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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, dimostriamo un modello di organoide in tre fasi (espansione bidimensionale [2D], stimolazione 2D, maturazione tridimensionale [3D]) che offre uno strumento promettente per la ricerca fondamentale sui tendini e un potenziale metodo senza scaffold per l'ingegneria tissutale tendinea.

Abstract

Tendini e legamenti (T/L) sono strutture forti organizzate gerarchicamente che uniscono il sistema muscolo-scheletrico. Questi tessuti hanno una matrice extracellulare ricca di collagene (ECM) di tipo I e cellule del lignaggio T/L posizionate principalmente in file parallele. Dopo l'infortunio, T/L richiede molto tempo per la riabilitazione con un alto rischio di fallimento e risultati di riparazione spesso insoddisfacenti. Nonostante i recenti progressi nella ricerca biologica sul T/L, una delle sfide rimanenti è che il campo T/L manca ancora di un protocollo di differenziazione standardizzato in grado di ricapitolare il processo di formazione del T/L in vitro. Ad esempio, la differenziazione ossea e grassa delle cellule precursori mesenchimali richiede solo una coltura cellulare bidimensionale (2D) standard e l'aggiunta di specifici mezzi di stimolazione. Per la differenziazione in cartilagine, è necessaria la coltura tridimensionale (3D) in pellet e l'integrazione di TGFß. Tuttavia, la differenziazione cellulare al tendine necessita di un modello di coltura 3D molto ordinato, che idealmente dovrebbe essere anche soggetto a stimolazione meccanica dinamica. Abbiamo stabilito un modello di organoide in 3 fasi (espansione, stimolazione e maturazione) per formare una struttura 3D simile a un bastoncino da un foglio cellulare autoassemblato, che fornisce un microambiente naturale con i propri fattori ECM, autocrini e paracrini. Questi organoidi a bastoncino hanno un'architettura cellulare multistrato all'interno di una ricca ECM e possono essere maneggiati abbastanza facilmente per l'esposizione a sollecitazioni meccaniche statiche. Qui, abbiamo dimostrato il protocollo in 3 fasi utilizzando fibroblasti dermici disponibili in commercio. Abbiamo potuto dimostrare che questo tipo di cellula forma organoidi robusti e abbondanti nella ECM. La procedura descritta può essere ulteriormente ottimizzata in termini di terreni di coltura e ottimizzata verso la stimolazione meccanica assiale dinamica. Allo stesso modo, le fonti cellulari alternative possono essere testate per il loro potenziale di formare organoidi T/L e quindi subire la differenziazione T/L. In sintesi, l'approccio consolidato degli organoidi T/L 3D può essere utilizzato come modello per la ricerca di base sui tendini e persino per l'ingegneria T/L senza scaffold.

Introduzione

Tendini e legamenti (T/L) sono componenti vitali del sistema muscolo-scheletrico che forniscono supporto e stabilità essenziali al corpo. Nonostante il loro ruolo critico, questi tessuti connettivi sono soggetti a degenerazione e lesioni, causando dolore e compromissione della mobilità1. Inoltre, il loro limitato apporto di sangue e la lenta capacità di guarigione possono portare a lesioni croniche, mentre fattori come l'invecchiamento, il movimento ripetitivo e la riabilitazione impropria aumentano ulteriormente il rischio di degenerazione e lesioni2. I trattamenti convenzionali, come il riposo, la terapia fisica e gli interventi chirurgici, non sono in grado di ripristinare completamente la struttura e la funzione T/L. Negli ultimi anni, i ricercatori si sono sforzati di comprendere meglio la natura intricata del T/L al fine di cercare trattamenti efficaci per i disturbi T/L 3,4,5. I T/L si distinguono per una struttura gerarchicamente organizzata, dominata dalla matrice extracellulare (ECM), composta principalmente da fibre di collagene di tipo I e proteoglicani, una caratteristica difficile da replicare in vitro6. I tradizionali modelli di coltura cellulare bidimensionale (2D) non riescono a catturare la caratteristica organizzazione tridimensionale (3D) dei tessuti T/L, limitando il loro potenziale traduzionale e ostacolando il progresso innovativo nel campo della rigenerazione T/L.

Recentemente, lo sviluppo di modelli 3D di organoidi ha offerto nuove possibilità per far progredire la ricerca di base e l'ingegneria tissutale senza scaffold di vari tipi di tessuto 7,8,9,10,11,12,13. Ad esempio, per studiare la giunzione miotendinea, Larkin et al. 2006 hanno sviluppato costrutti muscolari scheletrici 3D insieme a segmenti tendinei auto-organizzati derivati dal tendine della coda di ratto10. Inoltre, Schiele et al. 2013, utilizzando canali di crescita rivestiti di fibronectina microlavorati, ha diretto l'autoassemblaggio dei fibroblasti dermici umani per formare fibre cellulari senza l'assistenza di scaffold 3D, un approccio che può catturare i tratti chiave dello sviluppo del tendine embrionale11. Nello studio di Florida et al. 2016, le cellule stromali del midollo osseo sono state prima espanse in linee ossee e legamentose, successivamente utilizzate per generare fogli cellulari monostrato autoassemblati, che sono stati poi implementati per creare un costrutto osseo-legamento-osso multifasico che imita il legamento crociato anteriore nativo, un modello che mira a migliorare la comprensione della rigenerazione dei legamenti12. Per chiarire i processi di meccanotrasduzione tendinea, Mubyana et al. 2018 hanno utilizzato una metodologia senza scaffold mediante la quale sono state create singole fibre tendinee e sottoposte al protocollo di carico meccanico13. Gli organoidi sono strutture 3D auto-organizzate che imitano l'architettura nativa, il microambiente e la funzionalità dei tessuti. Le colture di organoidi 3D forniscono un modello fisiologicamente più rilevante per lo studio della biologia dei tessuti e degli organi, nonché della fisiopatologia. Tali modelli possono anche essere utilizzati per indurre la differenziazione tessuto-specifica di diversi tipi di cellule staminali/progenitrici14,15. Pertanto, l'implementazione di modelli 3D di organoidi nel campo della biologia T/L e dell'ingegneria tissutale diventa un approccio molto interessante 9,16. Fonti cellulari alternative possono essere implementate per l'assemblaggio degli organoidi e stimolate verso la differenziazione tenogenica. Un tipo di cellula rilevante utilizzato per la dimostrazione in questo studio sono i fibroblasti dermici 7,17,18. Queste cellule sono facilmente accessibili attraverso una procedura di biopsia cutanea, che è meno invasiva rispetto alla puntura del midollo osseo o alla liposuzione e può essere moltiplicata abbastanza rapidamente in grandi numeri grazie alla loro buona capacità proliferativa. Al contrario, i tipi di cellule più specializzati, come i fibroblasti residenti in T/L, sono più difficili da isolare ed espandere. Pertanto, i fibroblasti dermici sono stati utilizzati anche come punto di partenza per le tecnologie di riprogrammazione cellulare verso cellule staminali embrionali pluripotenti indotte19. Sottoporre i fibroblasti dermici a specifiche condizioni di coltura 3D e segnali di segnalazione, come il fattore di crescita trasformante-beta 3 (TGFß3), che è stato riportato agire come regolatore chiave di vari processi cellulari, tra cui la formazione e il mantenimento di T/L, può potenziare la loro differenziazione tenogenica in vitro portando all'espressione di geni tendinei specifici e alla deposizione di ECM20 T/L-tipica, 21.

Qui, descriviamo e dimostriamo un protocollo di organoidi in 3 fasi (espansione 2D, stimolazione 2D e maturazione 3D) precedentemente stabilito e implementato utilizzando fibroblasti dermici umani adulti normali (NHDF) disponibili in commercio come fonte cellulare, offrendo un modello prezioso per lo studio della tenogenesi in vitro 7. Nonostante il fatto che questo modello non sia equivalente al tessuto T/L in vivo, fornisce comunque un sistema fisiologicamente più rilevante che può essere utilizzato per studiare i meccanismi di differenziazione cellulare, imitare la fisiopatologia T/L in vitro e stabilire piattaforme di medicina personalizzata T/L e screening farmacologico. Inoltre, in futuro, gli studi potranno valutare se gli organoidi 3D sono adatti per l'ingegneria T/L senza scaffold mediante un'ulteriore ottimizzazione e utilizzabili per lo sviluppo di costrutti meccanicamente robusti su larga scala che assomigliano molto alle dimensioni e alle proprietà strutturali e biofisiche dei tessuti T/L nativi.

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Protocollo

NOTA: Tutte le fasi devono essere eseguite utilizzando tecniche asettiche.

1. Coltura e pre-espansione dei NHDF

  1. Scongelare rapidamente la crio-fiala contenente fibroblasti dermici umani normali adulti crioconservati (NHDF, 1 x 106 cellule) a 37 °C fino a quando non si scongelano quasi.
  2. Aggiungere lentamente 1 mL di terreno di crescita dei fibroblasti preriscaldato 2 (kit pronto all'uso che include terreno basale, siero fetale di vitello al 2% (FCS), fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF) e insulina) integrato con penicillina/streptomicina all'1% (penna/streptococco) (terreno NHDF), preriscaldato a 37 °C alle cellule.
  3. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
  4. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 12 mL di terreno NHDF preriscaldato.
  5. Trasferire le cellule in un matraccio T-75 e agitare brevemente in senso trasversale. Collocare il matraccio T-75 a 37 °C in un'incubatrice umidificata al 5% di CO2 .
  6. Cambia il mezzo ogni 2 giorni. Osservare gli NHDF al microscopio fino a raggiungere la confluenza del 70% - 80%.

2. Espansione 2D

  1. Estrarre il pallone T-75 dell'incubatrice e rimuovere il mezzo NHDF. Lavare le cellule con soluzione salina tampone fosfato preriscaldata (PBS).
  2. Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA allo 0,05% alle cellule. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 fino a quando le cellule non si staccano dal matraccio (circa 3 minuti).
  3. Aggiungere 6 ml di terreno NHDF preriscaldato per neutralizzare l'azione della tripsina. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml.
  4. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a RT e rimuovere il surnatante.
  5. Risospendere il pellet cellulare in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) a basso contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 1x aminoacidi MEM, 1% penna/streptococco, preriscaldato a 37 °C.
  6. Piastra gli NHDF in una piastra di coltura cellulare aderente da 10 cm a una densità di 8 x 103 NHDF/cm2 (in totale, 4,4 x 105 NHDF per piastra da 10 cm). Oscilla delicatamente in modo trasversale.
  7. Posizionare la piastra di coltura cellulare da 10 cm a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 . Cambia il mezzo ogni 2 giorni
  8. Monitorare le cellule al microscopio fino a raggiungere la confluenza del 100% (ca. 5 giorni).

3. Stimolazione 2D

  1. Estrarre dall'incubatore le piastre per colture cellulari da 10 cm contenenti gli NHDF (dai passaggi 2.6 e 2.7). Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS preriscaldato.
  2. Aggiungere 10 mL di terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM integrato con il 10% di FBS, 50 μg/mL di acido ascorbico e l'1% di penna/streptococco, preriscaldato a 37 °C.
  3. Porre la capsula di Petri a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2 . Cambia il mezzo ogni 2 giorni.
  4. Monitorare gli NHDF al microscopio per 14 giorni.

4. 3D maturazione

  1. Estrarre la piastra di coltura cellulare da 10 cm dall'incubatore e rimuovere il terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM.
  2. Staccare delicatamente e rapidamente il foglio cellulare formato dal piatto con un raschietto cellulare. Durante il distacco, arrotolare contemporaneamente il foglio cellulare in un organoide 3D simile a un bastoncino.
  3. Prelevare e posizionare gli organoidi NHDF in una piastra di Petri non aderente (per cellule) di 10 cm. Questo tipo di piatto viene utilizzato per evitare l'emigrazione cellulare dall'organoide alla plastica.
  4. A questo punto o un giorno dopo (giorno 0 o giorno 1 di maturazione 3D), raccogliere alcuni degli organoidi per ulteriori analisi come il peso umido, la valutazione istologica (gli organoidi del giorno 1 sono preferibili in quanto diventano più compatti), l'isolamento dell'RNA e delle proteine.
  5. Fissare i bordi dell'organoide con perni metallici come segue:
    1. Tenere con cura un lato dell'organoide con una pinzetta e con un'altra pinzetta applicare delicatamente uno stiramento manuale di circa il 10% di allungamento assiale. Per stimare l'allungamento assiale del 10%, utilizzare carta millimetrata o righello.
    2. Quindi, prendi uno spillo di metallo con la pinzetta e premi manualmente attraverso il bordo dell'organoide nel piatto di plastica per fissarlo. Ripetere questa procedura con il secondo perno sul secondo bordo dell'organoide.
  6. Aggiungere 10 ml di terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM integrato con il 10% di FBS, 1x aminoacidi MEM, 50 μg/mL di acido ascorbico, 10 ng/mL di TGFß3 e l'1% di penna/streptococco, preriscaldato a 37 °C.
  7. Posizionare la pirofila da 10 cm a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2 . Cambia il mezzo ogni 2 giorni.
  8. Monitorare regolarmente gli organoidi per 14 giorni.
    NOTA: i perni potrebbero allentarsi, quindi rifissarli utilizzando la stessa tecnica descritta nel passaggio 4.5.
  9. Dopo 14 giorni, rimuovere il mezzo ad alto contenuto di glucosio DMEM dagli organoidi. Lavare gli organoidi con PBS preriscaldato.
  10. Misurare gli organoidi per il peso umido al giorno 0 e al giorno 14 utilizzando una bilancia di precisione.
    1. Posizionare un piatto vuoto di 10 cm sulla bilancia e tarare il peso a zero per assicurarsi che venga misurato solo il peso degli organoidi. Rimuovere completamente il terreno di coltura dal piatto da 10 cm e misurare il peso umido dell'organoide uno per uno.
      NOTA: In questo studio, al giorno 0, sono stati pesati tre organoidi per donatore e al giorno 14 due organoidi per donatore.
  11. Secondo gli scopi dello studio, implementare alcuni degli organoidi NHDF in ulteriori analisi istologiche o congelarli immediatamente in azoto liquido utilizzando provette sterili prive di DNA/RNA per il successivo isolamento di DNA, RNA e proteine e quindi conservarle a -80 °C.
  12. Per l'indagine istologica, fissare ciascun organoide in 5 mL di paraformaldeide al 4% preraffreddata (4 °C) in PBS (regolata a pH neutro) per 45 minuti su ghiaccio, seguita da un lavaggio PBS a RT (2 x 5 min ciascuno).
  13. Crioproteggere gli organoidi fissati utilizzando un gradiente di saccarosio mettendo gli organoidi in barattoli di vetro per l'istologia. Incubare gli organoidi in saccarosio al 10% in soluzione di PBS per 2 ore a 4 °C, successivamente saccarosio al 20%/PBS per 2 ore a 4 °C e infine incubazione notturna al 30% di saccarosio/PBS a 4 °C. Modificare le soluzioni di saccarosio prima pipettando e poi riempiendo con la nuova soluzione.
  14. Incorporare gli organoidi nel crio-mezzo.
    1. Metti una piastra di rame sul ghiaccio secco in una scatola di polistirolo e lascia raffreddare per 10 minuti.
    2. Quindi, posizionare un criostampo di plastica, preriempito con crio-mezzo, sulla piastra di rame e premere delicatamente l'organoide sul fondo del criomedio usando una pinzetta. Attendere che il criomezzo sia completamente congelato.
    3. Per gli organoidi lunghi, prima tagliare a metà con un bisturi e mettere le due metà parallele tra loro nel criostampo. Ripetere la procedura per ciascun organoide destinato ad essere sottoposto ad analisi istologica.
  15. Conservare i campioni a -20 °C fino alla criosezione.
  16. Utilizzando un criotomo, tagliare longitudinalmente gli organoidi in sezioni spesse 10 μm e sottoporli a colorazione istologica come ematossilina ed eosina (H&E) utilizzando il protocollo standard8.

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Risultati

Il modello di organoide 3D T/L è stato precedentemente stabilito e dimostrato qui implementando NHDF acquistato commercialmente (n=3, 3 organoidi per donatore, NHDF sono stati utilizzati nei passaggi 5-8). Il flusso di lavoro del modello è riepilogato nella Figura 1. La Figura 2 mostra immagini rappresentative a contrasto di fase della coltura NHDF durante la pre-espansione in fiasche T-75 (Figura 2A) e all'inizio e dopo 5 giorni ...

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Discussione

I risultati dimostrati in questo studio forniscono preziose informazioni sulla creazione e la caratterizzazione del modello di organoide 3D NHDF per lo studio dei tessuti T/L. Il protocollo in 3 fasi ha portato alla formazione di organoidi 3D simili a bastoncelli che presentano caratteristiche tipiche della nicchia T/L. Questo modello è stato precedentemente riportato in Kroner-Weigl et al. 20237 e dimostrato in modo molto dettagliato qui.

Le immagini a contra...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Riconoscimenti

D.D. e S.M.-D. riconoscere la sovvenzione BMBF "CellWiTaL: sistemi cellulari riproducibili per la ricerca farmacologica - stampa laser senza strato di trasferimento di singole cellule altamente specifiche in strutture cellulari tridimensionali" Proposta n. 13N15874. D.D. e V.R.A. riconoscono la sovvenzione EU MSCA-COFUND OSTASKILLS "Formazione olistica delle ricerche sull'osteoartrite di nuova generazione" GA Nr. 101034412. Tutti gli autori ringraziano la signora Beate Geyer per l'assistenza tecnica.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acid  Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany  A8960
10 cm adherent cell culture dishSigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430167
10 cm non-adherent petri dish Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430591
Cryo-mediumTissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands  4583
Cryomold standard Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands4557
D(+)-Sucrose AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, GermanyA2211
DMEM high glucose medium Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany DMEM-HA
DMEM low glucoseCapricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  DMEM-LPXA
Fetal bovine serumAnprotec, Bruckberg, Germany AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2 PromoCell, Heidelberg, Germany  C-23020
H&E staining kitAbcamab245880
Inverted microscope with high resolution cameraZeissNAZeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  NEAA-B
Metal pins EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic 04.31
Normal human dermal fibroblasts PromoCell, Heidelberg, Germany C-12302
ParaformaldehydeAppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany A3813
Penicillin/streptomycin Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany15140122
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P4417
TGFß3 R&D Systems, Wiesbaden, Germany  8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  TRY-1B

Riferimenti

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