Human Dermal Fibroblast를 이용한 Self-Assembled Cell Sheet Culture 및 3D Tendon/Ligament-like Organoid의 수동 생성 시연

요약

여기에서는 힘줄 기초 연구를 위한 유망한 도구이자 힘줄 조직 공학을 위한 잠재적인 스캐폴드 없는 방법을 제공하는 3단계 오가노이드 모델(2차원[2D] 확장, 2D 자극, 3차원[3D] 성숙)을 시연합니다.

초록

힘줄과 인대(T/L)는 근골격계를 하나로 묶는 강력하고 계층적으로 조직된 구조입니다. 이 조직에는 주로 평행한 줄에 위치한 콜라겐 유형 I-rich 세포외 기질(ECM)과 T/L-계통 세포가 엄격하게 배열되어 있습니다. 부상 후 T/L은 고장 위험이 높고 종종 만족스럽지 않은 수리 결과로 재활에 오랜 시간이 필요합니다. 최근 T/L 생물학 연구의 발전에도 불구하고 남아 있는 과제 중 하나는 T/L 분야에는 여전히 체외에서 T/L 형성 과정을 재현할 수 있는 표준화된 분화 프로토콜이 부족하다는 것입니다. 예를 들어, 중간엽 전구체 세포의 뼈 및 지방 분화에는 표준 2차원(2D) 세포 배양과 특정 자극 매체의 추가만 필요합니다. 연골을 분화하기 위해서는 3차원(3D) 펠릿 배양 및 TGFß 보충이 필요합니다. 그러나 힘줄에 대한 세포 분화에는 매우 질서 정연한 3D 배양 모델이 필요하며, 이상적으로는 동적 기계적 자극도 받을 수 있어야 합니다. 3-step (Expansion, Stimulation, and Maturation) 오가노이드 모델을 구축하여 자체 조립된 세포장에서 3D 막대 형태의 구조를 형성하였으며, 이를 통해 자체 ECM, 자가분비, 측분비 인자를 가진 자연스러운 미세환경을 구현하였습니다. 이러한 막대 모양의 오가노이드는 풍부한 ECM 내에서 다층 세포 구조를 가지고 있으며 정전기적인 기계적 변형에 노출될 경우 매우 쉽게 처리할 수 있습니다. 여기에서는 시판되는 진피 섬유아세포를 사용하여 3단계 프로토콜을 시연했습니다. 우리는 이 세포 유형이 견고하고 ECM이 풍부한 오가노이드를 형성한다는 것을 보여줄 수 있습니다. 설명된 절차는 배양 배지 측면에서 더욱 최적화될 수 있고 동적 축방향 기계적 자극에 대해 최적화될 수 있습니다. 같은 방식으로, 대체 세포 소스가 T/L 오가노이드를 형성할 수 있는 잠재력을 테스트하여 T/L 분화를 거칠 수 있습니다. 요컨대, 확립된 3D T/L 오가노이드 접근 방식은 힘줄 기초 연구 및 스캐폴드가 없는 T/L 엔지니어링의 모델로 사용할 수 있습니다.

서문

힘줄과 인대(T/L)는 신체에 필수적인 지지와 안정성을 제공하는 근골격계의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 결합 조직은 중요한 역할에도 불구하고 퇴화와 손상이 발생하기 쉬워 통증과 이동성 장애를 유발합니다¹. 더욱이, 제한된 혈액 공급과 느린 치유 능력은 만성 부상으로 이어질 수 있으며, 노화, 반복적인 움직임 및 부적절한 재활과 같은 요인은 퇴행 및 부상의 위험을 더욱 증가시킨다². 휴식, 물리치료, 외과적 치료와 같은 기존의 치료법으로는 T/L 구조와 기능을 완전히 회복할 수 없습니다. 지난 몇 년 동안 연구자들은 T/L 장애에 대한 효과적인 치료법을 찾기 위해 T/L의 복잡한 특성을 더 잘 이해하기 위해 노력해 왔습니다 ^3,4,5. T/L은 주로 I형 콜라겐 섬유와 프로테오글리칸으로 구성된 계층적으로 조직화된 세포외 기질(ECM) 지배 구조로 구별되며, 이러한 특징은 시험관 내에서 복제하기 어려운 특징입니다 ⁶. 기존의 2차원(2D) 세포 배양 모델은 T/L 조직의 특징적인 3차....

프로토콜

알림: 모든 단계는 무균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.

1. NHDF의 문화와 사전 확장

1. 성인 냉동 보존된 정상적인 인간 피부 섬유아세포(NHDF, 1 x 10⁶ 세포)가 들어 있는 cryo-vial을 거의 해동될 때까지 37°C에서 빠르게 해동합니다.
2. 37°C에서 예열된 1% 페니실린/스트렙토마이신(펜/연쇄상구균)(NHDF 배지)이 보충된 예열된 섬유아세포 성장 배지 2(기저 배지, 2% 태아 송아지 혈청(FCS), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 인슐린을 포함한 즉시 사용 가능한 키트) 1mL를 세포에 천천히 추가합니다.
3. 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 실온(RT)에서 5분 동안 300 x g 에서 셀을 원심분리합니다.
4. 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 12mL의 예열된 NHDF 배지에 재현탁시킵니다.
5. 세포를 T-75 플라스크에 옮기고 십자형으로 짧게 흔듭니다. T-75 플라스크를 37°C에서 5%_CO2 가습 인큐베이터에 넣습니다.
6. 2일마다 매체를 교체하십시오. NHDF가 70% - 80%의 밀도에 도달할 때까지 현미경으로....

토론

이 연구에서 입증된 결과는 T/L 조직 연구를 위한 NHDF 3D 오가노이드 모델의 확립 및 특성화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 3단계 프로토콜은 T/L 틈새의 전형적인 특징을 나타내는 3D 막대 모양의 오가노이드를 형성했습니다. 이 모델은 이전에 Kroner-Weigl et al. 2023⁷ 에 보고되었으며 여기에서 매우 자세히 시연되었습니다.

그림 2

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B