عرض توضيحي لثقافة ورقة الخلايا المجمعة ذاتيا والتوليد اليدوي لوتر 3D / الأربطة الشبيهة بالعضوية باستخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية

Summary

هنا ، نعرض نموذجا عضويا من ثلاث خطوات (توسع ثنائي الأبعاد [2D] ، تحفيز ثنائي الأبعاد ، نضج ثلاثي الأبعاد [3D]) يقدم أداة واعدة للبحث الأساسي في الأوتار وطريقة محتملة خالية من السقالات لهندسة أنسجة الأوتار.

Abstract

الأوتار والأربطة (T / L) هي هياكل قوية منظمة هرميا توحد الجهاز العضلي الهيكلي. تحتوي هذه الأنسجة على مصفوفة خارج الخلية غنية بالكولاجين من النوع الأول (ECM) وخلايا سلالة T / L مرتبة بشكل أساسي في صفوف متوازية. بعد الإصابة ، يتطلب T / L وقتا طويلا لإعادة التأهيل مع مخاطر فشل عالية ونتائج إصلاح غير مرضية في كثير من الأحيان. على الرغم من التطورات الحديثة في أبحاث بيولوجيا T / L ، فإن أحد التحديات المتبقية هو أن مجال T / L لا يزال يفتقر إلى بروتوكول تمايز موحد قادر على تلخيص عملية تكوين T / L في المختبر. على سبيل المثال ، يتطلب تمايز العظام والدهون لخلايا السلائف الوسيطة فقط زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد القياسية (2D) وإضافة وسائط تحفيز محددة. للتمايز مع الغضاريف ، من الضروري زراعة الحبيبات ثلاثية الأبعاد (3D) ومكملات TGFß. ومع ذلك ، فإن تمايز الخلايا إلى الأوتار يحتاج إلى نموذج ثقافة 3D منظم للغاية ، والذي يجب أن يكون مثاليا أيضا خاضعا للتحفيز الميكانيكي الديناميكي. لقد أنشأنا نموذجا عضويا من 3 خطوات (التوسع والتحفيز والنضج) لتشكيل هيكل يشبه قضيب 3D من ورقة خلية مجمعة ذاتيا ، والتي توفر بيئة دقيقة طبيعية مع عوامل ECM و autocrine و paracrine الخاصة بها. تتميز هذه الكائنات العضوية الشبيهة بالقضيب ببنية خلوية متعددة الطبقات داخل ECM الغنية ويمكن التعامل معها بسهولة تامة للتعرض للإجهاد الميكانيكي الثابت. هنا ، أظهرنا البروتوكول المكون من 3 خطوات باستخدام الخلايا الليفية الجلدية المتاحة تجاريا. يمكننا أن نظهر أن هذا النوع من الخلايا يشكل عضويات قوية ووفيرة من ECM. يمكن تحسين الإجراء الموصوف بشكل أكبر من حيث وسائط الثقافة وتحسينه نحو التحفيز الميكانيكي المحوري الديناميكي. بنفس الطريقة ، يمكن اختبار مصادر الخلايا البديلة لقدرتها على تكوين عضويات T / L وبالتالي الخضوع لتمايز T / L. باختصار ، يمكن استخدام نهج 3D T / L العضوي المعمول به كنموذج للبحوث الأساسية للأوتار وحتى لهندسة T / L الخالية من السقالات.

Introduction

الأوتار والأربطة (T / L) هي مكونات حيوية للجهاز العضلي الهيكلي التي توفر الدعم الأساسي والاستقرار للجسم. على الرغم من دورها الحاسم ، فإن هذه الأنسجة الضامة عرضة للانحطاط والإصابة ، مما يسبب الألم وضعف الحركة¹. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي إمدادهم المحدود بالدم وقدرتهم البطيئة على الشفاء إلى إصابات مزمنة ، في حين أن عوامل مثل الشيخوخة والحركة المتكررة وإعادة التأهيل غير السليمة تزيد من خطر التنكس والإصابة². العلاجات التقليدية ، مثل الراحة والعلاج الطبيعي والتدخلات الجراحية ، غير قادرة على استعادة هيكل T / L ووظيفته بالكامل. على مدى السنوات القليلة الماضية ، سعى الباحثون إلى فهم الطبيعة المعقدة ل T / L بشكل أفضل من أجل الب....

Protocol

ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات باستخدام تقنيات التعقيم.

1. الثقافة والتوسع المسبق ل NHDFs

1. قم بإذابة قارورة التبريد التي تحتوي على الخلايا الليفية الجلدية البشرية الطبيعية المحفوظة بالتبريد (NHDFs ، 1 × 10⁶ خلايا) بسرعة عند 37 درجة مئوية حتى تكاد تذوب الجليد.
2. أضف ببطء 1 مل من وسط نمو الخلايا الليفية المسخنة مسبقا 2 (مجموعة جاهزة للاستخدام بما في ذلك الوسط القاعدي ، مصل ربلة الساق الجنيني 2٪ (FCS) ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) والأنسولين) مع 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (قلم / بكتيريا (NHDF متوسط) ، مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية إلى الخلايا.
3. نقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل....

النتائج

تم إنشاء نموذج 3D T / L العضوي مسبقا وإثباته هنا من خلال تنفيذ NHDF المشتراة تجاريا (ن = 3 ، 3 عضويات لكل متبرع ، تم استخدام NHDF في الممرات 5-8). يتم تلخيص سير عمل النموذج في الشكل 1. يوضح الشكل 2 صورا تمثيلية لتباين الطور لثقافة NHDF أثناء ما قبل التوسع في قوارير T-75 (

Discussion

توفر النتائج الموضحة في هذه الدراسة رؤى قيمة حول إنشاء وتوصيف نموذج NHDF 3D العضوي لدراسة أنسجة T / L. أدى البروتوكول المكون من 3 خطوات إلى تكوين عضويات تشبه قضيب ثلاثي الأبعاد تظهر ميزات نموذجية لمكانة T / L. تم الإبلاغ عن هذا النموذج سابقا في Kroner-Weigl et al. 2023⁷ وتم عرضه بتفصيل كبير ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B