인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

요약

이 프로토콜은 암세포-omentum 상호 작용의 3차원(3D) 생체 외 모델의 확립을 설명합니다. 이 모델은 지방 틈새 시장 내에서 종양 유발 기전을 규명하고 새로운 치료법을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

초록

난소암은 가장 치명적인 부인과 악성 종양입니다. 오멘텀은 전이성 난소암 세포에 지지적인 미세환경을 제공할 뿐만 아니라 종양 내성을 허용하는 면역 조절 신호를 제공하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 난소암 세포와 지방이 풍부한 조직 간의 상호 작용을 밀접하게 모방하는 모델은 제한적입니다. 오멘텀이 전종양 미세환경을 제공하는 세포 및 분자 메커니즘을 더 깊이 이해하기 위해, 우리는 암세포-오멘텀 상호작용에 대한 독특한 3D 생체 외 모델을 개발했습니다. 인간 오멘텀을 사용하여 지방이 풍부한 미세환경 내에서 난소암 세포를 성장시키고 종양 성장과 면역 조절을 담당하는 요인을 모니터링할 수 있습니다. 이 모델은 지방이 풍부한 종양 미세환경 연구를 위한 플랫폼을 제공할 뿐만 아니라 이 틈새 시장에서 전이성 암세포를 표적으로 하는 새로운 치료 접근법의 개발 및 평가를 위한 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 제안된 모델은 생성하기 쉽고, 저렴하며, 중개 조사에 적용할 수 있습니다.

서문

난소암은 전 세계적으로 가장 치명적인 부인과 악성 종양입니다¹. 이 암에 걸릴 위험은 평생 70명 중 1명이며, 평균 진단 연령은 63세입니다². 원발성 난소 악성 종양은 조직학적으로 상피성 또는 비상피성으로 분류됩니다. 상피난소암(EOC)은 종양의 90% 이상을 차지하며, 가장 흔한 아형은 EOC의 약 70%-80%를 차지하는 고등급 장액암(HGSC)입니다. 현재로서는 질병을 조기에 발견할 수 있는 효과적인 선별 방법이 없습니다. 따라서 대부분의 환자는 암이 복막강 전체로 퍼진 후 진행된 단계(즉, Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] stage III 또는 IV)에서 진단된다².

표준 일선 치료는 눈에 보이는 모든 거시적 질병을 제거하는 세포 축소 수술과 잔여 현미경 질환을 파괴하기 위한 보조 백금 기반 화학 요법입니다. 지난 20년 동안 난소암 치료에는 많은 발전이 있었지만, 진행성 난소암 환자의 약 70%는 치료 후 3년 이내에 재발한다³. 이러한 환자들의 전반적인 예후가 좋지 않다는 점을 감안할 때, EOC의 현재 및 향후 중개 연구 노력은 조기 발견을 위한 바이오마커를 식별하고, 전이를 방지하고, 내성을 회피하기 위한 현재 치료법을 개선하고, 새로운 맞춤형 암 치료법을 개발하는 것을 목표로 합니다.

복막강 내 전신 전이 및 관련 화학 저항성은 난소암 환자의 치료 개선을 위한 두 가지 주요 한계입니다 ^4,5. 오멘텀(omentum)은 위에서 장 위로 늘어져 있는 지방이 많은 앞치마와 같은 구조로, 난소암 전이의 주요 부위이다 ^6,7. 물리적 장벽으로서의 기능 외에도 오멘텀은 재생 및 혈관 생성 능력을 가지고 있으며 면역 활동을 가지고 있어 혈관 형성을 촉진하고 상처 치유를 촉진하며 감염을 제한하는 것으로 나타났습니다⁸. 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있고 손상된 조직을 복구하는 데 도움이 될 수 있는 고농도의 줄기세포를 함유하고 있습니다. 염증은 부상이나 감염에 대한 반응으로 염증이 생길 수 있으며, 이는 면역 세포가 부상 부위로 이동하도록 유도한다⁹. 이 면역 세포는 손상된 조직의 복구와 재생을 촉진하는 데 도움이 되는 성장 인자와 기타 분자를 방출합니다. 대식세포, 림프구, 형질세포와 같은 면역세포는 병원체를 탐지 및 공격하고 복막 면역을 조절하는 역할을 하는 "유백색 반점"으로 알려진 구조입니다. 오멘텀은 또한 면역 관용을 유도하는 역할을 하는 것으로 나타났는데,¹⁰ 이는 면역 체계가 자가 항원을 견디고 건강한 조직을 공격하지 않는 능력입니다. 그러나 동일한 면역 관련 활동이 종양의 성장, 전이 및 면역 감시의 탈출과 같은 병리학적 반응에도 관여한다 ^9,11. 우리 연구실과 다른 연구자들의 이전 연구에서는 항종양 면역 반응 억제 및 화학 내성 획득에서 지방 미세환경의 독특하고 적극적인 역할을 입증했습니다^12,13,14. 불행히도, 우리는 omentum이 전종양 미세환경을 제공하는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 제한된 정보를 가지고 있습니다.

암세포와 난소암 사이의 상호작용을 더 잘 이해하기 위해 인간 난소암 세포와 환자 유래 난소암 외출로 구성된 3D 배양 시스템이 개발되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 복막암종의 새로운 생체 외 모델을 나타냅니다. 이 모델은 지방이 풍부한 조직에서 난소암 종양형성의 자연스러운 진행을 모방합니다. 제안된 모델은 생성하기 쉽고, 저렴하며, 난소암 연구의 중개 조사에 잠재적으로 적용할 수 있습니다.

프로토콜

다음 연구 프로토콜은 Wayne State University Institutional Review Board(IRB)에서 검토 및 승인되었습니다. 수술 전에 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 받았습니다. 그림 1 은 이 프로토콜의 세 가지 일반적인 단계를 보여줍니다.

1. 인간 omentum 조직의 준비

1. 오멘텀 배양 배지(DMEM/F12 + 소 태아 혈청 10% + 페니실린-스트렙토마이신 1%)를 준비하고 4°C에서 보관합니다. 이 배지 30-40mL를 멸균 50mL 코니컬 튜브 또는 수술용 표본 용기에 분취합니다.
2. omental 생검 또는 omentectomy 수술에서 수술 표본을 얻습니다. 멸균 검체를 수술실에서 제거한 직후 omentum 배양 배지에 담그십시오. 워크플로우에서 이를 허용하지 않는 경우 가능한 한 빨리 검체를 omentum 배양 배지에 넣으십시오. 샘플을 얼음 위에 올려 옮기고 처리할 때까지 4°C에서 보관합니다.
   알림: 제거된 오멘텀 표본의 크기에 따라 작업 가능한 조직의 양이 결정됩니다.
3. 층류 후드를 사용하여 채취 후 1-2시간 이내에 omentum 표본을 처리합니다. 모든 재료와 도구가 멸균 또는 멸균되었는지 확인하십시오.
4. 수집 용기에서 오멘텀을 꺼내 100mm 배양 접시에 옮깁니다. 검체를 1x 인산염 완충 식염수(1x PBS)에 담그고 검체를 부드럽게 세척하여 혈전이나 부스러기를 제거합니다.
5. 조직을 조각으로 자릅니다 (0.5cm x 0.5cm 또는 100-200mg; 그림 2A) 작은 수술용 가위 또는 10-15mm 메스를 사용합니다. 작은 수술용 집게를 사용하여 조직을 조작하고 오멘텀이 부서지는 것을 방지하십시오. 에너지 장치를 사용하여 오멘텀 검체를 외과적으로 제거한 경우 밀봉된 가장자리에서 왜곡된 조직을 사용하지 마십시오.
6. 절단된 오멘텀의 각 조각을 24웰 배양 플레이트의 개별 웰에 넣고 500μL의 오멘텀 배양 배지 또는 오멘텀 조각이 웰 바닥 위에 떠 있지 않고 오멘텀을 덮을 수 있는 부피로 웰을 채웁니다(그림 2B).
7. 주입할 준비가 될 때까지 4°C의 신선한 배양 배지에 오멘텀 조각을 보관합니다.

2. 난소암 세포의 제조

1. 인간 난소암 세포를 37°C에서 75cm2 배양 플라스크에 배양하고 5%^CO2 내지 75% 농도에서 omentum 채취일까지 최소 75% 밀도를 배양합니다.
   참고: 이 프로토콜은 이전에^{기술한 mCherry} 양성 OCSC1-F2 인간 난소암 세포를 사용합니다 15,16,17,18. 형광 신호로 태그된 모든 암 세포주에 변형될 수 있습니다.
2. omentum 표본을 채취한 직후 층류 후드 내부에 세포를 준비합니다. 모든 재료와 도구가 멸균 또는 멸균되었는지 확인하십시오.
3. 멸균 1x PBS 10mL를 배양 플라스크에 넣고 플라스크를 부드럽게 흔들어 세포를 세척합니다. 1x PBS를 제거한 다음 0.05% 트립신-EDTA 3mL를 추가합니다.
4. 배양 플라스크를 부드럽게 흔들어 모든 세포를 코팅한 다음 플라스크를 인큐베이터(37°C 및 5% CO₂)에 5분 이상 두지 않습니다. 배양 플라스크를 두드려 세포를 완전히 분리한 다음 3mL의 오멘텀 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.
5. 피펫팅으로 세포 현탁액을 혼합한 다음 현탁액을 15mL 코니컬 튜브에 옮깁니다. 24°C에서 1,200 x g 에서 5분 동안 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 6mL의 신선한 오멘텀 배양 배지에 재현탁시킵니다.
6. 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 현탁액을 100-200 μL 당 최소 100,000 세포로 희석합니다. 이것은 오멘텀의 각 절단 조각에 주입되는 양입니다.
7. 적절한 수의 세포를 새로운 배양 플라스크에 옮겨 세포 통과를 계속합니다.

3. 난소암 세포 주입

1. 1mL 주사기를 사용하여 세포 현탁액을 끌어올린 다음 26G 바늘을 부착합니다. 세포가 파편화될 수 있으므로 바늘을 사용하여 세포 현탁액을 그리지 마십시오.
2. 작은 수술용 집게를 사용하여 잘린 오멘텀 조각을 집습니다. 주입을 용이하게 하기 위해 omentum을 별도의 작동 멸균 접시로 옮깁니다. 바늘 끝으로 오멘텀을 부드럽게 뚫고 소량의 세포 현탁액을 조직에 주입합니다(그림 2C).
3. 최소 100μL 또는 100,000개의 세포가 있는 총 부피까지 여러 영역에 걸쳐 주입을 반복합니다. 세포 현탁액의 대부분이 표본 주위에 고이는 것처럼 보일 수 있습니다. 주입 품질에 대한 우려가 있는 경우 주입을 반복하거나 더 많은 양의 세포 현탁액을 검체에 주입합니다.
4. 주입된 오멘텀 샘플을 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 되돌립니다. 오멘텀 배양 배지의 양은 오멘텀이 뜨지 않고 덮을 수 있는 수준입니다. 플레이트를 조심스럽게 다루고 인큐베이터(37°C 및 5% CO₂) 안에 넣습니다.
5. 선택 사항: Matrigel(기저막 매트릭스)을 사용하여 omentum 조직을 고체 매트릭스에 현탁시켜 더 쉽게 주입하고 더 농축된 세포 현탁액을 전달할 수 있습니다.
   1. 기저막 매트릭스를 4°C에서 해동하고 사용 직전에 오멘텀 배양 배지와 1:1 비율로 혼합합니다. 기저막 매트릭스 혼합물을 얼음 위 또는 주입할 때까지 4°C에서 보관하십시오. 빈 우물을 자른 오멘텀 조각을 담글 수 있을 만큼 충분한 기저막 매트릭스 혼합물로 채웁니다.
   2. 시료를 기저막 매트릭스 혼합물에 넣은 다음 24웰 배양 플레이트를 인큐베이터(37°C 및 5%_CO2)에 20분 동안 놓습니다. 혼합물이 응고되면 위에서 설명한 대로 주입을 계속합니다.
6. 형광 이미징을 사용하여 성공적인 주입을 확인합니다. 주입 부위에서 형광 신호의 줄무늬가 시각화되는지 확인합니다(그림 2D). 주입 후 omentum에 부착 된 실제 세포 수는 예측할 수 없습니다.

4. 인간 오멘텀과 난소암 세포의 공동 배양

1. 500-2000 μL의 신선한 오멘텀 배양 배지를 추가하여 48-72시간마다 배지를 교체합니다. 암세포를 대체할 수 있으므로 배지를 오멘텀 조직 위에 직접 피펫으로 바르지 마십시오. 미디어 색상이 노란색으로 바뀌면 미디어를 변경하십시오.
   참고: 배지 교체 빈도는 사용된 배지의 양과 암세포 성장 궤적에 따라 달라집니다. 일단 암세포가 오멘텀에 씨를 뿌리고 나면, 오멘텀 조각이 떠 있는지 여부는 더 이상 중요하지 않습니다.
2. 선택 사항: 기저막 매트릭스가 사용된 경우 매트릭스는 일반적으로 첫 번째 매체 교체 시 용해됩니다.
3. 형광 영상을 사용하여 난소암 종양의 성장을 모니터링합니다. 이미징 빈도는 조사자의 재량에 달려 있습니다. 약 14일 이내에 작은 종양의 증거를 예상합니다(그림 3A-C). 결과는 주사의 품질에 따라 달라질 수 있습니다.
4. 실험 엔드포인트에 따라 실험을 종료합니다.
   참고: 종양 성장과 오멘텀 조직의 무결성은 지난 50일 동안 관찰되었습니다.

결과

난소암 세포를 오멘텀 표본에 성공적으로 확립하는 것은 약 14일째에 분명했습니다(그림 3A-C). 추가 실험을 위해 수집된 표본당 최소 24개의 복제물을 준비하고 주입했습니다. 종양 성장은 형광 이미지를 촬영하여 모니터링했습니다(그림 3D,E). 이미지는 오멘텀에 부착되지 않은 각 우물의 바닥에서도 암세포의 단층...

토론

이 프로토콜을 사용하여 난소암에 대한 복막암의 전임상 모델은 기본적인 in vitro 및 ex vivo 기술의 조합을 사용하여 개발되었습니다. mCherry+ OCSC1-F2 인간 난소암 세포로 오멘텀 검체를 파종한 후 50일간의 공동 배양에서 점진적인 종양 성장이 관찰되었습니다. 이 방법은 다양한 오멘텀 표본을 사용한 여러 실험 시험에서 개발 및 최적화되었습니다. 성공적인 종양 성장은 오멘텀의 질, ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo