fornece uma plataforma para elucidar mecanismos pró-tumorais dentro do nicho adiposo e para testar novas terapias.

Resumo

O câncer de ovário é a neoplasia ginecológica mais mortal. O omento desempenha um papel fundamental no fornecimento de um microambiente de suporte para células de câncer de ovário metastático, bem como sinais imunomodulatórios que permitem a tolerância tumoral. No entanto, temos modelos limitados que imitam de perto a interação entre células cancerosas do ovário e tecidos ricos em adiposo. Para entender melhor os mecanismos celulares e moleculares pelos quais o omento fornece um microambiente pró-tumoral, desenvolvemos um modelo 3D ex vivo único de interação célula-omento cancerígeno. Usando omento humano, somos capazes de cultivar células cancerosas de ovário dentro deste microambiente rico em adiposo e monitorar os fatores responsáveis pelo crescimento do tumor e regulação imunológica. Além de fornecer uma plataforma para o estudo deste microambiente tumoral rico em adiposo, o modelo fornece uma excelente plataforma para o desenvolvimento e avaliação de novas abordagens terapêuticas para atingir células cancerosas metastáticas neste nicho. O modelo proposto é de fácil geragem, barato e aplicável a investigações translacionais.

Introdução

O câncer de ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais letal do^mundo1. O risco ao longo da vida de desenvolver esse câncer é de aproximadamente 1 em 70, com mediana de idade de diagnóstico de 63 anos². Neoplasias ovarianas primárias são classificadas histologicamente como epiteliais ou não epiteliais. Os cânceres epiteliais de ovário (EOC) representam mais de 90% dos tumores, e o subtipo mais comum é o carcinoma seroso de alto grau (HGSC), que responde por aproximadamente 70%-80% dos EOCs. Atualmente, não existem métodos de rastreamento eficazes para detectar a doença precocemente. Assim, a maioria dos pacientes é diagnosticada em estágio avançado (ou seja, estádio III ou IV da Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO]) após o câncer se espalhar por toda a cavidade peritoneal².

O tratamento padrão na linha de frente é a cirurgia citorredutora para remover toda a doença macroscópica visível, seguida de quimioterapia adjuvante à base de platina para destruir qualquer doença microscópica residual. Embora tenha havido muitos avanços no tratamento do câncer de ovário nas últimas duas décadas, aproximadamente 70% das pacientes com doença avançada terão recidiva dentro de 3 anos de^tratamento3. Dado o mau prognóstico geral desses pacientes, os esforços de pesquisa translacional em andamento e futuros no EOC visam identificar biomarcadores para detecção precoce, prevenir metástases, melhorar as terapias atuais para evitar a resistência e desenvolver novos tratamentos personalizados contra o câncer.

Metástases generalizadas dentro da cavidade peritoneal e sua quimiorresistência associada são duas das principais limitações para o aprimoramento do tratamento de pacientes com câncer de^ovário4,5. O omento, uma estrutura semelhante a um avental gorduroso que pende do estômago sobre os intestinos, é o principal sítio de metástase do câncer de ovário ^6,7. Além de sua função como barreira física, o omento demonstrou ter capacidade regenerativa, angiogênica e possuir atividades imunológicas, que juntas promovem vascularização, aceleram a cicatrização de feridas e limitam a infecção⁸. Ele contém uma alta concentração de células-tronco que podem se diferenciar em vários tipos de células e podem ajudar a reparar tecidos danificados. O omento pode inflamar-se em resposta à lesão ou infecção, o que desencadeia a migração das células imunes para o local da^lesão9. Essas células imunes liberam fatores de crescimento e outras moléculas que ajudam a promover o reparo e a regeneração do tecido danificado. As células imunes, como macrófagos, linfócitos e plasmócitos, localizadas no omento, são estruturas conhecidas como "manchas leitosas", responsáveis por detectar e atacar patógenos e regular a imunidade peritoneal. O omento também demonstrou desempenhar um papel na indução de tolerância imunológica¹⁰, que é a capacidade do sistema imunológico de tolerar autoantígenos e não atacar tecidos saudáveis. No entanto, as mesmas atividades imunológicas também estão envolvidas em respostas patológicas, como crescimento de tumores omentais, metástases e escape da vigilância^{imunológica9,11}. Estudos prévios de nosso laboratório e de outros demonstraram um papel único e ativo do microambiente adiposo na inibição da resposta imune antitumoral e na aquisição de quimiorresistência^12,13,14. Infelizmente, temos informações limitadas sobre os mecanismos celulares e moleculares pelos quais o omento fornece um microambiente pró-tumoral.

Para entender melhor as interações entre as células cancerosas e o omento, um sistema de cultura 3D consistindo de células cancerosas de ovário humano e explantes de omento derivados da paciente foi desenvolvido. O protocolo aqui descrito representa um novo modelo ex vivo de carcinomatose peritoneal. Este modelo mimetiza a progressão natural da tumorigênese do câncer de ovário neste tecido adiposo. O modelo proposto é fácil de gerar, barato e potencialmente aplicável a investigações translacionais na pesquisa do câncer de ovário.

Protocolo

O seguinte protocolo de pesquisa foi revisado e aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional (IRB) da Wayne State University. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da cirurgia. A Figura 1 ilustra as três etapas gerais desse protocolo.

1. Preparação do tecido do omento humano

1. Preparar meios de cultura de omento (DMEM/F12 + 10% de soro fetal bovino + 1% de penicilina-estreptomicina) e armazenar a 4 °C. Alíquota 30-40 mL deste meio em um tubo cônico estéril de 50 mL ou recipiente de amostra cirúrgica.
2. Obter espécimes cirúrgicos de biópsia omental ou cirurgia de omentectomia. Imergir o espécime estéril em meio de cultura de omento imediatamente após a remoção na sala de cirurgia. Se o fluxo de trabalho não permitir isso, coloque o espécime em meio de cultura de omento o mais rápido possível. Transferir a amostra colocando-a no gelo e conservar a 4 °C até ao processamento.
   NOTA: O tamanho da amostra de omento removida determinará a quantidade de tecido trabalhável.
3. Processar o espécime de omento dentro de 1-2 h após a coleta usando uma capela de fluxo laminar. Certifique-se de que todos os materiais e ferramentas estejam estéreis ou esterilizados.
4. Retire o omento do recipiente de coleta e transfira-o para uma placa de cultura de 100 mm. Mergulhe a amostra em solução salina tamponada com fosfato 1x (1x PBS) e lave suavemente a amostra para remover quaisquer coágulos sanguíneos ou detritos.
5. Cortar o tecido em pedaços (0,5 cm x 0,5 cm ou 100-200 mg; Figura 2A) usando uma pequena tesoura cirúrgica ou um bisturi de 10-15 mm. Use pinças cirúrgicas pequenas para ajudar a manipular o tecido e evitar esmagar o omento. Se um dispositivo de energia foi usado para remover cirurgicamente o espécime de omento, evite usar o tecido distorcido na borda selada.
6. Colocar cada pedaço de omento cortado em poços individuais de uma placa de cultura de 24 poços e encher os poços com 500 μL de meio de cultura de omento ou até um volume suficiente para cobrir o omento sem permitir que a peça de omento flutue acima do piso do poço (Figura 2B).
7. Conservar pedaços de omento em meios de cultura frescos a 4 °C até estar pronto para a injeção.

2. Preparação de células cancerosas do ovário

1. Cultivar células humanas de câncer de ovário em frasco de 75^cm2 a 37 °C e 5% de CO₂ com pelo menos 75% de confluência até o dia da coleta do omento.
   NOTA: Este protocolo utiliza células de câncer de ovário humano OCSC1-F2 mCherry-positivas previamente descritas^15,16,17,18. Ele pode ser modificado para qualquer linha de células cancerosas marcadas com um sinal de fluorescência.
2. Preparar as células dentro de uma capela de fluxo laminar imediatamente após a coleta do espécime de omento. Certifique-se de que todos os materiais e ferramentas estejam estéreis ou esterilizados.
3. Adicionar 10 mL de PBS estéril 1x ao frasco de cultura e lavar as células balançando suavemente o frasco. Remover o PBS 1x e, em seguida, adicionar 3 mL de tripsina-EDTA a 0,05%.
4. Agitar suavemente o balão de cultura para revestir todas as células e, em seguida, colocar o balão numa incubadora (37 °C e 5% CO₂) durante um período máximo de 5 minutos. Tocar o frasco de cultura para separar completamente as células e, em seguida, neutralizar a tripsina adicionando 3 mL de meio de cultura de omento.
5. Misturar a suspensão celular por pipetagem e, em seguida, transferir a suspensão para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a suspensão por 5 min a 1.200 x g a 24 °C. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 6 mL de meio de cultura de omento fresco.
6. Conte as células usando um hemacitômetro. Diluir a suspensão celular em pelo menos 100.000 células por 100-200 μL de suspensão. Este é o volume de injeção em cada pedaço cortado de omento.
7. Transferir um número adequado de células para um novo frasco de cultura para continuar a passagem celular.

3. Injeção de células cancerosas do ovário

1. Use uma seringa de 1 mL para retirar a suspensão celular e, em seguida, conecte uma agulha de 26 G. Não desenhe a suspensão celular usando a agulha, pois isso pode fragmentar as células.
2. Use pinças cirúrgicas pequenas para pegar um pedaço de omento cortado. Transfira o omento para uma placa estéril de trabalho separada para facilitar a injeção. Perfurar suavemente o omento com a ponta da agulha e injetar um pequeno volume de suspensão celular no tecido (Figura 2C).
3. Repetir a injeção em várias áreas do omento até um volume total de pelo menos 100 μL ou 100.000 células. Observe que grande parte da suspensão celular pode parecer se acumular ao redor do espécime. Se houver preocupação com a qualidade da injeção, repita a injeção ou injete um volume maior de suspensão celular na amostra.
4. Devolva as amostras de omento injetadas em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços. Observe que o volume do meio de cultura de omento é de um nível que cobre o omento sem deixá-lo flutuar. Manuseie cuidadosamente a placa e coloque-a dentro de uma incubadora (37 °C e 5% CO₂).
5. OPCIONAL: Use Matrigel (matriz de membrana basal) para suspender o tecido do omento em uma matriz sólida para permitir uma injeção mais fácil e uma entrega de suspensão celular mais concentrada.
   1. Descongelar a matriz da membrana basal a 4 °C e misturar na proporção de 1:1 com meios de cultura de omento imediatamente antes da utilização. Conservar a mistura da matriz da membrana basal em gelo ou a 4 °C até à injeção. Encha poços vazios com mistura de matriz de membrana basal suficiente para imergir um pedaço cortado de omento.
   2. Coloque os espécimes na mistura da matriz da membrana basal e, em seguida, coloque a placa de cultura de 24 poços em uma incubadora (37 °C e 5% CO₂) por 20 min. Uma vez que a mistura tenha solidificado, continue com a injeção como descrito acima.
6. Confirme a injeção bem-sucedida usando imagens fluorescentes. Certifique-se de que uma faixa de sinal fluorescente seja visualizada nos locais de injeção (Figura 2D). Note que o número real de células ligadas ao omento após a injeção é imprevisível.

4. Co-cultura de células cancerosas do omento humano e do ovário

1. Troque os meios a cada 48-72 h adicionando 500-2000 μL de meios de cultura frescos de omento. Não pipetar o meio diretamente sobre o tecido do omento, pois isso pode deslocar as células cancerosas. Observe que, se a cor da mídia ficar amarela, altere a mídia.
   NOTA: A frequência de mudança de mídia dependerá do volume de mídia usada e da trajetória de crescimento de células cancerosas. Uma vez que as células cancerosas tenham semeado o omento, se o pedaço de omento está ou não flutuando não é mais importante.
2. OPCIONAL: Se uma matriz de membrana basal fosse usada, a matriz normalmente seria dissolvida no momento da primeira troca de meio.
3. Monitorar o crescimento de tumores de câncer de ovário usando imagens fluorescentes. A frequência das imagens fica a critério do investigador. Antecipar a evidência de tumores pequenos em cerca de 14 dias (Figura 3A-C). Os resultados podem variar dependendo da qualidade da injeção.
4. Encerre o experimento com base no ponto de extremidade do experimento.
   NOTA: O crescimento tumoral e a integridade do tecido omento foram observados nos últimos 50 dias.

Resultados

O estabelecimento bem-sucedido de células de câncer de ovário em espécimes de omento foi evidente por volta do 14º dia (Figura 3A-C). Pelo menos 24 repetições foram preparadas e injetadas por espécime coletado para permitir experimentação adicional. O crescimento tumoral foi monitorado por meio de imagens fluorescentes (Figura 3D,E). As imagens tiveram que ser cuidadosamente interpretadas como uma mono...

Discussão

Usando este protocolo, um modelo pré-clínico de carcinomatose peritoneal para câncer de ovário foi desenvolvido usando uma combinação de técnicas básicas in vitro e ex vivo. Um crescimento tumoral progressivo foi observado ao longo de 50 dias de co-cultivo após semeadura de espécimes de omento com células de câncer de ovário humano mCherry+ OCSC1-F2. Este método foi desenvolvido e otimizado em vários ensaios experimentais usando diferentes espécimes de omento. O sucesso do crescimento do...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo