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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, demostramos un modelo de organoide de tres pasos (expansión bidimensional [2D], estimulación 2D, maduración tridimensional [3D]) que ofrece una herramienta prometedora para la investigación fundamental de tendones y un posible método sin andamios para la ingeniería de tejidos tendinosos.

Resumen

Los tendones y ligamentos (T/L) son estructuras fuertes y jerárquicamente organizadas que unen el sistema musculoesquelético. Estos tejidos tienen una matriz extracelular (MEC) rica en colágeno tipo I estrictamente dispuesta y células de linaje T / L ubicadas principalmente en filas paralelas. Después de una lesión, las T/L requieren mucho tiempo para la rehabilitación con un alto riesgo de fracaso y, a menudo, resultados de reparación insatisfactorios. A pesar de los recientes avances en la investigación de la biología T/L, uno de los desafíos pendientes es que el campo T/L aún carece de un protocolo de diferenciación estandarizado que sea capaz de recapitular el proceso de formación de T/L in vitro. Por ejemplo, la diferenciación ósea y grasa de las células precursoras mesenquimales requiere solo un cultivo celular bidimensional (2D) estándar y la adición de medios de estimulación específicos. Para la diferenciación al cartílago, es necesario el cultivo tridimensional (3D) de gránulos y la suplementación con TGFß. Sin embargo, la diferenciación celular al tendón necesita un modelo de cultivo 3D muy ordenado, que idealmente también debería ser sometida a estimulación mecánica dinámica. Hemos establecido un modelo de organoide de 3 pasos (expansión, estimulación y maduración) para formar una estructura 3D en forma de bastón a partir de una lámina celular autoensamblada, que proporciona un microambiente natural con sus propios factores ECM, autocrinos y paracrinos. Estos organoides en forma de bastón tienen una arquitectura celular de múltiples capas dentro de una ECM rica y se pueden manejar con bastante facilidad para la exposición a la tensión mecánica estática. Aquí, demostramos el protocolo de 3 pasos mediante el uso de fibroblastos dérmicos disponibles comercialmente. Podríamos demostrar que este tipo de células forma organoides robustos y abundantes en MEC. El procedimiento descrito puede optimizarse aún más en términos de medios de cultivo y optimizarse hacia la estimulación mecánica axial dinámica. De la misma manera, se puede probar el potencial de las fuentes celulares alternativas para formar organoides T/L y, por lo tanto, experimentar una diferenciación T/L. En resumen, el enfoque establecido de organoides T/L en 3D se puede utilizar como modelo para la investigación básica de tendones e incluso para la ingeniería de T/L sin andamios.

Introducción

Los tendones y ligamentos (T/L) son componentes vitales del sistema musculoesquelético que proporcionan soporte y estabilidad esenciales al cuerpo. A pesar de su papel crítico, estos tejidos conectivos son propensos a la degeneración y a las lesiones, causando dolor y deteriorode la movilidad. Además, su suministro limitado de sangre y su lenta capacidad de curación pueden provocar lesiones crónicas, mientras que factores como el envejecimiento, los movimientos repetitivos y la rehabilitación inadecuada aumentan aún más el riesgo de degeneracióny lesiones. Los tratamientos convencionales, como el reposo, la fisioterapia y las intervenciones quirúrgicas, no pueden restaurar completamente la estructura y la función de la T/L. En los últimos años, los investigadores se han esforzado por comprender mejor la naturaleza compleja de la T/L con el fin de buscar tratamientos efectivos para los trastornos de la T/L 3,4,5. Las T/L se distinguen por una estructura jerárquicamente organizada, dominada por la matriz extracelular (MEC), compuesta principalmente por fibras de colágeno tipo I y proteoglicanos, una característica difícil de replicar in vitro6. Los modelos tradicionales de cultivo celular bidimensional (2D) no logran capturar la organización tridimensional (3D) característica de los tejidos T/L, lo que limita su potencial de traducción y obstaculiza el progreso innovador en el campo de la regeneración T/L.

Recientemente, el desarrollo de modelos de organoides en 3D ha ofrecido nuevas posibilidades para avanzar en la investigación básica y la ingeniería de tejidos sin andamios de varios tipos de tejidos 7,8,9,10,11,12,13. Por ejemplo, para investigar la unión miotendinosa, Larkin et al. 2006 desarrollaron construcciones de músculo esquelético en 3D junto con segmentos de tendón autoorganizados derivados del tendón de cola de rata10. Por otra parte, Schiele et al. 2013, mediante el uso de canales de crecimiento recubiertos de fibronectina micromecanizados, dirigieron el autoensamblaje de fibroblastos dérmicos humanos para formar fibras celulares sin la ayuda de andamios 3D, un enfoque que puede capturar rasgos clave del desarrollo del tendón embrionario11. En el estudio de Florida et al. 2016, las células estromales de la médula ósea se expandieron primero en linajes de hueso y ligamento, y luego se utilizaron para generar láminas de células monocapa autoensambladas, que luego se implementaron para crear una construcción multifásica hueso-ligamento-hueso que imita el ligamento cruzado anterior nativo, un modelo que tiene como objetivo mejorar la comprensión de la regeneración del ligamento12. Para dilucidar los procesos de mecanotransducción de tendones, Mubyana et al. 2018 utilizaron una metodología sin andamios mediante la cual se crearon fibras de tendones individuales y se sometieron a un protocolo de carga mecánica13. Los organoides son estructuras 3D autoorganizadas que imitan la arquitectura nativa, el microambiente y la funcionalidad de los tejidos. Los cultivos de organoides en 3D proporcionan un modelo fisiológicamente más relevante para estudiar la biología de tejidos y órganos, así como la fisiopatología. Estos modelos también se pueden utilizar para inducir la diferenciación específica del tejido de diferentes tipos de células madre/progenitoras14,15. Por lo tanto, la implementación de modelos de organoides 3D en el campo de la biología T/L y la ingeniería de tejidos se convierte en un enfoque muy atractivo 9,16. Se pueden implementar fuentes celulares alternativas para el ensamblaje de organoides y estimularlas hacia la diferenciación tenogénica. Un tipo de célula relevante utilizado para la demostración en este estudio son los fibroblastos dérmicos 7,17,18. Estas células son fácilmente accesibles a través de un procedimiento de biopsia de piel, que es menos invasivo en comparación con la punción de médula ósea o la liposucción y puede multiplicarse con bastante rapidez a grandes cantidades debido a su buena capacidad proliferativa. Por el contrario, los tipos de células más especializados, como los fibroblastos residentes en T/L, son más difíciles de aislar y expandir. Por lo tanto, los fibroblastos dérmicos también se utilizaron como punto de partida para las tecnologías de reprogramación celular hacia células madre embrionarias pluripotentes inducidas19. El sometimiento de fibroblastos dérmicos a condiciones específicas de cultivo 3D y señales de señalización, como el factor de crecimiento transformante beta 3 (TGFß3), que se ha informado que actúa como un regulador clave de varios procesos celulares, incluida la formación y el mantenimiento de T/L, puede potenciar su diferenciación tenogénica in vitro, lo que conduce a la expresión de genes específicos del tendón y la deposición de ECM típica de T/L20. Artículo 21.

Aquí, describimos y demostramos un protocolo de organoides de 3 pasos (expansión 2D, estimulación 2D y maduración 3D) previamente establecido e implementado utilizando fibroblastos dérmicos humanos adultos normales (NHDF) disponibles comercialmente como fuente celular, ofreciendo un modelo valioso para estudiar la tenogénesis in vitro 7. A pesar de que este modelo no es equivalente al tejido T/L in vivo, proporciona un sistema fisiológicamente más relevante que puede utilizarse para investigar los mecanismos de diferenciación celular, imitar la fisiopatología T/L in vitro y establecer plataformas de detección de fármacos y medicina personalizada T/L. Además, en el futuro, los estudios pueden evaluar si los organoides 3D son adecuados para la ingeniería de T/L sin andamios mediante una mayor optimización, así como utilizables para el desarrollo de construcciones mecánicamente robustas a escala que se asemejen mucho a las dimensiones y propiedades estructurales y biofísicas de los tejidos T/L nativos.

Protocolo

NOTA: Todos los pasos deben realizarse utilizando técnicas asépticas.

1. Cultura y preexpansión de los NHDF

  1. Descongele rápidamente el vial criogénico que contiene fibroblastos dérmicos humanos normales adultos criopreservados (NHDF, 1 x 106 células) a 37 °C hasta que estén casi descongelados.
  2. Añada lentamente 1 mL de medio de crecimiento de fibroblastos precalentado 2 (kit listo para usar que incluye medio basal, suero de ternero fetal (FCS) al 2%, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) e insulina) suplementado con penicilina/estreptomicina (pen/estreptococo) al 1% (medio NHDF), precalentado a 37 °C a las células.
  3. Transfiera las células a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar las celdas a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
  4. Retire el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de celda en 12 mL de medio NHDF precalentado.
  5. Transfiera las células a un matraz T-75 y agite brevemente de manera transversal. Coloque el matraz T-75 a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 .
  6. Cambie el medio cada 2 días. Observe los NHDF bajo un microscopio hasta que alcancen un 70% - 80% de confluencia.

2. Expansión 2D

  1. Saque el matraz T-75 de la incubadora y retire el medio NHDF. Lave las células con solución salina tampón de fosfato (PBS) precalentado.
  2. Añadir 3 mL de tripsina-EDTA al 0,05% a las células. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 hasta que las células se desprendan del matraz (aproximadamente 3 min).
  3. Añadir 6 mL de medio NHDF precalentado para neutralizar la acción de la tripsina. Transfiera las células a un tubo de centrífuga de 15 ml.
  4. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a RT y eliminar el sobrenadante.
  5. Resuspender el pellet celular en Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) de baja glucosa suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS), 1x aminoácidos MEM, 1% pen/estreptococo, precalentado a 37 °C.
  6. Colocar los NHDF en una placa de cultivo celular adherente de 10 cm a una densidad de 8 x 103 NHDF/cm2 (en total, 4,4 x 105 NHDF por placa de 10 cm). Mecete suavemente en forma transversal.
  7. Coloque la placa de cultivo celular de 10 cm a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 . Cambiar el medio cada 2 días
  8. Monitorizar las células al microscopio hasta alcanzar el 100% de confluencia (aprox. 5 días).

3. Estimulación 2D

  1. Extraiga las placas de cultivo celular de 10 cm que contienen los NHDF (de los pasos 2.6 y 2.7) de la incubadora. Retire el medio de cultivo y lave las células con PBS precalentado.
  2. Añadir 10 mL de medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con 10% de FBS, 50 μg/mL de ácido ascórbico y 1% de pen/estreptococo, precalentado a 37 °C.
  3. Coloque la placa de Petri a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 . Cambie el medio cada 2 días.
  4. Monitoree los NHDF bajo un microscopio durante 14 días.

Maduración 4. 3D

  1. Saque la placa de cultivo celular de 10 cm de la incubadora y retire el medio DMEM con alto contenido de glucosa.
  2. Separe suave y rápidamente la lámina de células formada del plato con un raspador de células. Mientras se separa, enrolle simultáneamente la lámina de células en un organoide 3D similar a una varilla.
  3. Recoja y coloque los organoides NHDF en una placa de Petri no adherente (para células) de 10 cm. Este tipo de placa se utiliza para evitar la emigración celular del organoide al plástico.
  4. En este momento o un día después (día 0 o día 1 de maduración 3D), recoja algunos de los organoides para análisis posteriores como el peso húmedo, la evaluación histológica (los organoides del día 1 son preferibles ya que se vuelven más compactos), el aislamiento de ARN y proteínas.
  5. Fije los bordes del organoide con alfileres de metal de la siguiente manera:
    1. Sostenga un lado del organoide con cuidado con una pinza y, con otra pinza, aplique suavemente un estiramiento manual de aproximadamente el 10% de elongación axial. Para estimar el alargamiento axial del 10%, utilice un milímetro de papel o una regla.
    2. A continuación, tome un alfiler de metal con la pinza y presione manualmente hacia abajo a través del borde del organoide en el plato de plástico para fijarlo. Repita este procedimiento con el segundo alfiler en el segundo borde del organoide.
  6. Añadir 10 mL de medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con 10% de FBS, 1x aminoácidos MEM, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 ng/mL de TGFß3 y 1% de pen/estreptococo, precalentado a 37 °C.
  7. Coloque el plato de 10 cm a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 . Cambie el medio cada 2 días.
  8. Controle los organoides regularmente durante 14 días.
    NOTA: Es posible que los alfileres se aflojen, por lo tanto, vuelva a fijarlos utilizando la misma técnica que se describe en el paso 4.5.
  9. Después de 14 días, retire el medio DMEM con alto contenido de glucosa de los organoides. Lave los organoides con PBS precalentado.
  10. Mida el peso húmedo de los organoides en el día 0 y el día 14 utilizando una báscula de precisión.
    1. Coloque un plato vacío de 10 cm en la báscula y tara el peso a cero para asegurarse de que solo se mida el peso de los organoides. Retire completamente el medio de cultivo del plato de 10 cm y mida el peso húmedo del organoide uno por uno.
      NOTA: En este estudio, en el día 0, se pesaron tres organoides por donante, y en el día 14, dos organoides por donante.
  11. De acuerdo con los propósitos del estudio, implementar algunos de los organoides NHDF en análisis histológicos posteriores o congelarlos inmediatamente en nitrógeno líquido utilizando tubos estériles sin ADN/ARN para el posterior aislamiento de ADN, ARN y proteínas y luego almacenarlos a -80 °C.
  12. Para la investigación histológica, fije cada organoide en 5 mL de paraformaldehído al 4% preenfriado (4 °C) en PBS (ajustado a pH neutro) durante 45 min en hielo, seguido de lavado con PBS en RT (2 x 5 min cada uno).
  13. Crioproteja los organoides fijados utilizando un gradiente de sacarosa colocando los organoides en frascos de vidrio para su histología. Incubar los organoides en sacarosa al 10% en solución de PBS durante 2 h a 4 °C, después de sacarosa al 20%/PBS durante 2 h a 4 °C y, por último, incubación nocturna al 30% de sacarosa/PBS a 4 °C. Cambie las soluciones de sacarosa pipeteando primero y luego llenándolas con la nueva solución.
  14. Incrustar los organoides en crio-medio.
    1. Coloque una placa de cobre sobre hielo seco en una caja de espuma de poliestireno y enfríe durante 10 minutos.
    2. A continuación, coloque un criomolde de plástico, precargado con criomedio, sobre la placa de cobre y presione suavemente el organoide contra el fondo del criomold con unas pinzas. Espere hasta que el criomedio esté completamente congelado.
    3. Para organoides largos, primero córtelo por la mitad con un bisturí y coloque las dos mitades paralelas entre sí en el criomolde. Repita el procedimiento para cada organoide que se vaya a someter a un análisis histológico.
  15. Almacene las muestras a -20 °C hasta la criosección.
  16. Utilizando un criótomo, corte los organoides longitudinalmente en secciones de 10 μm de espesor y someta a tinción histológica como hematoxilina y eosina (H&E) utilizando el protocolo estándar8.

Resultados

El modelo de organoide T/L 3D se estableció previamente y se demostró aquí mediante la implementación de NHDF comprado comercialmente (n = 3, se utilizaron 3 organoides por donante, se utilizaron NHDF en los pasajes 5-8). El flujo de trabajo del modelo se resume en la Figura 1. La Figura 2 muestra imágenes representativas de contraste de fase del cultivo de NHDF durante la preexpansión en matraces T-75 (Figura 2A), así como a...

Discusión

Los resultados demostrados en este estudio proporcionan información valiosa sobre el establecimiento y la caracterización del modelo de organoide NHDF 3D para el estudio de los tejidos T/L. El protocolo de 3 pasos condujo a la formación de organoides en forma de bastón en 3D que exhiben características típicas del nicho T/L. Este modelo se informó anteriormente en Kroner-Weigl et al. 20237 y se demostró con gran detalle aquí.

Las imágenes de contraste...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

D.D. y S.M.-D. reconocer la subvención del BMBF "CellWiTaL: Sistemas celulares reproducibles para la investigación de fármacos - impresión láser sin capas de transferencia de células individuales altamente específicas en estructuras celulares tridimensionales" Propuesta Nr. 13N15874. D.D. y V.R.A. reconocen la subvención EU MSCA-COFUND OSTASKILLS "Formación holística de las investigaciones sobre la osteoartritis de próxima generación" GA Nr. 101034412. Todos los autores agradecen a la Sra. Beate Geyer por su asistencia técnica.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acid  Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany  A8960
10 cm adherent cell culture dishSigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430167
10 cm non-adherent petri dish Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430591
Cryo-mediumTissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands  4583
Cryomold standard Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands4557
D(+)-Sucrose AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, GermanyA2211
DMEM high glucose medium Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany DMEM-HA
DMEM low glucoseCapricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  DMEM-LPXA
Fetal bovine serum Anprotec, Bruckberg, Germany AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2 PromoCell, Heidelberg, Germany  C-23020
Inverted microscope with high resolution cameraZeissNAZeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  NEAA-B
Metal pins EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic 04.31
Normal human dermal fibroblasts  PromoCell, Heidelberg, Germany C-12302
Paraformaldehyde AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany A3813
Penicillin/streptomycin Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany15140122
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P4417
TGFß3 R&D Systems, Wiesbaden, Germany  8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  TRY-1B

Referencias

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