İnsan Omentumu Kullanılarak Over Kanseri Periton Metastazının Ex Vivo Modeli

Özet

Bu protokol, kanser hücresi-omentum etkileşiminin üç boyutlu (3D) ex vivo modelinin kurulmasını açıklar. Model, yağ nişi içindeki pro-tümör mekanizmalarını aydınlatmak ve yeni tedavileri test etmek için bir platform sağlar.

Özet

Over kanseri en ölümcül jinekolojik malignitedir. Omentum, metastatik yumurtalık kanseri hücrelerine destekleyici bir mikro çevrenin yanı sıra tümör toleransına izin veren immün modülatör sinyallerin sağlanmasında önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, yumurtalık kanseri hücreleri ile yağdan zengin dokular arasındaki etkileşimi yakından taklit eden sınırlı modellerimiz var. Omentumun pro-tümöral bir mikroçevre sağladığı hücresel ve moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için, kanser hücresi-omentum etkileşiminin benzersiz bir 3D ex vivo modelini geliştirdik. İnsan omentumunu kullanarak, bu yağ açısından zengin mikro çevre içinde yumurtalık kanseri hücrelerini büyütebilir ve tümör büyümesi ve bağışıklık regülasyonundan sorumlu faktörleri izleyebiliriz. Model, bu adipoz açısından zengin tümör mikroçevresinin incelenmesi için bir platform sağlamanın yanı sıra, bu niş içindeki metastatik kanser hücrelerini hedeflemek için yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi ve değerlendirilmesi için mükemmel bir platform sağlar. Önerilen modelin üretilmesi kolaydır, ucuzdur ve translasyonel araştırmalara uygulanabilir.

Giriş

Over kanseri dünya çapında en ölümcül jinekolojik malignitedir¹. Bu kansere yakalanma riski yaklaşık 70'de 1'dir ve ortalama tanı yaşı 63'tür². Primer over maligniteleri histolojik olarak epitelyal ve epitelyal olmayan olarak sınıflandırılır. Epitelyal over kanserleri (EOC) tümörlerin %90'ından fazlasını oluşturur ve en sık görülen alt tip, EOC'lerin yaklaşık %70-80'ini oluşturan yüksek dereceli seröz karsinomdur (HGSC). Şu anda, hastalığı erken teşhis etmek için etkili bir tarama yöntemi yoktur. Bu nedenle çoğu hasta, kanser periton boşluğuna yayıldıktan sonra ileri bir aşamada (yani, Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] evre III veya IV) teşhis edilir².

Standart ön cephe tedavisi, tüm görünür makroskopik hastalıkları ortadan kaldırmak için sitoredüktif cerrahi ve ardından herhangi bir kalıntı mikroskobik hastalığı yok etmek için adjuvan platin bazlı kemoterapidir. Son yirmi yılda yumurtalık kanseri tedavisinde birçok ilerleme olmasına rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların yaklaşık %70'i tedaviden sonraki 3 yıl içinde nüksedecektir³. Bu hastaların genel olarak kötü prognozu göz önüne alındığında, EOC'de devam eden ve gelecekteki translasyonel araştırma çabaları, erken teşhis için biyobelirteçleri tanımlamayı, metastazı önlemeyi, dirençten kaçınmak için mevcut tedavileri iyileştirmeyi ve yeni kişiselleştirilmiş kanser tedavileri geliştirmeyi amaçlamaktadır.

Periton boşluğu içindeki jeneralize metastaz ve buna bağlı kemorezistans, yumurtalık kanserli hastaların tedavisinin iyileştirilmesi için en önemli sınırlamalardan ikisidir ^4,5. Mideden bağırsakların üzerine sarkan yağlı önlük benzeri bir yapı olan omentum, yumurtalık kanseri metastazının ana bölgesidir ^6,7. Fiziksel bir bariyer olarak işlevine ek olarak, omentumun rejeneratif ve anjiyojenik kapasitelere sahip olduğu ve birlikte vaskülarizasyonu destekleyen, yara iyileşmesini hızlandıran ve enfeksiyonu sınırlayan bağışıklık aktivitelerine sahip olduğu gösterilmiştir⁸. Çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilen ve hasarlı dokuların onarılmasına yardımcı olabilen yüksek konsantrasyonda kök hücre içerir. Omentum, yaralanma veya enfeksiyona yanıt olarak iltihaplanabilir, bu da bağışıklık hücrelerinin yaralanma bölgesine^göçünü tetikler 9. Bu bağışıklık hücreleri, hasarlı dokunun onarımını ve yenilenmesini desteklemeye yardımcı olan büyüme faktörlerini ve diğer molekülleri serbest bırakır. Omentumda lokalize olan makrofajlar, lenfositler ve plazma hücreleri gibi bağışıklık hücreleri, patojenleri tespit etmekten ve bunlara saldırmaktan ve periton bağışıklığını düzenlemekten sorumlu olan "sütlü lekeler" olarak bilinen yapılardır. Omentumun ayrıca, bağışıklık sisteminin kendi antijenlerini tolere etme ve sağlıklı dokulara saldırmama yeteneği olan bağışıklık toleransını¹⁰ indüklemede rol oynadığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, aynı bağışıklıkla ilgili aktiviteler, omental tümörlerin büyümesi, metastaz ve bağışıklık sürveyansından kaçış gibi patolojik yanıtlarda da rol oynar ^9,11. Laboratuvarımızdan ve diğerlerinden yapılan önceki çalışmalar, anti-tümöral immün yanıtların inhibisyonunda ve kemodirenç^12,13,14 kazanılmasında adipoz mikroçevrenin benzersiz ve aktif bir rolünü göstermiştir. Ne yazık ki, omentumun pro-tümöral bir mikroçevre sağladığı hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında sınırlı bilgiye sahibiz.

Kanser hücreleri ve omentum arasındaki etkileşimleri daha iyi anlamak için, insan yumurtalık kanseri hücreleri ve hasta kaynaklı omentum eksplantlarından oluşan bir 3D kültür sistemi geliştirilmiştir. Burada tarif edilen protokol, peritoneal karsinomatozisin yeni bir ex vivo modelini temsil etmektedir. Bu model, bu yağ açısından zengin dokuda yumurtalık kanseri tümör oluşumunun doğal ilerlemesini taklit eder. Önerilen modelin üretilmesi kolaydır, ucuzdur ve yumurtalık kanseri araştırmalarında translasyonel araştırmalara potansiyel olarak uygulanabilir.

Protokol

Aşağıdaki araştırma protokolü, Wayne State Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Ameliyat öncesi tüm hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Şekil 1 , bu protokoldeki üç genel adımı göstermektedir.

1. İnsan omentum dokusunun hazırlanması

1. Omentum kültür ortamını hazırlayın (DMEM/F12 + %10 fetal sığır serumu + %1 penisilin-streptomisin) ve 4 °C'de saklayın. Bu ortamın 30-40 mL'sini steril bir 50 mL konik tüpe veya cerrahi numune kabına alın.
2. Omental biyopsi veya omentektomi ameliyatından cerrahi örnekler alın. Steril numuneyi ameliyathanede çıkarıldıktan hemen sonra omentum kültür ortamına daldırın. İş akışı buna izin vermiyorsa, numuneyi mümkün olan en kısa sürede omentum kültür ortamına yerleştirin. Numuneyi buz üzerine koyarak aktarın ve işlenene kadar 4 °C'de saklayın.
   NOT: Çıkarılan omentum örneğinin boyutu, işlenebilir doku miktarını belirleyecektir.
3. Omentum örneğini bir laminer akış başlığı kullanarak toplandıktan sonraki 1-2 saat içinde işleyin. Tüm malzemelerin ve aletlerin steril veya sterilize edildiğinden emin olun.
4. Omentumu toplama kabından çıkarın ve 100 mm'lik bir kültür kabına aktarın. Numuneyi 1x fosfat tamponlu salin (1x PBS) içine daldırın ve kan pıhtılarını veya kalıntılarını gidermek için numuneyi nazikçe yıkayın.
5. Dokuyu parçalara ayırın (0,5 cm x 0,5 cm veya 100-200 mg; Şekil 2A) küçük cerrahi makas veya 10-15 mm'lik bir neşter kullanarak. Dokuyu manipüle etmeye yardımcı olmak ve omentumun ezilmesini önlemek için küçük cerrahi forseps kullanın. Omentum örneğini cerrahi olarak çıkarmak için bir enerji cihazı kullanılmışsa, kapalı kenardaki çarpık dokuyu kullanmaktan kaçının.
6. Her bir kesilmiş omentum parçasını 24 oyuklu bir kültür plakasının ayrı oyuklarına yerleştirin ve kuyucukları 500 μL omentum kültür ortamı ile veya omentum parçasının kuyu tabanının üzerinde yüzmesine izin vermeden omentumu kaplamaya yetecek bir hacme kadar doldurun (Şekil 2B).
7. Omentum parçalarını enjeksiyona hazır olana kadar 4 °C'de taze kültür ortamında saklayın.

2. Yumurtalık kanseri hücrelerinin hazırlanması

1. İnsan yumurtalık kanseri hücrelerini 75^cm2'lik bir kültür şişesinde 37 ° C'de ve% 5 CO₂ ila en az% 75 birleşme gününe kadar kültürleyin.
   NOT: Bu protokol, daha önce^{açıklanan mCherry} pozitif OCSC1-F2 insan yumurtalık kanseri hücrelerini kullanır 15,16,17,18. Bir floresan sinyali ile etiketlenmiş herhangi bir kanser hücresi hattına modifiye edilebilir.
2. Omentum örneğinin toplanmasından hemen sonra hücreleri laminer akış başlığı içinde hazırlayın. Tüm malzemelerin ve aletlerin steril veya sterilize edildiğinden emin olun.
3. Kültür şişesine 10 mL steril 1x PBS ekleyin ve şişeyi hafifçe sallayarak hücreleri yıkayın. 1x PBS'yi çıkarın ve ardından 3 mL% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin.
4. Tüm hücreleri kaplamak için kültür şişesini hafifçe sallayın ve ardından şişeyi 5 dakikadan fazla olmamak üzere bir inkübatöre (37 °C ve %5 CO₂) yerleştirin. Hücreleri tamamen ayırmak için kültür şişesine dokunun ve ardından 3 mL omentum kültür ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.
5. Hücre süspansiyonunu pipetleme ile karıştırın ve ardından süspansiyonu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Süspansiyonu 24 °C'de 1.200 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 6 mL taze omentum kültürü ortamında yeniden süspanse edin.
6. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu 100-200 μL süspansiyon başına en az 100.000 hücreye seyreltin. Bu, kesilen her bir omentum parçasına enjeksiyon hacmidir.
7. Hücre geçişine devam etmek için uygun sayıda hücreyi yeni bir kültür şişesine aktarın.

3. Yumurtalık kanseri hücrelerinin enjeksiyonu

1. Hücre süspansiyonunu hazırlamak için 1 mL'lik bir şırınga kullanın, ardından 26 G'lik bir iğne takın. Hücreleri parçalayabileceğinden, iğneyi kullanarak hücre süspansiyonunu çizmeyin.
2. Bir parça kesilmiş omentum almak için küçük cerrahi forseps kullanın. Enjeksiyonu kolaylaştırmak için omentumu ayrı bir çalışan steril kaba aktarın. Omentumu iğne ucuyla nazikçe delin ve dokuya küçük bir hacimde hücre süspansiyonu enjekte edin (Şekil 2C).
3. En az 100 μL veya 100.000 hücrelik toplam hacme kadar birkaç omentum alanına enjeksiyonu tekrarlayın. Hücre süspansiyonunun çoğunun numunenin etrafında toplanmış gibi görünebileceğini unutmayın. Enjeksiyonun kalitesiyle ilgili endişeler varsa, enjeksiyonu tekrarlayın veya numuneye daha büyük hacimde hücre süspansiyonu enjekte edin.
4. Enjekte edilen omentum örneklerini 24 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna geri koyun. Omentum kültür ortamının hacminin, omentumun yüzmesine izin vermeden üzerini örtecek düzeyde olduğuna dikkat edin. Plakayı dikkatlice tutun ve bir inkübatörün içine yerleştirin (37 °C ve %5 CO₂).
5. İSTEĞE BAĞLI: Daha kolay enjeksiyon ve daha konsantre hücre süspansiyonu iletimi sağlamak için omentum dokusunu katı bir matriste askıya almak için Matrigel (bazal membran matrisi) kullanın.
   1. Bazal membran matrisini 4 °C'de çözdürün ve kullanımdan hemen önce omentum kültür ortamı ile 1:1 oranında karıştırın. Bazal membran matris karışımını enjeksiyona kadar buz üzerinde veya 4 °C'de saklayın. Kesilmiş bir omentum parçasını daldırmak için boş kuyuları yeterli bazal membran matris karışımı ile doldurun.
   2. Numuneleri bazal membran matris karışımına yerleştirin ve ardından 24 kuyulu kültür plakasını 20 dakika boyunca bir inkübatöre (37 °C ve %5_CO2) yerleştirin. Karışım katılaştıktan sonra, yukarıda tarif edildiği gibi enjeksiyona devam edin.
6. Floresan görüntüleme kullanarak enjeksiyonun başarılı olduğunu onaylayın. Enjeksiyon bölgelerinde bir floresan sinyal çizgisinin görüntülendiğinden emin olun (Şekil 2D). Enjeksiyondan sonra omentuma bağlı gerçek hücre sayısının tahmin edilemez olduğunu unutmayın.

4. İnsan omentum ve yumurtalık kanseri hücrelerinin birlikte kültürü

1. Her 48-72 saatte bir 500-2000 μL taze omentum kültür ortamı ekleyerek ortamı değiştirin. Kanser hücrelerinin yerini alabileceğinden ortamı doğrudan omentum dokusunun üzerine pipetlemeyin. Ortam rengi sarıya dönerse, ortamı değiştirin.
   NOT: Ortam değişiminin sıklığı, kullanılan ortamın hacmine ve kanser hücresi büyümesinin gidişatına bağlı olacaktır. Kanser hücreleri omentumu tohumladıktan sonra, omentum parçasının yüzer olup olmadığı artık önemli değildir.
2. İSTEĞE BAĞLI: Bir bazal membran matrisi kullanılmışsa, matris tipik olarak ilk ortam değişikliği sırasında çözülür.
3. Floresan görüntüleme kullanarak yumurtalık kanseri tümörlerinin büyümesini izleyin. Görüntüleme sıklığı araştırıcının takdirindedir. Küçük tümörlerin kanıtlarını yaklaşık 14 gün önceden tahmin edin (Şekil 3A-C). Sonuçlar enjeksiyonun kalitesine bağlı olarak değişebilir.
4. Denemeyi deneme uç noktasına göre sonlandırın.
   NOT: Tümör büyümesi ve omentum dokusunun bütünlüğü 50 günden fazla gözlenmiştir.

Sonuçlar

Yumurtalık kanseri hücrelerinin omentum örneklerine başarılı bir şekilde yerleşmesi yaklaşık 14. günde belirgindi. Daha fazla deneye izin vermek için toplanan örnek başına en az 24 kopya hazırlandı ve enjekte edildi. Tümör büyümesi floresan görüntüler alınarak izlendi (Şekil 3D,E). Görüntülerin dikkatli bir şekilde yorumlanması gerekiyordu, çünkü omentuma bağlı olmayan her kuy...

Tartışmalar

Bu protokol kullanılarak, temel in vitro ve ex vivo tekniklerin bir kombinasyonu kullanılarak yumurtalık kanseri için klinik öncesi bir peritoneal karsinomatoz modeli geliştirilmiştir. Omentum örneklerinin mCherry + OCSC1-F2 insan yumurtalık kanseri hücreleri ile tohumlanmasından sonra 50 günlük ko-kültür boyunca ilerleyici bir tümör büyümesi gözlendi. Bu yöntem, farklı omentum örnekleri kullanılarak yapılan çeşitli deneysel çalışmalarda geliştirilmiş ve optimize edilmiş...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo