使用人真皮成纤维细胞自组装细胞片培养和手动生成 3D 肌腱/韧带样类器官的演示

摘要

在此，我们展示了一种三步类器官模型（二维[2D]扩展、二维刺激、三维[3D]成熟），为肌腱基础研究提供了一种有前途的工具，并为肌腱组织工程提供了一种潜在的无支架方法。

摘要

肌腱和韧带 （T/L） 是连接肌肉骨骼系统的坚固、层次分明的结构。这些组织具有严格排列的富含 I 型胶原的细胞外基质 （ECM） 和 T/L 谱系细胞，主要分布在平行行中。损伤后，T/L需要很长时间进行康复，故障风险高，修复结果往往不尽如人意。尽管 T/L 生物学研究最近取得了进展，但仍然存在的挑战之一是 T/L 领域仍然缺乏能够概括体 外 T/L 形成过程的标准化分化方案。例如，间充质前体细胞的骨和脂肪分化只需要标准的二维 （2D） 细胞培养和添加特定的刺激培养基。为了分化到软骨，需要三维 （3D） 颗粒培养和补充 TGFß。然而，细胞分化为肌腱需要一个非常有序的 3D 培养模型，理想情况下，该模型也应该能够受到动态机械刺激。我们已经建立了一个 3 步（扩增、刺激和成熟）类器官模型，以从自组装细胞片中形成 3D 棒状结构，该细胞片提供具有自身 ECM、自分泌和旁分泌因子的自然微环境。这些棒状类器官在丰富的 ECM 中具有多层细胞结构，并且可以很容易地处理暴露于静态机械应变。在这里，我们通过使用市售的真皮成纤维细胞演示了 3 步方案。我们可以证明，这种细胞类型形成了健壮且富含ECM的类器官。所描述的程序可以在培养基方面进一步优化，并针对动态轴向机械刺激进行优化。同样，可以测试替代细胞来源形成 T/L 类器官的潜力，从而进行 T/L 分化。综上所述，建立的3D T/L类器官方法可作为肌腱基础研究的模型，甚至可以作为无支架T/L工程的模型。

引言

肌腱和韧带 （T/L） 是肌肉骨骼系统的重要组成部分，为身体提供必要的支撑和稳定性。尽管这些结缔组织起着关键作用，但它们容易退化和受伤，导致疼痛和行动障碍¹。此外，他们的血液供应有限和愈合能力缓慢会导致慢性损伤，而衰老、重复运动和康复不当等因素则进一步增加了退化和受伤的风险².常规治疗，如休息、物理治疗和手术干预，无法完全恢复 T/L 结构和功能。在过去的几年中，研究人员一直在努力更好地了解 T/L 的复杂性，以便寻求 T/L 疾病的有效治疗方法 ^3,4,5。T/L 的特点是层次结构合理、以细胞外基质 （ECM） 为主的结构，主要由 I 型胶原纤维和蛋白聚糖组成，这一特征在体外难以复制 ⁶。传统的二维（2D）细胞培养模型无法捕捉T/L组织的特征性三维（3D）组织，限制了其转化潜力，并阻碍了T/L再生领域的创新进展。

最近，3D类器官模型的发展为推进各种^{组织类型的基础}研究和无支架组织工程提供了新的可能性7,8,9,10,11,12,13。

研究方案

注意：所有步骤都必须使用无菌技术进行。

1. NHDF的培养和预扩增

1. 在37°C下快速解冻含有成体冷冻保存的正常人真皮成纤维细胞（NHDF，1 x 10⁶ 个细胞）的冻存瓶，直到它们几乎解冻。
2. 缓慢加入1mL预热的成纤维细胞生长培养基2（即用型试剂盒，包括基础培养基，2%胎牛血清（FCS），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和胰岛素），补充有1%青霉素/链霉素（pen/strep）（NHDF培养基），在37°C下预热到细胞中。
3. 将细胞转移到 15 mL 离心管中。在室温（RT）下以300× g 离心细胞5分钟。
4. 取出上清液。将细胞沉淀重悬于 12 mL 预热的 NHDF 培养基中。
5. 将细胞转移到 T-75 烧瓶中，并以交叉方式短暂摇动。将T-75烧瓶在37°C下置于5%CO₂ 加湿培养箱中。
6. 每 2 天更换一次培养基。在显微镜下观察NHDF，直到它们达到70%-80%汇合度。

2. 2D扩展

1. 取出培养箱的 T-75 烧瓶并取出 NHDF 培养基。用预热的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。
2. 向细胞中加入 3 mL 0.05% ....

讨论

本研究结果为NHDF 3D类器官模型的建立和表征提供了宝贵的见解，用于研究T/L组织。3 步方案导致 3D 杆状类器官的形成，这些类器官表现出 T/L 生态位的典型特征。该模型之前在 Kroner-Weigl 等人 2023⁷ 中报道，并在此处进行了非常详细的演示。

图 2 中显示的相差图像显示了在扩增和刺激步骤期间 NHDF 汇合和片状形成的进展。3D成熟过.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B