Demonstration einer selbstorganisierten Zellblattkultur und manuelle Generierung eines 3D-Sehnen-/Ligamenten-ähnlichen Organoids unter Verwendung humaner dermaler Fibroblasten

Zusammenfassung

Darin demonstrieren wir ein dreistufiges Organoidmodell (zweidimensionale [2D]-Expansion, 2D-Stimulation, dreidimensionale [3D]-Reifung), das ein vielversprechendes Werkzeug für die Sehnengrundlagenforschung und eine potenziell gerüstfreie Methode für das Tendon Tissue Engineering bietet.

Zusammenfassung

Sehnen und Bänder (T/L) sind starke, hierarchisch organisierte Strukturen, die den Bewegungsapparat vereinen. Diese Gewebe haben eine streng angeordnete Kollagen-Typ-I-reiche extrazelluläre Matrix (EZM) und Zellen der T/L-Linie, die hauptsächlich in parallelen Reihen angeordnet sind. Nach einer Verletzung benötigen T/L eine lange Zeit für die Rehabilitation mit hohem Ausfallrisiko und oft unbefriedigenden Reparaturergebnissen. Trotz der jüngsten Fortschritte in der T/L-Biologieforschung besteht eine der verbleibenden Herausforderungen darin, dass es im T/L-Bereich immer noch kein standardisiertes Differenzierungsprotokoll gibt, das in der Lage ist, den T/L-Bildungsprozess in vitro zu rekapitulieren. Zum Beispiel erfordert die Knochen- und Fettdifferenzierung von mesenchymalen Vorläuferzellen nur eine standardmäßige zweidimensionale (2D) Zellkultur und die Zugabe spezifischer Stimulationsmedien. Zur Differenzierung zum Knorpel ist eine dreidimensionale (3D) Pelletkultur und eine Supplementierung von TGFß notwendig. Für die Zelldifferenzierung zur Sehne ist jedoch ein sehr geordnetes 3D-Kulturmodell erforderlich, das idealerweise auch einer dynamischen mechanischen Stimulation unterzogen werden kann. Wir haben ein 3-stufiges Organoidmodell (Expansion, Stimulation und Reifung) etabliert, um eine 3D-stäbchenartige Struktur aus einem selbstorganisierten Zellblatt zu bilden, das eine natürliche Mikroumgebung mit eigenen EZM-, autokrinen und parakrinen Faktoren liefert. Diese stäbchenartigen Organoide haben eine mehrschichtige zelluläre Architektur innerhalb einer reichhaltigen EZM und können recht einfach gehandhabt werden, um statischer mechanischer Belastung ausgesetzt zu werden. Hier haben wir das 3-Stufen-Protokoll anhand von kommerziell erhältlichen dermalen Fibroblasten demonstriert. Wir konnten zeigen, dass dieser Zelltyp robuste und EZM-reiche Organoide bildet. Das beschriebene Verfahren kann hinsichtlich der Nährmedien weiter optimiert und in Richtung dynamischer axial-mechanischer Stimulation optimiert werden. Auf die gleiche Weise können alternative Zellquellen auf ihr Potenzial getestet werden, T/L-Organoide zu bilden und so eine T/L-Differenzierung zu durchlaufen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der etablierte 3D-T/L-Organoid-Ansatz als Modell für die Sehnengrundlagenforschung und sogar für das gerüstfreie T/L-Engineering verwendet werden kann.

Einleitung

Sehnen und Bänder (T/L) sind wichtige Bestandteile des Bewegungsapparates, die dem Körper wesentliche Unterstützung und Stabilität bieten. Trotz ihrer entscheidenden Rolle ist dieses Bindegewebe anfällig für Degeneration und Verletzungen, was zu Schmerzen und Einschränkungen der Beweglichkeit führt¹. Darüber hinaus können ihre eingeschränkte Blutversorgung und ihre langsame Heilungsfähigkeit zu chronischen Verletzungen führen, während Faktoren wie Alterung, wiederholte Bewegungen und unsachgemäße Rehabilitation das Risiko von Degeneration und Verletzungen weiter erhöhen². Konventionelle Behandlungen wie Ruhe, Physiothera....

Protokoll

HINWEIS: Alle Schritte müssen mit aseptischen Techniken durchgeführt werden.

1. Kultur und Vorausbau von NHDFs

1. Tauen Sie das Kryofläschchen mit adulten kryokonservierten normalen dermalen Fibroblasten (NHDFs, 1 x 10⁶ Zellen) schnell bei 37 °C auf, bis sie fast aufgetaut sind.
2. Geben Sie langsam 1 ml vorgewärmtes Fibroblasten-Wachstumsmedium 2 (gebrauchsfertiges Kit mit Basalmedium, 2 % fötalem Kälberserum (FCS), basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und Insulin), ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Streptokokken) (NHDF-Medium), vorgewärmt bei 37 °C, zu den Zellen.
3. Übe....

Diskussion

Die in dieser Studie gezeigten Ergebnisse liefern wertvolle Einblicke in die Etablierung und Charakterisierung des NHDF 3D-Organoidmodells zur Untersuchung von T/L-Geweben. Das 3-Stufen-Protokoll führte zur Bildung von 3D-stäbchenförmigen Organoiden, die typische Merkmale der T/L-Nische aufweisen. Dieses Modell wurde bereits in Kroner-Weigl et al. 2023⁷ berichtet und hier sehr detailliert demonstriert.

Die Phasenkontrastbilder in Abbildu.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B