Demostración de cultivo de láminas celulares autoensambladas y generación manual de un organoide similar a un tendón/ligamento en 3D mediante el uso de fibroblastos dérmicos humanos

Resumen

Aquí, demostramos un modelo de organoide de tres pasos (expansión bidimensional [2D], estimulación 2D, maduración tridimensional [3D]) que ofrece una herramienta prometedora para la investigación fundamental de tendones y un posible método sin andamios para la ingeniería de tejidos tendinosos.

Resumen

Los tendones y ligamentos (T/L) son estructuras fuertes y jerárquicamente organizadas que unen el sistema musculoesquelético. Estos tejidos tienen una matriz extracelular (MEC) rica en colágeno tipo I estrictamente dispuesta y células de linaje T / L ubicadas principalmente en filas paralelas. Después de una lesión, las T/L requieren mucho tiempo para la rehabilitación con un alto riesgo de fracaso y, a menudo, resultados de reparación insatisfactorios. A pesar de los recientes avances en la investigación de la biología T/L, uno de los desafíos pendientes es que el campo T/L aún carece de un protocolo de diferenciación estandarizado que sea capaz de recapitular el proceso de formación de T/L in vitro. Por ejemplo, la diferenciación ósea y grasa de las células precursoras mesenquimales requiere solo un cultivo celular bidimensional (2D) estándar y la adición de medios de estimulación específicos. Para la diferenciación al cartílago, es necesario el cultivo tridimensional (3D) de gránulos y la suplementación con TGFß. Sin embargo, la diferenciación celular al tendón necesita un modelo de cultivo 3D muy ordenado, que idealmente también debería ser sometida a estimulación mecánica dinámica. Hemos establecido un modelo de organoide de 3 pasos (expansión, estimulación y maduración) para formar una estructura 3D en forma de bastón a partir de una lámina celular autoensamblada, que proporciona un microambiente natural con sus propios factores ECM, autocrinos y paracrinos. Estos organoides en forma de bastón tienen una arquitectura celular de múltiples capas dentro de una ECM rica y se pueden manejar con bastante facilidad para la exposición a la tensión mecánica estática. Aquí, demostramos el protocolo de 3 pasos mediante el uso de fibroblastos dérmicos disponibles comercialmente. Podríamos demostrar que este tipo de células forma organoides robustos y abundantes en MEC. El procedimiento descrito puede optimizarse aún más en términos de medios de cultivo y optimizarse hacia la estimulación mecánica axial dinámica. De la misma manera, se puede probar el potencial de las fuentes celulares alternativas para formar organoides T/L y, por lo tanto, experimentar una diferenciación T/L. En resumen, el enfoque establecido de organoides T/L en 3D se puede utilizar como modelo para la investigación básica de tendones e incluso para la ingeniería de T/L sin andamios.

Introducción

Los tendones y ligamentos (T/L) son componentes vitales del sistema musculoesquelético que proporcionan soporte y estabilidad esenciales al cuerpo. A pesar de su papel crítico, estos tejidos conectivos son propensos a la degeneración y a las lesiones, causando dolor y deterioro^{de la movilidad}. Además, su suministro limitado de sangre y su lenta capacidad de curación pueden provocar lesiones crónicas, mientras que factores como el envejecimiento, los movimientos repetitivos y la rehabilitación inadecuada aumentan aún más el riesgo de degeneración^{y lesiones.} Los tratamientos convencionales, como el reposo, la fisioterapia ....

Protocolo

NOTA: Todos los pasos deben realizarse utilizando técnicas asépticas.

1. Cultura y preexpansión de los NHDF

1. Descongele rápidamente el vial criogénico que contiene fibroblastos dérmicos humanos normales adultos criopreservados (NHDF, 1 x 10⁶ células) a 37 °C hasta que estén casi descongelados.
2. Añada lentamente 1 mL de medio de crecimiento de fibroblastos precalentado 2 (kit listo para usar que incluye medio basal, suero de ternero fetal (FCS) al 2%, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) e insulina) suplementado con penicilina/estreptomicina (pen/estreptococo) al 1% (medio NHDF), p....

Discusión

Los resultados demostrados en este estudio proporcionan información valiosa sobre el establecimiento y la caracterización del modelo de organoide NHDF 3D para el estudio de los tejidos T/L. El protocolo de 3 pasos condujo a la formación de organoides en forma de bastón en 3D que exhiben características típicas del nicho T/L. Este modelo se informó anteriormente en Kroner-Weigl et al. 2023⁷ y se demostró con gran detalle aquí.

Las imágenes de contraste.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B