Demonstração de Cultura de Folha de Células Auto-Montadas e Geração Manual de um Organoide 3D Semelhante a Tendão/Ligamento usando Fibroblastos Dérmicos Humanos

Resumo

Aqui, demonstramos um modelo organoide de três etapas (expansão bidimensional [2D], estimulação 2D, maturação tridimensional [3D]) oferecendo uma ferramenta promissora para pesquisa fundamental de tendões e um potencial método livre de andaimes para engenharia de tecidos tendinosos.

Resumo

Tendões e ligamentos (T/L) são estruturas fortes e hierarquicamente organizadas que unem o sistema musculoesquelético. Esses tecidos têm uma matriz extracelular (MEC) rica em colágeno tipo I estritamente disposta e células da linhagem T/L posicionadas principalmente em fileiras paralelas. Após a lesão, o T/L requer muito tempo para reabilitação com alto risco de falha e resultados de reparo muitas vezes insatisfatórios. Apesar dos recentes avanços na pesquisa em biologia T/L, um dos desafios remanescentes é que o campo T/L ainda carece de um protocolo de diferenciação padronizado que seja capaz de recapitular o processo de formação T/L in vitro. Por exemplo, a diferenciação óssea e gordurosa de células precursoras mesenquimais requer apenas cultura de células bidimensionais (2D) padrão e a adição de meios de estimulação específicos. Para diferenciação em cartilagem, é necessária cultura tridimensional (3D) de pellets e suplementação de TGFß. No entanto, a diferenciação celular para o tendão precisa de um modelo de cultura 3D muito ordenado, que idealmente também deve ser submetido a estimulação mecânica dinâmica. Estabelecemos um modelo organoide de 3 etapas (expansão, estimulação e maturação) para formar uma estrutura 3D semelhante a uma haste a partir de uma folha de células automontada, que fornece um microambiente natural com seus próprios fatores ECM, autócrinos e parácrinos. Esses organoides em forma de bastonete têm uma arquitetura celular de várias camadas dentro de um ECM rico e podem ser manuseados com bastante facilidade para exposição a tensão mecânica estática. Aqui, demonstramos o protocolo de 3 etapas usando fibroblastos dérmicos disponíveis comercialmente. Pudemos mostrar que esse tipo de célula forma organoides robustos e abundantes em MEC. O procedimento descrito pode ser ainda mais otimizado em termos de meios de cultura e otimizado para estimulação mecânica axial dinâmica. Da mesma forma, fontes celulares alternativas podem ser testadas quanto ao seu potencial para formar organoides T/L e, assim, sofrer diferenciação T/L. Em suma, a abordagem organoide 3D T/L estabelecida pode ser usada como modelo para pesquisa básica de tendões e até mesmo para engenharia T/L sem andaimes.

Introdução

Tendões e ligamentos (T/L) são componentes vitais do sistema músculo-esquelético que fornecem suporte e estabilidade essenciais ao corpo. Apesar de seu papel crítico, esses tecidos conjuntivos são propensos à degeneração e lesão, causando dor e comprometimento da mobilidade¹. Além disso, seu suprimento sanguíneo limitado e capacidade de cicatrização lenta podem levar a lesões crônicas, enquanto fatores como envelhecimento, movimentos repetitivos e reabilitação inadequada aumentam ainda mais o risco de degeneração e lesões². Os tratamentos convencionais, como repouso, fisioterapia e intervenções cirúrgicas, são incapazes de restaurar totalmente a estrutura e a função T/L. Nos últimos anos, os pesquisadores têm se esforçado para entender melhor a natureza intrincada da T/L, a fim de buscar tratamentos eficazes para os distúrbios T/L ^3,4,5. Os T/L distinguem-se por uma estrutura hierarquicamente organizada, dominada pela matriz extracelular (MEC), composta principalmente por fibras colágenas do tipo I e proteoglicanos, característica difícil de ser replicada in vitro⁶. Os modelos tradicionais de cultura de células bidimensionais (2D) não conseguem capturar a organização tridimensional (3D) característica dos tecidos T/L, limitando seu potencial translacional, bem como dificultando o progresso inovador no campo da regeneração T/L.

Recentemente, o desenvolvimento de modelos organoides 3D ofereceu novas possibilidades para o avanço da pesquisa básica e da engenharia de tecidos livres de andaimes de vários tipos de tecidos 7,8,9,10,11,12,13. Por exemplo, para investigar a junção miotendínea, Larkin et al. 2006 desenvolveram construções musculares esqueléticas 3D junto com segmentos tendinosos auto-organizados derivados do tendão da cauda de rato¹⁰. Além disso, Schiele et al. 2013, usando canais de crescimento revestidos de fibronectina microusinados, direcionaram a automontagem de fibroblastos dérmicos humanos para formar fibras celulares sem a ajuda de andaimes 3D, uma abordagem que pode capturar características-chave do desenvolvimento do tendão embrionário¹¹. No estudo de Florida et al. 2016, as células estromais da medula óssea foram primeiro expandidas em linhagens ósseas e ligamentares, em seguida usadas para gerar folhas de células de monocamada automontadas, que foram então implementadas para criar uma construção óssea-ligamento-osso multifásica imitando o ligamento cruzado anterior nativo, um modelo que visa melhorar a compreensão da regeneração ligamentar¹². Para elucidar os processos de mecanotransdução do tendão, Mubyana et al. 2018 utilizaram uma metodologia sem andaimes pela qual fibras de tendão único foram criadas e submetidas ao protocolo de carregamento mecânico¹³. Organoides são estruturas 3D auto-organizadas que imitam a arquitetura nativa, o microambiente e a funcionalidade dos tecidos. As culturas organoides 3D fornecem um modelo fisiologicamente mais relevante para o estudo da biologia de tecidos e órgãos, bem como da fisiopatologia. Tais modelos também podem ser usados para induzir a diferenciação específica do tecido de diferentes tipos de células-tronco / progenitoras^14,15. Assim, a implementação de modelos organoides 3D no campo da biologia T/L e engenharia de tecidos torna-se uma abordagem muito atraente ^9,16. Fontes celulares alternativas podem ser implementadas para a montagem do organoide e estimuladas para a diferenciação tenogênica. Um tipo de célula relevante usado para demonstração neste estudo são os fibroblastos dérmicos ^7,17,18. Essas células são facilmente acessíveis por meio de um procedimento de biópsia de pele, que é menos invasivo em comparação com a punção da medula óssea ou lipoaspiração e pode ser multiplicado rapidamente para grandes números devido à sua boa capacidade proliferativa. Em contraste, tipos de células mais especializadas, como fibroblastos residentes em T / L, são mais difíceis de isolar e expandir. Portanto, os fibroblastos dérmicos também foram usados como ponto de partida para tecnologias de reprogramação celular para células-tronco embrionárias pluripotentes induzidas¹⁹. A sujeição de fibroblastos dérmicos a condições específicas de cultura 3D e pistas de sinalização, como o fator de crescimento transformador beta 3 (TGFß3), que tem sido relatado como um regulador chave de vários processos celulares, incluindo a formação e manutenção de T/L, pode potencializar sua diferenciação tenogênica in vitro levando à expressão de genes específicos do tendão e à deposição de ECM T/L típica^{20, 21}.

Aqui, descrevemos e demonstramos um protocolo organoide de 3 etapas (expansão 2D, estimulação 2D e maturação 3D) previamente estabelecido e implementado usando fibroblastos dérmicos humanos adultos normais (NHDFs) disponíveis comercialmente como fonte celular, oferecendo um modelo valioso para estudar a tenogênese in vitro ⁷. Apesar do fato de que este modelo não é equivalente ao tecido T / L in vivo, ele ainda fornece um sistema mais fisiologicamente relevante que pode ser usado para investigar mecanismos de diferenciação celular, imitando a fisiopatologia T / L in vitro e estabelecendo medicina personalizada T / L e plataformas de triagem de drogas. Além disso, no futuro, os estudos podem avaliar se os organoides 3D são adequados para a engenharia de T/L sem andaimes, otimizando ainda mais, bem como utilizáveis para o desenvolvimento de construções mecanicamente robustas em escala que se assemelham às dimensões e propriedades estruturais e biofísicas dos tecidos T/L nativos.

Protocolo

NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas por meio de técnicas assépticas.

1. Cultura e pré-expansão dos NHDFs

1. Descongelar rapidamente o frasco criogênico contendo fibroblastos dérmicos humanos normais criopreservados adultos (NHDFs, 1 x 10⁶ células) a 37 ° C até que estejam quase descongelando.
2. Adicione lentamente 1 mL de meio de crescimento de fibroblastos pré-aquecido 2 (kit pronto para uso incluindo meio basal, soro fetal de bezerro a 2% (FCS), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) e insulina) suplementado com 1% de penicilina/estreptomicina (caneta/estreptococo) (meio NHDF), pré-aquecido a 37 °C para as células.
3. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue as células a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT).
4. Remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 12 mL de meio NHDF pré-aquecido.
5. Transferir as células para um balão T-75 e agitar brevemente de forma transversal. Colocar o balão T-75 a 37 °C numa incubadora humidificada com CO₂ a 5%.
6. Troque o meio a cada 2 dias. Observe os NHDFs ao microscópio até que atinjam 70% - 80% de confluência.

2. Expansão 2D

1. Retire o frasco T-75 da incubadora e remova o meio NHDF. Lave as células com solução salina tampão fosfato pré-aquecida (PBS).
2. Adicione 3 mL de tripsina-EDTA a 0,05% às células. Incubar as células a 37 °C numa incubadora humidificada com CO₂ a 5% até que as células se desprendam do frasco (aproximadamente 3 min).
3. Adicione 6 mL de meio NHDF pré-aquecido para neutralizar a ação da tripsina. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL.
4. Centrifugue as células a 300 x g durante 5 min a RT e retire o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet celular em meio de Eagles modificado (DMEM) de Dulbecco com baixa glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1x aminoácidos MEM, 1% de caneta/estreptococo, pré-aquecido a 37 °C.
6. Coloque os NHDFs em uma placa de cultura de células aderente de 10 cm a uma densidade de 8 x 10³ NHDFs/cm² (no total, 4,4 x 10⁵ NHDFs por placa de 10 cm). Balance suavemente de maneira transversal.
7. Coloque a placa de cultura de células de 10 cm a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ . Troque o meio a cada 2 dias
8. Monitore as células ao microscópio até atingir 100% de confluência (ca. 5 dias).

3. Estimulação 2D

1. Retire as placas de cultura de células de 10 cm contendo os NHDFs (das etapas 2.6 e 2.7) da incubadora. Remova o meio de cultura e lave as células com PBS pré-aquecido.
2. Adicione 10 mL de meio de alta glicose DMEM suplementado com 10% de FBS, 50 μg / mL de ácido ascórbico e 1% de caneta / estreptococos, pré-aquecido a 37 ° C.
3. Coloque a placa de Petri a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO₂ . Troque o meio a cada 2 dias.
4. Monitore os NHDFs sob um microscópio por 14 dias.

4. 3D maturação

1. Retirar a placa de cultura de células de 10 cm da incubadora e remover o meio de glicose alto DMEM.
2. Retire com cuidado e rapidez a folha de células formada do prato com um raspador de células. Ao desconectar, role simultaneamente a folha de célula em um organoide 3D semelhante a uma haste.
3. Pegue e coloque os organoides NHDF em uma placa de Petri não aderente (para células) de 10 cm. Este tipo de prato é usado para evitar a emigração celular do organoide para o plástico.
4. Neste momento ou um dia depois (dia 0 ou dia 1 de maturação 3D), colete alguns dos organoides para análises adicionais, como peso úmido, avaliação histológica (os organoides do dia 1 são preferíveis à medida que se tornam mais compactos), RNA e isolamento de proteínas.
5. Fixe as bordas do organoide com pinos de metal da seguinte maneira:
   1. Segure um lado do organoide cuidadosamente com uma pinça e, com outra pinça, aplique suavemente o alongamento manual de aproximadamente 10% de alongamento axial. Para estimar o alongamento axial de 10%, use um papel milimétrico ou régua.
   2. Em seguida, pegue um pino de metal com a pinça e pressione manualmente a borda organoide no prato de plástico para fixá-lo. Repita este procedimento com o segundo pino na segunda borda do organoide.
6. Adicione 10 mL de meio DMEM com alto teor de glicose suplementado com 10% de FBS, 1x aminoácidos MEM, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 ng/mL de TGFß3 e 1% de caneta/estreptococo, pré-aquecido a 37 °C.
7. Coloque o prato de 10 cm a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO₂ . Troque o meio a cada 2 dias.
8. Monitore os organoides regularmente por 14 dias.
   NOTA: Os pinos podem se soltar, portanto, refixe usando a mesma técnica descrita na etapa 4.5.
9. Após 14 dias, remova o meio de glicose alta DMEM dos organoides. Lave os organoides com PBS pré-aquecido.
10. Meça organoides para peso úmido no dia 0 e no dia 14 usando uma balança de precisão.
    1. Coloque um prato vazio de 10 cm na balança e tara o peso a zero para garantir que apenas o peso dos organoides seja medido. Retirar totalmente o meio de cultura da cápsula de 10 cm e medir o peso húmido organoide um a um.
       NOTA: Neste estudo, no dia 0, foram pesados três organoides por doador e, no dia 14, dois organoides por doador.
11. De acordo com os objetivos do estudo, implemente alguns dos organoides NHDF em análises histológicas adicionais ou congele-os imediatamente em nitrogênio líquido usando tubos estéreis livres de DNA/RNA para posterior isolamento de DNA, RNA e proteína e, em seguida, armazene-os a -80 °C.
12. Para investigação histológica, fixar cada organoide em 5 mL de paraformaldeído a 4% pré-resfriado (4 °C) em PBS (ajustado para pH neutro) por 45 min em gelo, seguido de lavagem com PBS em RT (2 x 5 min cada).
13. Crioproteja os organoides fixos usando um gradiente de sacarose, colocando os organoides em potes de vidro para histologia. Incubar os organoides em solução de sacarose a 10% em solução de PBS por 2 h a 4 ° C, após 20% de sacarose / PBS por 2 h a 4 ° C e, finalmente, 30% de sacarose / PBS durante a noite incubação a 4 ° C. Troque as soluções de sacarose pipetando primeiro e depois enchendo com a nova solução.
14. Incorpore os organoides em meio criogênico.
    1. Coloque uma placa de cobre sobre gelo seco em uma caixa de isopor e deixe esfriar por 10 min.
    2. Em seguida, coloque um criomolde de plástico, pré-preenchido com meio criogênico, na placa de cobre e pressione suavemente o organoide no fundo do criomoldor usando uma pinça. Aguarde até que o criomeio esteja totalmente congelado.
    3. Para organoides longos, primeiro corte ao meio com um bisturi e coloque as duas metades paralelas uma à outra no criomolde. Repita o procedimento para cada organoide destinado a ser submetido à análise histológica.
15. Armazenar as amostras a -20 °C até à criosecção.
16. Usando um criotomo, corte os organoides longitudinalmente em seções de 10 μm de espessura e submeta a coloração histológica, como hematoxilina e eosina (H & E), usando o protocolo padrão⁸.

Resultados

O modelo organoide 3D T/L foi previamente estabelecido e demonstrado aqui pela implementação de NHDF comprado comercialmente (n=3, 3 organoides por doador, NHDF foram usados nas passagens 5-8). O fluxo de trabalho do modelo está resumido na Figura 1. A Figura 2 mostra imagens representativas de contraste de fase da cultura de NHDF durante a pré-expansão em frascos T-75 (Figura 2A), bem como no início e após 5 dias de cultura ...

Discussão

Os resultados demonstrados neste estudo fornecem informações valiosas sobre o estabelecimento e caracterização do modelo organoide 3D NHDF para o estudo de tecidos T/L. O protocolo de 3 etapas levou à formação de organoides 3D semelhantes a bastonetes que exibem características típicas do nicho T / L. Este modelo foi relatado anteriormente em Kroner-Weigl et al. 2023⁷ e demonstrado em grande detalhe aqui.

As imagens de contraste de fase apresentadas na...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B