ヒト真皮線維芽細胞を用いた自己組織化細胞シート培養の実証と3次元腱・靭帯様オルガノイドの手動生成

要約

ここでは、腱の基礎研究に有望なツールと、腱組織工学のための潜在的な足場のない方法を提供する3ステップオルガノイドモデル(2次元[2D]拡張、2D刺激、3次元[3D]成熟)を実証します。

要約

腱と靭帯(T / L)は、筋骨格系を結合する強力な階層的に組織化された構造です。これらの組織は、厳密に配置されたコラーゲンI型に富む細胞外マトリックス(ECM)とT/L系統細胞を主に平行に並べています。怪我の後、T/Lはリハビリテーションに長い時間を必要とし、故障のリスクが高く、多くの場合、満足のいく修復結果が得られません。近年のT/L生物学研究の進歩にもかかわらず、残された課題の1つは、T/L分野には、 in vitroでT/L形成プロセスを再現できる標準化された分化プロトコルがまだないことです。例えば、間葉系前駆細胞の骨と脂肪の分化には、標準的な2次元(2D)細胞培養と特異的刺激培地の添加のみが必要です。軟骨への分化には、3次元(3D)ペレット培養とTGFβの補給が必要です。しかし、腱への細胞分化には、非常に整然とした3D培養モデルが必要であり、理想的には動的な機械的刺激にもさらされる必要があります。私たちは、自己組織化された細胞シートから3次元の棒状構造を形成する3段階(膨張、刺激、成熟)のオルガノイドモデルを確立し、ECM、オートクライン、パラクリン因子を持つ自然な微小環境を作り出しています。これらの棒状オルガノイドは、豊富なECM内に多層の細胞構造を持ち、静的な機械的ひずみにさらされても非常に簡単に扱うことができます。ここでは、市販の真皮線維芽細胞を用いて3ステップのプロトコールを実証しました。この細胞タイプが、強固でECMに富んだオルガノイドを形成することを示すことができました。記載された手順は、培地に関してさらに最適化され、動的軸方向の機械的刺激に向けて最適化され得る。同様に、代替細胞源は、T/Lオルガノイドを形成し、T/L分化を起こす可能性についてテストすることができます。要するに、確立された3D T/Lオルガノイドアプローチは、腱の基礎研究のモデルとして、さらには足場のないT/Lエンジニアリングにも使用できます。

概要

腱と靭帯(T / L)は、体に不可欠なサポートと安定性を提供する筋骨格系の重要な構成要素です。これらの結合組織は、その重要な役割にもかかわらず、変性や損傷を起こしやすく、痛みや運動障害を引き起こします¹。さらに、それらの限られた血液供給と遅い治癒能力は慢性的な怪我につながる可能性がありますが、老化、反復運動、不適切なリハビリテーションなどの要因は、変性や怪我のリスクをさらに高めます²。安静、理学療法、外科的介入などの従来の治療法では、T/Lの構造と機能を完全に回復させることはできません。過去数年間、研究者は T/L 障害の効果的な治療法を模索するために、T/L の複雑な性質をよりよく理解しようと努めてきました ^3,4,5。T/Lは、主にI型コラーゲン線維とプロテオグリカンで構成される、階層的に組織化された細胞外マトリックス(ECM)優位の構造によって区別されますが、これはin vitroで再現することが困難な特徴です⁶。従来の2次元(2D)細胞培養モデルは、T/L組織の特徴的な3次元(3D)組織を捉えることができず、翻訳の可能性を制限し、T/L再生の分野における革新的な進歩を妨げていました。

近年、3Dオルガノイドモデルの開発により、基礎研究や様々な^{組織タイプのス}キャフォールドフリー組織工学を前進させる新たな可能性がもたらされました7,8,9,10,11,12,13。例えば、筋腱接合部を調査するために、Larkin et al. 2006は、ラット尾腱に由来する自己組織化腱セグメントとともに3D骨格筋構造を開発した¹⁰。さらに、Schiele et al. 2013は、マイクロマシニングされたフィブロネクチン被覆成長チャネルを使用することにより、ヒト真皮線維芽細胞の自己組織化を指示し、3D足場の助けを借りずに細胞線維を形成することを示し、胚性腱発生の重要な形質を捉えることができるアプローチ^である11。Florida et al. 2016による研究では、骨髄間質細胞が最初に骨と靭帯の系統に拡大され、次に自己組織化された単層細胞シートを生成するために使用され、次に実装されて、靭帯再生の理解を深めることを目的としたモデルである、天然の前十字靭帯を模倣した多相性の骨-靭帯-骨構造を作成しました¹².腱のメカノトランスダクションプロセスを解明するために、Mubyana et al. 2018は、単一の腱繊維を作成し、機械的負荷プロトコル¹³にかける足場のない方法を利用しました。オルガノイドは、組織の本来の構造、微小環境、機能性を模倣した自己組織化された3D構造です。3Dオルガノイド培養は、組織や臓器の生物学、病態生理学を研究するための、より生理学的に適切なモデルを提供します。このようなモデルは、異なる幹細胞/前駆細胞型の組織特異的分化を誘導するためにも使用できます^14,15。したがって、T/L生物学および組織工学の分野で3Dオルガノイドモデルを実装することは、非常に魅力的なアプローチになります^9,16。オルガノイド集合体に代替の細胞源を実装し、テノイド分化に向けて刺激することができます。この研究でデモンストレーションに使用された関連する細胞タイプの1つは、真皮線維芽細胞^7,17,18です。これらの細胞は、骨髄穿刺や脂肪吸引に比べて侵襲性が低く、増殖能力が高いため、かなり迅速に大量に増殖できる皮膚生検手順によって簡単にアクセスできます。対照的に、T/L常在性線維芽細胞などのより特殊な細胞タイプは、単離と増殖がより困難です。したがって、真皮線維芽細胞は、人工多能性胚性幹細胞に向けた細胞リプログラミング技術の出発点としても使用された¹⁹。T/Lの形成と維持を含むさまざまな細胞プロセスの主要な調節因子として作用することが報告されているトランスフォーミング成長因子-β3(TGFß3)などの特定の3D培養条件とシグナル伝達の手がかりに真皮線維芽細胞をさらすと、腱特異的遺伝子の発現とT/L典型的なECMの沈着につながるin vitroのテノジェニック分化を増強できます^20、21.

ここでは、市販の正常な成人ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)を細胞源として使用して、以前に確立および実装された3ステップ(2D拡張、2D刺激、および3D成熟)オルガノイドプロトコルについて説明し、実証し、 in vitro 腱形成を研究するための貴重なモデル^{を提供します7。}このモデルは in vivo T/L組織と同等ではないという事実にもかかわらず、細胞分化メカニズムの調査、 in vitroでのT/L病態生理学の模倣、およびT/L個別化医療および薬物スクリーニングプラットフォームの確立に使用できる、より生理学的に関連性の高いシステムを提供します。さらに、将来的には、3Dオルガノイドが、天然のT/L組織の寸法や構造的および生物物理学的特性によく似た、スケールアップされた機械的に堅牢な構造の開発に利用できるだけでなく、さらなる最適化によって、足場のないT/Lエンジニアリングに適しているかどうかを評価することができます。

プロトコル

注:すべてのステップは、無菌技術を使用して実行する必要があります。

1. NHDFの培養と事前拡大

1. 成人の凍結保存された正常なヒト皮膚線維芽細胞(NHDF、1 x 10⁶ 細胞)を含むクライオバイアルを、ほぼ解凍するまで37°Cで急速に解凍します。
2. 1%ペニシリン/ストレプトマイシン(ペン/連鎖球菌)を補充した1mLの予熱した線維芽細胞増殖培地2(基礎培地、2%ウシ胎児血清(FCS)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、インスリンを含むすぐに使用できるキット)をゆっくりと加え、37°Cで細胞に予熱します。
3. 細胞を15mLの遠心チューブに移します。細胞を300 x g で室温(RT)で5分間遠心分離します。
4. 上清を取り除きます。細胞ペレットを予熱したNHDF培地12mLに再懸濁します。
5. 細胞をT-75フラスコに移し、横方向に短く振る。T-75フラスコを37°Cで5%_CO2 加湿インキュベーターに入れます。
6. 2日ごとに媒体を交換してください。NHDFが70%〜80%の合流度に達するまで顕微鏡で観察します。

2. 2D拡張

1. インキュベーターのT-75フラスコを取り出し、NHDF培地を取り出します。予熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。
2. 0.05%トリプシン-EDTAを3mL細胞に加えます。細胞がフラスコから剥がれるまで(約3分間)、5%_CO2 加湿インキュベーターで細胞を37°Cでインキュベートします。
3. 予熱したNHDF培地6mLを加えて、トリプシン作用を中和します。細胞を15mLの遠心チューブに移します。
4. 細胞を300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を除去します。
5. 細胞ペレットを、10%ウシ胎児血清(FBS)、1x MEMアミノ酸、1%ペン/連鎖球菌を添加したダルベッコのModified Eagles Medium(DMEM)低グルコースに再懸濁し、37°Cで予熱します。
6. NHDFを10cmの接着細胞培養皿に8×10³ NHDF/cm 2(合計4.4×10 5 NHDFs/^cm2 )の密度でプレートする(合計で、10cm皿あたり4.4×10×⁵ NHDFs)。横にやさしく揺らします。
7. 10 cmの細胞培養皿を37°Cで5%_CO2 加湿インキュベーターに入れます。2日ごとに媒体を交換する
8. 100%のコンフルエントに達するまで顕微鏡で細胞をモニターします(約5日)。

3. 2D刺激

1. NHDFを含む10cmの細胞培養皿(ステップ2.6および2.7)をインキュベーターから取り出します。培地を取り出し、予熱したPBSで細胞を洗浄します。
2. 10% FBS、50 μg/mL アスコルビン酸、および 1% ペン/溶連菌を添加した DMEM 高グルコース培地 10 mL を 37 °C で予温して加えます。
3. ペトリ皿を37°Cの5%_CO2 加湿雰囲気に置きます。2日ごとに媒体を交換してください。
4. NHDFを顕微鏡で14日間監視します。

4. 3D成熟

1. インキュベーターから10cmの細胞培養皿を取り出し、DMEM高グルコース培地を取り出します。
2. 形成された細胞シートを細胞スクレーパーで皿から穏やかかつ迅速に剥離する。剥離しながら、同時に細胞シートを3D棒状オルガノイドに丸めます。
3. NHDFオルガノイドを手に取り、10cmの非接着性(細胞用)シャーレに入れます。このディッシュタイプは、オルガノイドからプラスチックへの細胞の流出を防ぐために使用されます。
4. この時点または翌日(3D成熟の0日目または1日目)に、湿重量、組織学的評価(1日目のオルガノイドはよりコンパクトになるため好ましい)、RNAおよびタンパク質の単離などのさらなる分析のために、いくつかのオルガノイドを採取します。
5. オルガノイドの端を金属ピンで次のように固定します。
   1. オルガノイドの片側をピンセットで注意深く保持し、別のピンセットで、軸方向伸び約10%の手動ストレッチを静かに適用します。軸方向の伸びを10%見積もるには、ミリメートル紙または定規を使用します。
   2. 次に、ピンセットで金属ピンを1本手に取り、オルガノイドの端からプラスチック皿に手動で押し下げて固定します。オルガノイドの2番目の端に2番目のピンでこの手順を繰り返します。
6. 10% FBS、1x MEM アミノ酸、50 μg/mL アスコルビン酸、10 ng/mL TGFβ3、および 1% ペン/連鎖球菌を添加した DMEM 高グルコース培地 10 mL を 37 °C で予温して加えます。
7. 10cmの皿を37°Cの5%_CO2 加湿雰囲気に置きます。2日ごとに媒体を交換してください。
8. オルガノイドを14日間定期的に観察してください。
   注意: ピンが緩む可能性があるため、手順4.5で説明したのと同じ方法を使用して再固定します。
9. 14日後、オルガノイドからDMEM高グルコース培地を取り出します。予熱したPBSでオルガノイドを洗浄します。
10. 精密スケールを使用して、0日目と14日目のオルガノイドの湿重量を測定します。
    1. 空の10cm皿をはかりに置き、重量をゼロにすることで、オルガノイドの重量のみが測定されるようにします。10cm皿から培地を完全に取り出し、オルガノイドの湿重量を1つずつ測定します。
       注:この研究では、0日目にドナーあたり3つのオルガノイドを、14日目にドナーごとに2つのオルガノイドを計量しました。
11. 研究目的に応じて、NHDFオルガノイドの一部をさらに組織学的分析に導入するか、その後のDNA、RNA、およびタンパク質の単離のために滅菌DNA/RNAフリーチューブを使用して液体窒素で直ちに凍結し、-80°Cで保存します。
12. 組織学的調査では、各オルガノイドをPBS(中性pHに調整)した予冷(4°C)4%パラホルムアルデヒド5mLに氷上で45分間固定し、続いて室温(各2 x 5分)でPBS洗浄します。
13. 組織学用のガラス瓶にオルガノイドを入れて、ショ糖勾配を使用して固定オルガノイドを凍結保護します。オルガノイドを10%ショ糖のPBS溶液中で4°Cで2時間インキュベートし、続いて20%スクロース/PBSを4°Cで2時間インキュベートし、最後に30%スクロース/PBSを4°Cで一晩インキュベートします。 最初にピペッティングしてスクロース溶液を交換し、次に新しい溶液で満たします。
14. オルガノイドをクライオ培地に埋め込みます。
    1. 発泡スチロールの箱に入れたドライアイスの上に銅板を置き、10分間冷まします。
    2. 次に、クライオメディウムをあらかじめ充填したプラスチック製のクライオモールドを銅板の上に置き、ピンセットを使用してオルガノイドをクライオモールドの底にそっと押し付けます。凍結培地が完全に凍結するまで待ちます。
    3. 長いオルガノイドの場合は、まずメスで半分に切り、2つの半分を互いに平行に冷凍金型に入れます。組織学的分析を受けることを意図した各オルガノイドについて手順を繰り返します。
15. 凍結切片まで-20°Cでサンプルを保管します。
16. クライオトームを使用して、オルガノイドを縦方向に厚さ10 μmの切片に切断し、標準プロトコル⁸を使用してヘマトキシリンやエオシン(H&E)などの組織学的染色を行います。

結果

3D T/Lオルガノイドモデルは、市販のNHDFを実施することで以前に確立され、ここで実証されました(n = 3、ドナーあたり3つのオルガノイド、NHDFは継代5〜8で使用されました)。モデルのワークフローを 図 1 にまとめます。 図2 は、T-75フラスコでの膨張前(図2A)と、10cm細胞培養皿での2D増殖ステップでの培養の開始時と5日間の培養...

ディスカッション

この研究で実証された結果は、T/L 組織を研究するための NHDF 3D オルガノイド モデルの確立と特性評価に関する貴重な洞察を提供します。3ステップのプロトコルにより、T/Lニッチの典型的な特徴を示す3D棒状オルガノイドが形成されました。このモデルは、以前にKroner-Weigl et al.2023 :⁷ で報告されており、ここで非常に詳細に実証されています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B