基于人网膜的卵巢癌腹膜转移离 体 模型

摘要

该协议描述了癌细胞 - 网膜相互作用的三维（3D） 离体 模型的建立。该模型为阐明脂肪生态位内的促肿瘤机制和测试新疗法提供了一个平台。

摘要

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤。网膜在为转移性卵巢癌细胞提供支持性微环境以及允许肿瘤耐受的免疫调节信号方面发挥着关键作用。 然而，我们只有有限的模型来密切模拟卵巢癌细胞和富含脂肪的组织之间的相互作用。为了进一步了解网膜提供促肿瘤微环境的细胞和分子机制，我们开发了一种独特的癌细胞-网膜相互作用的 3D 离体 模型。使用人类网膜，我们能够在这种富含脂肪的微环境中培养卵巢癌细胞，并监测负责肿瘤生长和免疫调节的因素。除了为研究这种富含脂肪的肿瘤微环境提供平台外，该模型还为开发和评估靶向该利基转移性癌细胞的新治疗方法提供了极好的平台。该模型易于生成，成本低廉，适用于转化研究。

引言

卵巢癌是全球最致命的妇科恶性肿瘤¹.罹患这种癌症的终生风险约为 1/70，中位诊断年龄为 63 岁²。原发性卵巢恶性肿瘤在组织学上分为上皮性和非上皮性。上皮性卵巢癌 （EOC） 占肿瘤的 90% 以上，最常见的亚型是高级别浆液性癌 （HGSC），约占 EOC 的 70%-80%。目前，尚无有效的筛查方法及早发现疾病。因此，大多数患者在癌症扩散到整个腹膜腔后被诊断为晚期（即国际妇科和妇产科联合会 [FIGO] III 期或 IV^期）2。

标准的一线治疗是细胞减灭术，以去除所有可见的肉眼病变，然后进行辅助铂类化疗以消除任何残留的微观病变。虽然在过去二十年中卵巢癌治疗取得了许多进展，但大约 70% 的晚期疾病患者会在治疗后 3 年内复发³.鉴于这些患者的总体预后较差，EOC正在进行和未来的转化研究工作旨在确定早期检测的生物标志物，预防转移，改进目前的疗法以逃避耐药性，并开发新的个性化癌症治疗方法。

腹膜腔内的全身转移及其相关的化疗耐药性是改善卵巢癌患者治疗的两个主要限制因素^4,5。网膜是一种脂肪围裙状结构，从胃垂下到肠道上....

研究方案

以下研究方案已由韦恩州立大学机构审查委员会 （IRB） 审查和批准。手术前已获得所有患者的知情同意。 图1 说明了该协议中的三个一般步骤。

1.人网膜组织的制备

1. 准备网膜培养基（DMEM / F12 + 10%胎牛血清+ 1%青霉素 - 链霉素）并储存在4°C。 将 30-40 mL 该培养基分装到无菌的 50 mL 锥形管或手术标本容器中。
2. 通过网膜活检或网膜切除术获取手术标本。在手术室中取出后，立即将无菌标本浸入网膜培养基中。如果工作流程不允许这样做，请尽快将标本放入网膜培养基中。通过将样品放在冰上转移样品并储存在4°C直至处理。
   注意：切除的网膜标本的大小将决定可工作组织的数量。
3. 使用层流罩在收集后1-2小时内处理网膜标本。确保所有材料和工具都是无菌或无菌的。
4. 从收集容器中取出网膜并将其转移到 100 毫米培养皿中。将标本浸入1x磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）中，轻轻洗涤标本以除去任何血凝块或碎屑。
5. 将组织切成碎片（0.5 cm x 0.5 cm或100-200 mg; 图2A）使用小手术剪刀或 10-15 毫米手术刀。使用小手术钳帮助操纵组织并避免压碎网膜。如果使用能量装置通过手术切除网膜标本，则避免使用密封边缘....

讨论

使用该方案，结合基本的体外和离体技术开发了卵巢癌腹膜癌的临床前模型。在用 mCherry+ OCSC1-F2 人卵巢癌细胞接种网膜标本后，在 50 天的共培养中观察到进行性肿瘤生长。该方法是在使用不同网膜标本的几次实验试验中开发和优化的。肿瘤的成功生长取决于网膜的质量、癌细胞的活力和注射的有效性。在本报告中，我们仅使用了 mCherry+ OCSC1-F2 细胞和 mCherry+ R182 人卵巢癌细胞系，这?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo