Ein Ex-vivo-Modell der Peritonealmetastasierung von Eierstockkrebs mit humanem Omentum

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines dreidimensionalen (3D) ex vivo Modells der Krebszell-Omentum-Interaktion. Das Modell bietet eine Plattform zur Aufklärung von Pro-Tumor-Mechanismen in der Fettnische und zur Erprobung neuartiger Therapien.

Zusammenfassung

Eierstockkrebs ist die tödlichste gynäkologische Malignität. Das Omentum spielt eine Schlüsselrolle bei der Bereitstellung einer unterstützenden Mikroumgebung für metastasierende Eierstockkrebszellen sowie bei immunmodulatorischen Signalen, die eine Tumortoleranz ermöglichen. Wir haben jedoch nur begrenzte Modelle, die die Interaktion zwischen Eierstockkrebszellen und fettreichem Gewebe genau nachahmen. Um die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die das Omentum eine pro-tumorale Mikroumgebung bietet, besser zu verstehen, haben wir ein einzigartiges 3D-Ex-vivo-Modell der Krebszell-Omentum-Interaktion entwickelt. Mit Hilfe des menschlichen Omentums sind wir in der Lage, Eierstockkrebszellen in dieser fettreichen Mikroumgebung zu züchten und die Faktoren zu überwachen, die für das Tumorwachstum und die Immunregulation verantwortlich sind. Das Modell bietet nicht nur eine Plattform für die Untersuchung dieser fettreichen Tumormikroumgebung, sondern auch eine hervorragende Plattform für die Entwicklung und Bewertung neuartiger therapeutischer Ansätze, um metastasierende Krebszellen in dieser Nische anzugreifen. Das vorgeschlagene Modell ist einfach zu generieren, kostengünstig und auf translationale Untersuchungen anwendbar.

Einleitung

Eierstockkrebs ist die tödlichste gynäkologische Malignität weltweit¹. Das Lebenszeitrisiko, an diesem Krebs zu erkranken, liegt bei etwa 1 zu 70, wobei das mediane Alter bei der Diagnose bei 63 Jahren liegt². Primäre Malignome der Eierstöcke werden histologisch entweder als epithelial oder nicht-epithelial klassifiziert. Epitheliale Ovarialkarzinome (EOC) machen über 90 % der Tumoren aus, und der häufigste Subtyp ist das hochgradige seröse Karzinom (HGSC), das etwa 70 % bis 80 % der EOCs ausmacht. Derzeit gibt es keine wirksamen Screening-Methoden, um Krankheiten frühzeitig zu erkennen. Daher werden die meisten Patienten in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert (d. h. Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] Stadium III oder IV), nachdem sich der Krebs in der Bauchhöhle ausgebreitet hat².

Die Standardbehandlung an vorderster Front ist die zytoreduktive Chirurgie, um alle sichtbaren makroskopischen Erkrankungen zu entfernen, gefolgt von einer adjuvanten Chemotherapie auf Platinbasis, um alle verbleibenden mikroskopischen Erkrankungen zu zerstören. Obwohl es in den letzten zwei Jahrzehnten viele Fortschritte in der Behandlung von Eierstockkrebs gegeben hat, erleiden etwa 70 % der Patientinnen mit fortgeschrittener Erkrankung innerhalb von 3 Jahren nach der Behandlung einen Rückfall³. Angesichts der insgesamt schlechten Prognose dieser Patienten zielen laufende und zukünftige translationale Forschungsbemühungen im EOC darauf ab, Biomarker für die Früherkennung zu identifizieren, Metastasen zu verhindern, aktuelle Therapien zu verbessern, um Resistenzen zu umgehen und neue personalisierte Krebsbehandlungen zu entwickeln.

Generalisierte Metastasen in der Peritonealhöhle und die damit verbundene Chemoresistenz sind zwei der Haupteinschränkungen für die Verbesserung der Behandlung von Patientinnen mit Ovarialkarzinom ^4,5. Das Omentum, eine fettige, schürzenartige Struktur, die vom Magen über den Darm herabhängt, ist ein Hauptort der Metastasierung von Eierstockkrebs ^6,7. Zusätzlich zu seiner Funktion als physikalische Barriere hat das Omentum nachweislich regenerative und angiogene Fähigkeiten und besitzt Immunaktivitäten, die zusammen die Vaskularisierung fördern, die Wundheilung beschleunigen und Infektionen begrenzen⁸. Es enthält eine hohe Konzentration an Stammzellen, die sich in verschiedene Zelltypen differenzieren und bei der Reparatur von beschädigtem Gewebe helfen können. Das Omentum kann sich als Reaktion auf eine Verletzung oder Infektion entzünden, was die Migration von Immunzellen an die Verletzungsstelle auslöst⁹. Diese Immunzellen setzen Wachstumsfaktoren und andere Moleküle frei, die dazu beitragen, die Reparatur und Regeneration von geschädigtem Gewebe zu fördern. Immunzellen wie Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen, die im Omentum lokalisiert sind, sind Strukturen, die als "milchige Flecken" bekannt sind und für die Erkennung und Bekämpfung von Krankheitserregern und die Regulierung der peritonealen Immunität verantwortlich sind. Es wurde auch gezeigt, dass das Omentum eine Rolle bei der Induktion der Immuntoleranz¹⁰ spielt, d. h. der Fähigkeit des Immunsystems, Selbstantigene zu tolerieren und gesundes Gewebe nicht anzugreifen. Dieselben immunbezogenen Aktivitäten sind jedoch auch an pathologischen Reaktionen beteiligt, wie z. B. dem Wachstum von omentalen Tumoren, Metastasen und der Flucht aus der Immunüberwachung ^9,11. Frühere Studien aus unserem Labor und anderen haben eine einzigartige und aktive Rolle der adipösen Mikroumgebung bei der Hemmung antitumoraler Immunantworten und beim Erwerb von Chemoresistenzen gezeigt^12,13,14. Leider haben wir nur begrenzte Informationen über die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die das Omentum eine pro-tumorale Mikroumgebung bietet.

Um die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und dem Omentum besser zu verstehen, wurde ein 3D-Kultursystem entwickelt, das aus humanen Ovarialkarzinomzellen und patienteneigenen Omentum-Explantaten besteht. Das hier beschriebene Protokoll stellt ein neuartiges ex vivo Modell der Peritonealkarzinose dar. Dieses Modell ahmt den natürlichen Verlauf der Tumorgenese von Eierstockkrebs in diesem fettreichen Gewebe nach. Das vorgeschlagene Modell ist einfach zu generieren, kostengünstig und potenziell auf translationale Untersuchungen in der Eierstockkrebsforschung anwendbar.

Protokoll

Das folgende Forschungsprotokoll wurde vom Wayne State University Institutional Review Board (IRB) geprüft und genehmigt. Vor der Operation wurde von allen Patienten eine Einverständniserklärung eingeholt. Abbildung 1 veranschaulicht die drei allgemeinen Schritte in diesem Protokoll.

1. Präparation von menschlichem Omentumgewebe

1. Omentum-Nährmedien (DMEM/F12 + 10 % fötales Kälberserum + 1 % Penicillin-Streptomycin) vorbereiten und bei 4 °C lagern. Aliquotieren Sie 30-40 ml dieses Mediums in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen oder einen chirurgischen Probenbehälter.
2. Erhalten Sie chirurgische Proben aus einer omentalen Biopsie oder einer Omentektomie. Tauchen Sie die sterile Probe unmittelbar nach der Entnahme im Operationssaal in Omentum-Nährmedien ein. Wenn der Arbeitsablauf dies nicht zulässt, legen Sie die Probe so schnell wie möglich in Omentum-Nährmedien. Die Probe wird auf Eis gelegt und bis zur Verarbeitung bei 4 °C gelagert.
   HINWEIS: Die Größe der entfernten Omentumprobe bestimmt die Menge des bearbeitbaren Gewebes.
3. Verarbeiten Sie die Omentumprobe innerhalb von 1-2 Stunden nach der Entnahme mit einer Laminar-Flow-Haube. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien und Werkzeuge steril oder sterilisiert sind.
4. Nehmen Sie das Omentum aus dem Auffangbehälter und füllen Sie es in eine 100-mm-Kulturschale um. Tauchen Sie die Probe in 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) und waschen Sie die Probe vorsichtig, um Blutgerinnsel oder Ablagerungen zu entfernen.
5. Schneiden Sie das Gewebe in Stücke (0,5 cm x 0,5 cm oder 100-200 mg; Abbildung 2A) entweder mit einer kleinen chirurgischen Schere oder einem 10-15 mm Skalpell. Verwenden Sie eine kleine chirurgische Pinzette, um das Gewebe zu manipulieren und eine Quetschung des Omentums zu vermeiden. Wenn ein Energiegerät verwendet wurde, um die Omentum-Probe chirurgisch zu entfernen, vermeiden Sie es, das verzerrte Gewebe an der versiegelten Kante zu verwenden.
6. Geben Sie jedes Stück geschnittenes Omentum in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte und füllen Sie die Vertiefungen mit 500 μl Omentum-Nährmedien oder mit einem Volumen, das ausreicht, um das Omentum zu bedecken, ohne dass das Omentumstück über dem Well-Boden schwebt (Abbildung 2B).
7. Omentumstücke in frischem Nährmedium bei 4 °C lagern, bis sie zur Injektion bereit sind.

2. Präparation von Eierstockkrebszellen

1. Menschliche Eierstockkrebszellen werden in einem 75 cm2 Kulturkolben bei 37 °C und 5 %^CO2 bis zum Tag der Omentumentnahme auf eine Konfluenz von mindestens 75 % kultiviert.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet mCherry-positive OCSC1-F2-menschliche Eierstockkrebszellen, die zuvor beschrieben^{wurden 15,16,17,18}. Es kann zu jeder Krebszelllinie modifiziert werden, die mit einem Fluoreszenzsignal markiert ist.
2. Bereiten Sie die Zellen in einer Laminar-Flow-Haube unmittelbar nach der Entnahme der Omentumprobe vor. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien und Werkzeuge steril oder sterilisiert sind.
3. Geben Sie 10 ml steriles 1x PBS in den Kulturkolben und waschen Sie die Zellen, indem Sie den Kolben vorsichtig schaukeln. Entfernen Sie das 1x PBS und fügen Sie dann 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzu.
4. Der Kulturkolben wird vorsichtig geschaukelt, um alle Zellen zu bedecken, und dann wird der Kolben nicht länger als 5 Minuten in einen Inkubator (37 °C und 5 % CO₂) gestellt. Klopfen Sie auf den Kulturkolben, um die Zellen vollständig zu lösen, und neutralisieren Sie dann Trypsin, indem Sie 3 ml Omentum-Nährmedium hinzufügen.
5. Mischen Sie die Zellsuspension durch Pipettieren und überführen Sie die Suspension dann in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Die Suspension wird 5 min bei 1.200 x g bei 24 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 6 ml frischem Omentum-Kulturmedium.
6. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf mindestens 100.000 Zellen pro 100-200 μl Suspension. Dies ist das Volumen der Injektion in jedes geschnittene Omentumstück.
7. Eine angemessene Anzahl von Zellen wird in einen neuen Kulturkolben überführt, um die Zellpassage fortzusetzen.

3. Injektion von Eierstockkrebszellen

1. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um die Zellsuspension aufzuziehen, und bringen Sie dann eine 26-G-Nadel an. Ziehen Sie die Zellsuspension nicht mit der Nadel auf, da dies die Zellen fragmentieren kann.
2. Verwende eine kleine chirurgische Pinzette, um ein Stück geschnittenes Omentum aufzunehmen. Geben Sie das Omentum in eine separate, sterile Schale, um die Injektion zu erleichtern. Stechen Sie vorsichtig mit der Nadelspitze in das Omentum und injizieren Sie ein kleines Volumen der Zellsuspension in das Gewebe (Abbildung 2C).
3. Wiederholen Sie die Injektion über mehrere Bereiche des Omentums bis zu einem Gesamtvolumen von mindestens 100 μl oder 100.000 Zellen. Beachten Sie, dass sich ein Großteil der Zellsuspension um die Probe herum zu sammeln scheint. Wenn Bedenken hinsichtlich der Qualität der Injektion bestehen, wiederholen Sie die Injektion oder injizieren Sie ein größeres Volumen der Zellsuspension in die Probe.
4. Die injizierten Omentumproben werden in jede Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte zurückgeführt. Beachten Sie, dass das Volumen der Omentum-Nährmedien ein Niveau erreicht, das das Omentum bedeckt, ohne dass es schwimmt. Behandeln Sie die Platte vorsichtig und legen Sie sie in einen Inkubator (37 °C und 5% CO₂).
5. OPTIONAL: Verwenden Sie Matrigel (Basalmembranmatrix), um Omentumgewebe in einer festen Matrix zu suspendieren, um eine einfachere Injektion und eine konzentriertere Verabreichung der Zellsuspension zu ermöglichen.
   1. Die Basalmembranmatrix wird bei 4 °C aufgetaut und unmittelbar vor Gebrauch im Verhältnis 1:1 mit Omentum-Nährmedien vermischt. Lagern Sie die Basalmembran-Matrixmischung bis zur Injektion auf Eis oder bei 4 °C. Füllen Sie leere Vertiefungen mit genügend Basalmembran-Matrix-Mischung, um ein abgeschnittenes Stück Omentum einzutauchen.
   2. Die Proben werden in die Basalmembran-Matrixmischung gegeben und dann die 24-Well-Kulturplatte für 20 Minuten in einen Inkubator (37 °C und 5 % CO₂) gelegt. Sobald das Gemisch erstarrt ist, fahren Sie mit der Injektion wie oben beschrieben fort.
6. Bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion mit Hilfe der Fluoreszenzbildgebung. Stellen Sie sicher, dass ein Streifen des Fluoreszenzsignals an den Injektionsstellen sichtbar ist (Abbildung 2D). Beachten Sie, dass die tatsächliche Anzahl der Zellen, die nach der Injektion an das Omentum gebunden sind, unvorhersehbar ist.

4. Co-Kultur von humanen Omentum- und Eierstockkrebszellen

1. Wechseln Sie das Medium alle 48-72 Stunden, indem Sie 500-2000 μl frisches Omentum-Nährmedium hinzufügen. Pieptieren Sie Medien nicht direkt auf das Omentumgewebe, da dies Krebszellen verdrängen kann. Beachten Sie, dass Sie die Medien ändern müssen, wenn die Medienfarbe gelb wird.
   HINWEIS: Die Häufigkeit des Medienwechsels hängt von der Menge der verwendeten Medien und dem Verlauf des Krebszellwachstums ab. Sobald die Krebszellen das Omentum ausgesät haben, ist es nicht mehr wichtig, ob das Omentumstück schwimmt oder nicht.
2. OPTIONAL: Wenn eine Basalmembranmatrix verwendet wurde, war die Matrix in der Regel zum Zeitpunkt des ersten Medienwechsels aufgelöst.
3. Überwachen Sie das Wachstum von Eierstockkrebstumoren mit Hilfe der Fluoreszenzbildgebung. Die Häufigkeit der Bildgebung liegt im Ermessen des Prüfarztes. Rechnen Sie mit dem Nachweis kleiner Tumore nach etwa 14 Tagen (Abbildung 3A-C). Die Ergebnisse können je nach Qualität der Injektion variieren.
4. Beenden Sie das Experiment basierend auf dem Endpunkt des Experiments.
   HINWEIS: Das Tumorwachstum und die Integrität des Omentumgewebes wurden in den letzten 50 Tagen beobachtet.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Etablierung von Ovarialkarzinomzellen in Omentumproben war etwa am 14. Tag offensichtlich (Abbildung 3A-C). Mindestens 24 Replikate wurden präpariert und pro entnommener Probe injiziert, um weitere Experimente zu ermöglichen. Das Tumorwachstum wurde durch Fluoreszenzaufnahmen überwacht (Abbildung 3D,E). Die Bilder mussten vorsichtig interpretiert werden, da eine Monoschicht von Krebszellen au...

Diskussion

Unter Verwendung dieses Protokolls wurde ein präklinisches Modell der Peritonealkarzinose bei Ovarialkarzinom entwickelt, das eine Kombination aus grundlegenden In-vitro- und Ex-vivo-Techniken verwendet. Ein progressives Tumorwachstum wurde über 50 Tage in Kokultur beobachtet, nachdem Omentumproben mit mCherry+ OCSC1-F2 humanen Ovarialkarzinomzellen ausgesät wurden. Diese Methode wurde in mehreren experimentellen Versuchen mit verschiedenen Omentumproben entwickelt und optimiert. Ein erfolgreiches Tu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo